施小妹 余幼芬 陳艷琴 徐雪汝 劉榮國△

（1 福建省立醫(yī)院疼痛科，福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院，福州 350001； 2 廈門大學附屬婦女兒童醫(yī)院麻醉科，廈門 361003）

神經(jīng)病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 是源于軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損害或疾病所導致的疼痛，疼痛可持續(xù)存在或反復發(fā)作[1]，是亟待解決的重大醫(yī)學難題。目前認為，NP 發(fā)生發(fā)展的重要機制與外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)敏化有關(guān)。外周神經(jīng)損傷后，傷害性感受信息經(jīng)背根神經(jīng)節(jié) (dorsal root ganglion,DRG) 整合后傳入脊髓背角，激活脊髓背角小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，誘發(fā)中樞敏化，促進NP 的發(fā)生、發(fā)展，而抑制脊髓小膠質(zhì)細胞下游活性介質(zhì)的形成、釋放則能明顯減輕NP[2]。這些活性介質(zhì)主要包括細胞因子、趨化因子和脂質(zhì)介質(zhì)等[3]，根據(jù)功能可分為致炎及抗炎因子，致炎因子常見為腫 瘤 壞 死 因 子-α (tumor necrosis factor α, TNF-α)、IL-1β 和干擾素等，抗炎因子常見為白介素-10 (interleukin-10, IL-10)、IL-4 及腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白等[4,5]。鑒于脊髓背角內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)在促發(fā)中樞敏化中發(fā)揮重要作用，且研究已證實TNF-α 可誘導其他炎癥因子發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，參與NP 的形成與維持，而IL-10 可逆轉(zhuǎn)其作用，兩者交互作用以平衡神經(jīng)炎癥[6]。因此，本研究以脊髓背角內(nèi)的炎癥反應(yīng)為切入點，探討抑制脊髓背角內(nèi)的炎癥反應(yīng)而改善NP，具有重要的研究意義。

脈沖射頻 (pulsed radiofrequency, PRF) 是目前臨床治療NP 的一種非損傷或微損傷的神經(jīng)調(diào)控介入技術(shù)，可通過抑制膠質(zhì)細胞活化、突觸傳遞和炎癥因子的改變來實現(xiàn)治療目的[7]。雖然標準PRF 具有操作簡單，并發(fā)癥少，創(chuàng)傷小且即時治療效果突出等優(yōu)點，但是標準PRF 的遠期療效不穩(wěn)定，常需多次治療。近年來，許多學者針對更加有效的PRF模式進行探索，發(fā)現(xiàn)高電壓模式可提高PRF 的治療效果[8,9]。然而，PRF 的輸出電壓與療效之間的量效關(guān)系，尚缺乏隨機、對照的基礎(chǔ)試驗研究，高電壓PRF 鎮(zhèn)痛機制的相關(guān)基礎(chǔ)實驗鮮見。本實驗擬復制坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷 (spared nerve injury, SNI)大鼠模型，采用不同電壓PRF 大鼠DRG，通過觀察大鼠疼痛行為學改變和脊髓背角內(nèi)TNF-α 和IL-10的表達變化，研究不同電壓PRF 干預DRG 治療NP是否存在差異及其與TNF-α 和IL-10 的相關(guān)關(guān)系，為未來臨床推廣應(yīng)用高電壓PRF 治療NP 提供實驗依據(jù)。

方 法

1.實驗動物和分組

2.模型制備

（1）按照Decosterd 等[10]的方法制備大鼠SNI模型：大鼠全身麻醉后暴露左坐骨神經(jīng)主干分支，于分支處近端結(jié)扎其分支脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)，遠端剪斷，保留并避免損傷腓腸神經(jīng)，逐層縫合肌肉和皮膚。Sham 組僅暴露左后肢坐骨神經(jīng)后游離其分支脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)近分叉段。

（2）大鼠DRG 的PRF 治療，于神經(jīng)損傷后第7 d 進行。大鼠全身麻醉后暴露左L5DRG 后，將射頻儀（COSMAN RF-G4，美國）的負極板貼于大鼠足底，射頻治療套管針（長度10 cm，裸露端5 mm）置于DRG 上，取出針芯，插入電極（見圖1）。設(shè)定治療模式：溫度42℃，脈率2 Hz，脈寬20 ms，持續(xù)時間2 min ×3 循環(huán)，電壓分別為45 V、65 V、85 V、100 V。SPRF 組：制模后第 7 d，僅在左L5DRG 放置射頻電極，無PRF 治療。

圖1 SNI 大鼠DRG 的PRF 治療Fig. 1 Pulsed radiofrequency of dorsal root ganglion of SNI rats

3. 疼痛行為學觀察和測量

在制模前測量各組大鼠基礎(chǔ)閾值，制模后 1 d、3 d、5 d、7 d，PRF 后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d 實施行為學測定和機械刺激縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT) 測量。所有測定均在固定時間 (8:00～12:00, am) 和安靜環(huán)境下進行。

運動功能：觀察所有SD 大鼠自然狀態(tài)下隨意行走的步態(tài)，采用記分制：1 分：正常步態(tài)、足無畸形；2 分：正常步態(tài)伴明顯足畸形；3 分：輕度步態(tài)障礙伴足下垂；4 分：嚴重步態(tài)障礙伴肌無力。將評分 4 分的大鼠剔除。

MWT 測量：以Dixon 等[11]up and down 法測定 MWT，將有機玻璃箱置于金屬篩網(wǎng)上，大鼠適應(yīng)10 min 后，以vonFrey 針絲（Stoeling 公司，美國）垂直刺激大鼠術(shù)側(cè)后足掌部，避開爪墊，持續(xù)時間≤4 s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。測定從2 g 開始，當該力度刺激不能引起陽性反應(yīng)，則給予相鄰大一級力度刺激；如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級力度刺激，如此連續(xù)進行，直至出現(xiàn)第1 次陽性和陰性反應(yīng)，再連續(xù)測定 4 次，取平均值為閾值。最大力度為15 g，大于此值時記為 15 g。每次刺激間隔30 s，每次測量時使尼龍絲彎曲到相同的弧度，以確保每次施加的刺激相同。

4. 脊髓背角內(nèi)TNF-α 和IL-10 的表達

制模后第14 d、21 d 每組處死大鼠各5 只，采用免疫熒光和Western blot 檢測脊髓背角內(nèi)TNF-α和IL-10 表達水平。

（1）免疫熒光法：大鼠腹腔麻醉，開胸經(jīng)心臟灌注 4% 多聚甲醛。分離脊髓并取出 L4-6脊髓背角，并用刀片在非手術(shù)側(cè)劃一缺口作為標記，固定12 h后，樣本置于石蠟中包埋，切片，片厚 5 μm。采用等距隨機抽樣法，抽取5張用于免疫熒光染色。脫蠟，EDTA 抗原修復緩沖液(pH 8.0)微波修復 15 min，冷卻至室溫，依次加入3%血清工作液封閉 30 min后，甩掉封閉液，直接加入一抗：兔抗鼠 IL-10 抗體（ab9969，abcam，英國），兔抗鼠 TNF-α 抗體（ab6671，abcam，英國），4℃孵育過夜，滴加羊抗兔二抗 IgG （武漢賽維爾生物科技有限公司，中國），覆蓋組織，避光室溫孵育50 min，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗 3 次，滴加DAPI 染液，避光室溫孵育10 min，加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min，抗熒光淬滅封片劑封片，光學顯微鏡（Nikon，日本）觀察。使用Image J 軟件（National Institutes of Health 公司，美國）分析免疫熒光強度。

（2）蛋白質(zhì)免疫印跡法：大鼠腹腔麻醉后，迅速取 L4-6節(jié)段脊髓背角，置于液氮中保存待測。測試時，取出脊髓組織放入勻漿器，加入 RIPA 蛋白裂解液1.0 m1，冰上機械勻漿裂解30 min 后4℃、12,000 rpm 離心10 min，小心吸取上清，采用 BCA 法測定蛋白樣品濃度，上樣緩沖液稀釋蛋白樣品后沸水浴變性15 min，等量蛋白樣品經(jīng) 10%SDS PAGE 凝膠電泳分離后，蛋白以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉 1 h，IL-10 抗體（ab9969，abcam，英國）、β-actin 抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，中國）、TNF-α 抗體 （ab6671，abcam，英國）孵育，4℃輕搖過夜，加入辣根氧化物酶標記物的羊抗兔 IgG（1:3000，武漢賽維爾生物科技有限公司，中國），室溫孵育30 min，按照發(fā)光試劑盒（Thermo 公司，美國）的說明進行放射自顯影，使用Image J 軟件（National Institutes of Health 公司，美國）分析條帶光密度值，以目的蛋白條帶光密度值與相應(yīng)β-actin 條帶光密度值的比值反映蛋白表達水平。

科技企業(yè)要加大自主研發(fā)投入，加快融入全球研發(fā)創(chuàng)新體系，增強整合創(chuàng)新資源能力，加快提升自主創(chuàng)新能力和核心競爭力，在相關(guān)領(lǐng)域積極搶占主導地位，建立領(lǐng)跑優(yōu)勢。各地要圍繞強化企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新主體地位，推動創(chuàng)新政策、創(chuàng)新資源、創(chuàng)新人才、創(chuàng)新服務(wù)向企業(yè)集聚，大力培育創(chuàng)新型領(lǐng)軍企業(yè)和高新技術(shù)企業(yè)，重點培育一批瞪羚企業(yè)、獨角獸企業(yè)、平臺型企業(yè)，形成更具規(guī)模的創(chuàng)新型企業(yè)集群。

5. 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行分析，符合正態(tài)計量資料以均數(shù)±標準差(±SD)表示，MWT采用雙因素重復測量方差分析 (two-way repeated measures ANOVA)，并進行組間各時間點的比較。TNF-α 和IL-10 的表達量采用單因素方差分析 (oneway ANOVA)，組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.疼痛行為學觀察

（1）一般行為學觀察：除Sham 組外，其余6組大鼠在SNI 后術(shù)側(cè)足趾并攏輕度外翻，下肢行走無力，評分均為 2 分。術(shù)側(cè)后爪偶然接觸籠面會發(fā)生明顯的縮足反應(yīng)。術(shù)前各組大鼠之間體重無明顯差異，術(shù)后各組大鼠體重正常增長，差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05，見圖2）。

圖2 各組SNI 大鼠PRF 前后的體重變化(n = 20,±SD)Fig. 2 Weight changes of SNI rats before and after PRF (n = 20,±SD)

（2）MWT：除了Sham 組，其余6 組大鼠于SNI 后第 1 d 即出現(xiàn) MWT 下降，與Sham 組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。SNI 組與SPRF組各同時間點MWT 比較，差異無統(tǒng)計學意義。與SNI 組比較，4 個PRF 組在PRF 后各時間點的MWT 均升高(P＜0.05)，但仍低于Sham 組(P＜0.05)。45VPRF 組與100VPRF 組比較，MWT 差異無統(tǒng)計學意義。與45VPRF 組比較，65VPRF 組在SNI 第8 d 后各時間點的MWT 升高(P＜0.05)，但顯著低于85VPRF 組（P＜0.05，見圖3）。

圖3 不同電壓PRF 大鼠SNI 模型DRG 對術(shù)側(cè)MWT的影響(n = 20,±SD)Fig. 3 Eあects of diあerent voltage PRF of DRG on the MWT of left foot in rats with SNI (n = 20,±SD)

2.免疫熒光法檢測脊髓背角內(nèi)TNF-α 和IL-10的表達

與Sham 組比較，其余6 組大鼠在SNI 后14 d和21 d TNF-α 的表達均明顯增強，而IL-10 的表達均明顯減弱(P＜0.05)。SNI 組與SPRF 組的TNF-α、IL-10 表達水平在SNI 后14 d、21 d（即PRF 后第7 d、14 d）差異均無統(tǒng)計學意義。在SNI 后14 d、21 d，與SNI 組比較，4 個PRF 組TNF-α 表達均明顯減弱(P＜0.05)，而IL-10 的表達均明顯增強(P＜0.05)。在SNI 后14 d、21 d，45VPRF 組與100VPRF 組TNF-α、IL-10 的表達比較，差異無統(tǒng)計學意義。在SNI 后14 d、21 d，與45VPRF 組比較，65VPRF 組TNF-α 的表達減弱，而IL-10 的表達增強(P＜0.05)。85VPRF 組和65VPRF 組在SNI 后14 d IL-10 的表達比較，差異無統(tǒng)計學意義。在SNI 后14 d、21 d，與另外3 個PRF 組比較，85VPRF 組TNF-α 的表達最弱，在SNI 后21 d，85VPRF 的IL-10 的表達增強最顯著（P＜0.05，見圖4、5）。

圖4 免疫熒光法檢測各組大鼠脊髓背角中 TNF-α 和IL-10 的表達Fig.4 Expression levels of the TNF-α and the IL-10 in spinal cord horn among diあerent groups by immunofluorescence analysis

3.蛋白質(zhì)免疫印跡法測定脊髓背角內(nèi)TNF-α 和IL-10 的表達

圖5 不同電壓PRF 大鼠第14 d 和21 d 的脊髓背角內(nèi)TNF-α 和IL-10 的表達比較(n = 5,±SD)Fig.5 Expression levels of TNF-α and IL-10 in the spinal dorsal horn of rats in diあerent groups on day 14 and day 21 after SNI (n = 5,±SD)

與Sham 組比較，其余6 組大鼠在SNI 后第14 d和21 d TNF-α 的表達均明顯增高，IL-10 的表達均明顯減弱(P＜0.05)。SNI 組與SPRF 組的TNF-α、IL-10 表達水平差異均無統(tǒng)計學意義。與SNI 組比較，4 個PRF 組 在SNI 后14 d、21 d TNF-α 表 達均明顯減弱，IL-10 的表達均明顯增強(P＜0.05)。在SNI 后14 d、21 d ，45VPRF 組與100VPRF 組的TNF-α 和IL-10 的表達比較，差異無統(tǒng)計學意義。在術(shù)后21 d，與45VPRF 組比較，65VPRF 組TNF-α的表達減弱，IL-10 的表達增強(P＜0.05)。在SNI后14 d，85VPRF 組和65VPRF 組IL-10 的表達比較，差異無統(tǒng)計學意義。在SNI 后14 d、21 d，與另外3 個PRF 組比較，85VPRF 組TNF-α 的表達均最弱；在SNI 后21 d，85VPRF 組的 IL-10 的表達最顯著（P＜0.05，見圖6）。

圖6 Western blot 法檢測各組大鼠脊髓背角內(nèi)TNF-α 和IL-10 蛋白表達(n = 5,±SD)Fig.6 Expression levels of the TNF-α and the IL-10 in spinal dorsal horn among diあerent groups by Western blot (n = 5,±SD)

討 論

本研究復制大鼠SNI 模型，發(fā)現(xiàn)以DRG 為靶點實施不同電壓PRF 均能有效改善SNI 大鼠的MWT，下調(diào)脊髓背角內(nèi)TNF-α 和上調(diào)IL-10 的表達。與45VPRF 組 和100VPRF 組 比 較，65VPRF 組 和85VPRF 組的MWT 改善、TNF-α 表達下調(diào)和IL-10表達上調(diào)更為顯著，其中85VPRF 組最為顯著。本研究是首次報道有關(guān)高電壓PRF 大鼠DRG 通過調(diào)控脊髓背角內(nèi)TNF-α 和IL-10 的表達這一抗炎途徑發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，豐富了高電壓PRF 模式產(chǎn)生良好鎮(zhèn)痛療效的相關(guān)機制研究。

本研究選用的是SD 大鼠 SNI 模型，SNI 組坐骨神經(jīng)損傷后5～7 d 疼痛反應(yīng)達高峰并在隨后觀察時間內(nèi)維持穩(wěn)定，這與Hu 等[12]的研究結(jié)果一致。大鼠SNI 后第7 d 于DRG 實施 PRF 治療，PRF 后第1 天即開始出現(xiàn)MWT 的回升，至治療后14 d 內(nèi)仍保持穩(wěn)定，且接受不同電壓PRF 的4 組在SNI 第8 d 后各時間點的MWT 均有明顯上升，表明PRF 對NP 治療有效。45VPRF 組與100VPRF 組MWT 均有明顯上升，但兩組差異無統(tǒng)計學意義。與45VPRF 組和100VPRF 組比較，65VPRF 組、85VPRF組的MWT 上升程度更為顯著，其中85VPRF 組的MWT 上升最為顯著，說明高電壓65 V、85 V 的PRF 應(yīng)用于DRG 治療NP 的效果優(yōu)于45 V（標準電壓），高電壓PRF 能進一步提升療效。而繼續(xù)提高電壓至100 V時，對NP 的改善程度并沒有進一步擴大，相關(guān)機制需要進一步研究確認。

NP 發(fā)生發(fā)展的重要機制是外周敏化和中樞敏化[13]。DRG 在外周敏化過程中起重要作用，被認為是NP 的一個重要靶點[14,15]。PRF 干預DRG 能夠有效治愈NP 已經(jīng)被大量臨床及基礎(chǔ)實驗證實，故本研究的PRF 靶點選擇為DRG。脊髓是疼痛信息傳遞和整合的初級中樞，在中樞敏化中發(fā)揮重要作用，脊髓背角接受DRG 神經(jīng)沖動傳入，并將信息傳遞至上位中樞，現(xiàn)已證實當外周神經(jīng)損傷后，脊髓背角接收異常興奮的初級感覺神經(jīng)元信號，引起脊髓中小膠質(zhì)細胞活化進而釋放免疫炎性物質(zhì)，誘導形成NP[1,15]，即脊髓背角內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)在促發(fā)中樞敏化中發(fā)揮重要作用，因此本研究重點選擇觀察脊髓背角內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

TNF-α 作為重要致炎因子，通過調(diào)控上下游各通道、細胞因子等參與NP 的產(chǎn)生與維持[16]。本研究表明，不同高電壓的PRF 均能起到緩解NP 的效果，但不同高電壓PRF 抑制SNI 大鼠的TNF-α 表達的程度各不相同，其中以85VPRF 組抑制TNF-α表達最優(yōu)，結(jié)合其MWT 的變化發(fā)現(xiàn)，TNF-α 表達下調(diào)越明顯，其MWT 上升越顯著，這與他人的研究結(jié)果一致[7]，證明了脊髓背角內(nèi)TNF-α 參與了NP 的形成和發(fā)展，高電壓PRF 可能通過不同程度下調(diào)TNF-α 表達而減輕NP。

新近研究提示，脊髓背角內(nèi)TNF-α 和IL-10 在內(nèi)的關(guān)鍵抑炎細胞因子共同調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥，IL-10可能是通過抑制促炎因子合成和釋放從而有效減輕NP[5,17]。本研究中，隨著NP 的發(fā)展，IL-10 表達逐漸下調(diào)，而接受PRF 干預后，4 個不同電壓PRF組的IL-10 表達均上調(diào)并伴隨著MWT 的回升，其中以85VPRF 組的IL-10 上調(diào)最為明顯，因此，高電壓PRF 可能通過不同程度上調(diào)IL-10 表達而減輕NP。值得注意的是，在SNI 后第14 d，對65VPRF組和85VPRF 組脊髓背角內(nèi)IL-10 表達進行比較并未觀察到統(tǒng)計學差異，可能IL-10 是炎癥晚期細胞因子，其對炎癥以及高電壓PRF 治療的效果可能存在部分延遲，后期才表達增強并保持穩(wěn)定。

本研究仍存在不足，首先僅在SNI 后第14 d和第21 d 測定脊髓背角內(nèi)TNF-α 和IL-10 的表達，雖然發(fā)現(xiàn)兩者的表達與NP 密切相關(guān)，但沒有增加時間點以動態(tài)觀察脊髓背角內(nèi)TNF-α 和IL-10 表達的整體變化趨勢，且未進行更長時間的觀察，故無法判斷高電壓PRF 相比標準PRF 遠期的療效如何。其次，本研究設(shè)置最高電壓為100 V，結(jié)果顯示，85VPRF 組是緩解NP 最佳電壓，當電壓增加到100 V時，對NP 的改善并沒有得到進一步的緩解，其具體機制尚不明確，未來我們將進一步探討研究不同電壓PRF 是否能不同程度改善DRG 的超微結(jié)構(gòu)、促進神經(jīng)修復而產(chǎn)生不同療效，以及針對其內(nèi)在的其他機制進行更深入的研究。

綜上所述，高電壓PRF 大鼠SNI 模型DRG 可下調(diào)脊髓背角內(nèi)TNF-α 表達，上調(diào)IL-10 表達，從而減輕NP，而85 V 的PRF 鎮(zhèn)痛療效優(yōu)于其他電壓，這為臨床選擇高電壓PRF 治療NP 提供了實驗支持依據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。