劉慧敏 熊峣 文雪 耿婷 張銘 陳慧君 張?jiān)?/p>

雙酚A(bisphenol A，BPA)是一種廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的增塑劑，已有多種證據(jù)表明BPA是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)，可影響女性生殖功能[1]。HOXA10是子宮內(nèi)膜蛻膜化的標(biāo)志基因，HOXA10基因缺失的小鼠因蛻膜化缺陷導(dǎo)致胚胎著床失敗而出現(xiàn)反復(fù)妊娠流產(chǎn)[2]。HOXA10的啟動(dòng)子區(qū)域有多個(gè)可以與ERα結(jié)合的雌激素反應(yīng)原件(estrogen response element, ERE)。雌激素受體ERα作為HOXA10的轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控HOXA10的表達(dá)，但ERα對(duì)HOXA10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用受多種因素的影響[3]。課題組前期初步研究發(fā)現(xiàn)BPA影響混合譜系白血病組基因MLL1及子宮內(nèi)膜蛻膜化相關(guān)基因的表達(dá)[4-5]，但尚不清楚在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程中，BPA是否通過調(diào)控MLL1的表達(dá)，進(jìn)而影響MLL1與ERα的結(jié)合及其對(duì)ERα靶基因HOXA10的轉(zhuǎn)錄激活作用。為驗(yàn)證MLL1在BPA調(diào)控HOXA10表達(dá)中的關(guān)鍵作用，將進(jìn)一步探討不同BPA濃度暴露影響蛻膜化分子標(biāo)志物HOXA10表達(dá)的具體分子機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)室資料

1.細(xì)胞培養(yǎng)：永生化的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系(HESCs)從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Cat#CRL-4003)獲得，細(xì)胞用含有10%活性炭處理胎牛血清(CS-FBS)的無(wú)酚紅DMEM/F12(Procell，PM150316)培養(yǎng)基在37 ℃與5%CO2條件下培養(yǎng)。

2.體外蛻膜化及雙酚A暴露:HESCs在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至達(dá)到70%～80%，在2%CS-FBS培養(yǎng)基中饑餓24小時(shí)。向培養(yǎng)基中加入10 nM 雌二醇(E2，Sigma)、1μM甲羥孕酮(MPA，Sigma)、0.5 mM環(huán)狀單磷酸腺苷(cAMP，Sigma)和不同劑量(分別為0，10 pM，10 nM，10μM；選擇人群中普遍暴露的BPA濃度，即環(huán)境相關(guān)的濃度10nM，以及低劑量組10pM和高劑量組10μM進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。)的雙酚A(BPA，Sigma)的2%CS-FBS培養(yǎng)基處理，每隔一天更換一次培養(yǎng)基，蛻膜化處理6 d后收獲細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[4-5]。

3.細(xì)胞增殖測(cè)定：取HESC對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層貼壁細(xì)胞，0.25%胰酶消化，1000 r/min, 5min后離心收集細(xì)胞，以1.0×103/孔的密度植入于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)6天時(shí)每孔分別加入10 μL的CCK8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的光密度值。相對(duì)增殖速率=ODBPA組/OD溶劑組×100%。

4.RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR：使用RNA提取試劑盒從細(xì)胞中提取總RNA，然后用HisScript II Q RT SuperMix(Vazyme)，將樣品中1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于qPCR。ChamQTMSYBR qPCR預(yù)混液(Vazyme)在CFX Connect Real-time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR(qPCR)。qPCR的引物序列示于表1。mRNA的表達(dá)水平歸一化至GAPDH，使用2-ΔΔ ?t方法進(jìn)行分析。

5.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)：用RIPA裂解緩沖液(Beyotime)裂解不同組的細(xì)胞，所得蛋白裂解物用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度。用10%SDS-PAGE凝膠分離等量的蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉2 h。將膜分別與兔抗MLL1抗體(1:1 000; Bethyl, 貨號(hào)A300-374A)，小鼠抗HOXA10抗體(1:500; Santa Cruz, 貨號(hào)AB_10649855)，小鼠抗GAPDH(1:6 000, Proteintech, 貨號(hào)AB_2107436)。TBST洗滌后與相應(yīng)的過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1小時(shí)。使用高靈敏度ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒經(jīng)ECL發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon, 上海)進(jìn)行檢測(cè)，使用Image J對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行量化。

6.免疫共沉淀(CoIP)：按照免疫沉淀試劑盒(Sangon Biotech)制造商的說明，進(jìn)行CoIP。將細(xì)胞在超聲條件下1×裂解緩沖液中裂解，將等量的蛋白質(zhì)用于免疫沉淀。加入適量的目的基因的抗體和非特異性IgG，并在4℃下孵育過夜。將混合液添加到18μLProtein A/G-瓊脂糖柱中，在4℃下孵育過夜。用IP緩沖液洗滌幾次后，用1×上樣緩沖液將結(jié)合的蛋白洗脫，最后通過SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分析，用于免疫印跡的抗體是抗ERα的兔抗體(稀釋度1:1 000; abcam)，兔抗MLL1抗體(稀釋度1:1 000; Bethyl, A300-374A)。

7.染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)：按照CST公司的ChIP試劑盒(#56383)說明操作：先用1%甲醛將DNA結(jié)合蛋白與DNA交聯(lián)，甘氨酸終止交聯(lián)；超聲下裂解細(xì)胞，剪切染色質(zhì)；取出2%輸入對(duì)照樣品；用MLL1抗體、IgG抗體與含DNA的染色質(zhì)相結(jié)合，并加入Protein G磁珠使其沉淀下來(lái)，多次洗滌沉淀物；通過解交聯(lián)去除結(jié)合的蛋白質(zhì)純化DNA；以得到的DNA為模板對(duì)HOXA10啟動(dòng)子上多個(gè)ERE進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。

表1 用于RT-PCR，ChIP的引物列表

結(jié) 果

一、不同濃度BPA對(duì)HESC細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)表明10 pM和10 nM的BPA暴露后，HESC細(xì)胞的增值能力并沒有降低，反而稍微升高。但BPA濃度為10 μM時(shí)，細(xì)胞的增殖能力與溶劑組無(wú)顯著差別(圖1)。以上結(jié)果表明，BPA可能以非線性方式影響HESC細(xì)胞的增殖，且這三種濃度的BPA均不會(huì)對(duì)HESC細(xì)胞增殖造成損傷。

Note：Data are from four independent experiments.Veh=Vehicle, 10 pM、10 nM、10 μM indicate the concentration of BPA, *P<0.05 vs Vehicle

二、BPA暴露對(duì)蛻膜化過程中HESCs細(xì)胞MLL1、HOXA10表達(dá)的影響

蛻膜化處理的細(xì)胞中蛻膜化標(biāo)志物IGFBP1和PRL的mRNA含量顯著升高(圖2A)，表明體外蛻膜化模型成功建立。不同濃度BPA(0、10pM、10nM、10μM)暴露后，蛻膜化細(xì)胞中的MLL1和HOXA10 mRNA的表達(dá)水平降低，在10nM和10μM處差異具有顯著性(圖2B)，Western Blot結(jié)果與qPCR一致(圖2C)。

Note:Figure A shows RT-qPCR analysis of IGFBP-1 and PRL mRNA levels after decidualization treatment; Figure B shows RT-qPCR analysis of MLL1 and HOXA10 mRNA levels after BPA treatment.expression of in BPA concentration.Figure C shows Westernblot analysis of MLL1 and HOXA10 protein levels after BPA treatment.expression of in BPA concentration.Data are from four independent experiments; NC=normal control, Dec=decidualization, *P<0.05 vs NC or Veh

三、不同濃度BPA暴露后MLL1與ERα的結(jié)合情況

為了探討MLL1是否為ERα的共結(jié)合因子，通過用ERα和MLL1抗體進(jìn)行雙向CoIP實(shí)驗(yàn)，以MLL1抗體進(jìn)行IP時(shí)，隨著BPA濃度的升高ERα與MLL1的結(jié)合降低，同樣的，以ERα的抗體進(jìn)行IP時(shí)也得到了同樣的結(jié)果，該結(jié)果也說明了MLL1與ERα為調(diào)控蛻膜化的共作用因子，且BPA的暴露會(huì)降低二者的結(jié)合(圖3)。

Note:the picture shows the representative protein bands from the three experiments, Input = input control, IP = immunoprecipitation

四、MLL1、ERα共作用因子在HOXA10啟動(dòng)子區(qū)的富集情況

HOXA10啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的前3000個(gè)核苷酸內(nèi)包含多個(gè)雌激素反應(yīng)元件,包括ERE1和ERE2(圖4A)，通過進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MLL1、ERα共作用因子在ERE1、ERE2區(qū)域均有富集。與溶劑組比較，ERE1處富集效率在10 nM時(shí)下降了約54%，10 μM時(shí)下降了約57%，ERE2處富集效率在10 nM時(shí)下降了約47%，10 μM時(shí)下降了約52%，差異具有顯著性(圖4B)。

Note:Figure A shows schematic diagram of ERE1 and ERE2 in the HOXA10 promoter, TSS = transcription start site; Figure B shows enrichment of MLL1 and ERα cofactor in ERE1 and ERE2 regions, data are from three independent experiments, IgG as a negative control group, *P<0.05 vs Veh

討 論

BPA用于合成聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂等材料。BPA可使材料透明度高、防沖擊、耐用輕巧、耐熱防腐蝕，常用于制造礦泉水瓶、食品包裝、光盤等產(chǎn)品，是世界上產(chǎn)量最高的化學(xué)品之一，年產(chǎn)量高達(dá)100億千克，每年大約有100噸BPA釋放到大氣中[6]。流行病學(xué)資料顯示，在95%的人群尿液樣本中檢測(cè)到BPA，濃度≥0.1 ng/mL(0.44 nM)[7]，對(duì)成人血液樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)人體血液內(nèi)BPA濃度范圍為0.2～10 ng/mL(0.9～44 nmol/L)[8]。BPA可以在正常使用條件下從塑料制品中浸出，通過消化道、呼吸和皮膚接觸而進(jìn)入人體，進(jìn)入人體后的BPA會(huì)被輸送到肝臟進(jìn)行迅速的“首過代謝”，生成無(wú)活性的結(jié)合雙酚A，這一過程顯著降低了血液中的雙酚A濃度，但研究表明未結(jié)合的雙酚A仍舊可以在循環(huán)中保持?jǐn)?shù)小時(shí)甚至數(shù)天[9]。對(duì)成人血液樣本進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，生物活性形式的非結(jié)合型BPA在血液中平均濃度為1～3 ng/mL(4～13 nmol/L)[3]。在本次實(shí)驗(yàn)中我們選擇10 pM、10 nM、10 μM三種的濃度來(lái)進(jìn)行研究，其中10 pM和10 nM為環(huán)境相關(guān)的濃度，10 μM則代表了高暴露人群人體組織中的雙酚A濃度，三個(gè)濃度對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖均沒有損害(圖1)。BPA對(duì)蛻膜化的影響近年來(lái)一直受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注，在子宮內(nèi)膜異位癥等蛻膜化損傷相關(guān)疾病的患者體內(nèi)血清BPA濃度較高。Mark等發(fā)現(xiàn)BPA在10 μg/mL(43.8 μM)和20 μg/mL(87.6 μM)時(shí)會(huì)對(duì)蛻膜化造成損傷，但在較低劑量下則不會(huì)[10]，Aghajanova L也發(fā)現(xiàn)50 μmol/L和100 μmol/L的高濃度BPA會(huì)對(duì)蛻膜化造成損傷[11]，但這些研究中BPA的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在人群中可以檢測(cè)到的濃度。此外，BPA 對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化影響的研究結(jié)果也不一致。Mannelli等人[12]先對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行蛻膜化處理，再將其暴露于BPA(1 μM、1 nM、1 pM)24 h，發(fā)現(xiàn) 1 μM的BPA可降低PRLmRNA的表達(dá)。Forte等人[13]發(fā)現(xiàn)當(dāng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)給予BPA處理或者孕酮處理24 h之后給予 BPA 暴露(10 uM、10 nM、10 pM)，都會(huì)使 PRL和IGFBP-1mRNA 的表達(dá)不同程度的升高。這些研究結(jié)果的差異可能是由于藥物種類、給藥方式或藥物刺激時(shí)間的不同而造成的。由于“低劑量效應(yīng)”的概念逐漸被認(rèn)為是EDCs影響人體健康的一大普遍特征,更多的研究開始關(guān)注于低濃度的EDCs對(duì)疾病的影響[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在給予cAMP、MPA、E2蛻膜化處理，并同時(shí)暴露于10 nM和10 μM BPA時(shí)會(huì)使細(xì)胞內(nèi)HOXA10表達(dá)降低(圖2)，這也就意味著BPA對(duì)蛻膜化的影響不僅是在高濃度下，在較低的環(huán)境相關(guān)的濃度下，BPA也會(huì)對(duì)蛻膜化造成損害，驗(yàn)證了BPA的“低劑量效應(yīng)”。

本課題前期研究發(fā)現(xiàn)BPA影響子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞蛻膜化及其分子標(biāo)志物的表達(dá)，但具體分子調(diào)控機(jī)制尚不明確[4]。HOXA10是子宮內(nèi)膜蛻膜化的標(biāo)志基因，HOXA10基因缺失的小鼠因蛻膜化缺陷導(dǎo)致胚胎著床失敗而出現(xiàn)反復(fù)妊娠流產(chǎn)[2]。混合譜系白血病組基因MLLs是人類組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，包括MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、SET1A和SET1B等，它們的作用是催化組蛋白H3K4的甲基化，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。MLL1蛋白分子上有與ERα結(jié)合的結(jié)構(gòu)，可作為ERα的共同作用因子，參與對(duì)ERα下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[15]。HOXA10是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，在胚胎植入過程中起著重要作用，Nancy Ashary等研究認(rèn)為HOXA10在胚胎植入過程中有三個(gè)重要作用：獲得子宮內(nèi)膜的容受性；響應(yīng)來(lái)自胚泡的信號(hào)，使子宮內(nèi)膜蛻膜化；促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和胎盤形成[16]。近年來(lái)，HOXA10的下游效應(yīng)機(jī)制[17]以及上游調(diào)控機(jī)制[18]引起了大家的關(guān)注，這些研究不僅說明了HOXA10在蛻膜化過程中扮演著重要角色，也提示明確蛻膜化中HOXA10的上下游相關(guān)機(jī)制的必要性。MLL1是一種H3K4組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，H3K4的甲基化已被證明與多種真核生物的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，參與多種生物功能，對(duì)全基因組組蛋白修飾的研究發(fā)現(xiàn)H3K4的甲基化參與調(diào)控子宮內(nèi)膜蛻膜化相關(guān)基因的表達(dá)變化[19]。以女性蛻膜化損傷為特征的習(xí)慣性流產(chǎn)的患者子宮內(nèi)膜中MLL1表達(dá)水平顯著降低[9]。由MLL1組成的H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物是HOX基因激活所必需的，在細(xì)胞周期調(diào)控中，HOX基因(HOXA5、HOXA7、HOXA10)可招募MLL1蛋白到HOXA基因的啟動(dòng)子序列上，引起H3K4組蛋白甲基化修飾和HOXA基因的轉(zhuǎn)錄激活[20]。另有研究提示在急性髓性白血病中，MLL1是ERα的共作用分子，ERα可結(jié)合MLL1蛋白，促進(jìn)MLL1 結(jié)合到HOXA10啟動(dòng)子上來(lái)調(diào)控HOXA10的表達(dá)[21]，在子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中，可能也存在類似的分子作用機(jī)制。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在蛻膜化的過程中，MLL1確實(shí)會(huì)與ERα結(jié)合，并作為其共同作用因子調(diào)控HOXA10表達(dá)，且BPA的暴露減少M(fèi)LL1與ERα的結(jié)合(圖3)，不僅如此，MLL1和ERα在HOXA10的啟動(dòng)子區(qū)ERE的富集也與濃度呈逆相關(guān)(圖4)。總之，環(huán)境濃度BPA和高濃度BPA暴露使MLL1和ERα對(duì)靶基因HOXA10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用減弱，最終導(dǎo)致HOXA10 表達(dá)降低，影響子宮內(nèi)膜蛻膜化。這為探索BPA暴露影響子宮內(nèi)膜蛻膜化分子標(biāo)志物表達(dá)的機(jī)制提供了新的研究思路，也提示MLL1作為ERα的共同作用因子可能還調(diào)控其它蛻膜化相關(guān)基因的表達(dá)。BPA本身也具有擬雌激素作用，可直接與ERα結(jié)合進(jìn)而調(diào)控HOXA10，故BPA可直接影響或通過MLL1相關(guān)機(jī)制間接影響蛻膜化。

子宮內(nèi)膜間質(zhì)的蛻膜化對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的建立起重要作用，而子宮內(nèi)膜容受性的建立又是胚胎成功著床的必要條件，因此揭開蛻膜化損害所涉及的分子機(jī)制一直是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究主題。課題組前期實(shí)驗(yàn)通過使用MLL1的抑制劑和siRNA證明MLL1在蛻膜化中起重要作用[9]，并發(fā)現(xiàn)BPA對(duì)蛻膜化造成損害可能與MLL1有關(guān)[5]，而本文則發(fā)現(xiàn)BPA是通過降低MLL1和ERα共作用因子的結(jié)合并減少其在HOXA10啟動(dòng)子區(qū)的富集從而減少HOXA10的表達(dá)，對(duì)蛻膜化造成損傷。該發(fā)現(xiàn)有助于加深對(duì)BPA影響子宮內(nèi)膜蛻膜化分子機(jī)制的了解，并引起人們對(duì)BPA損傷女性生殖功能的關(guān)注。