陸金健 王嘉銘 南方 楊文潤 廣東省醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗所 （廣東 廣州 510080）

內容提要： 目的：通過試驗探索無水乙醇作為血液灌流器遺傳毒性試驗浸提介質的可行性。方法：將無水乙醇作為浸提介質使用灌注的方式充滿灌流器，使用浸提液分別進行細菌回復突變試驗、體外哺乳動物細胞基因突變試驗和體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗。結果：細菌回復突變試驗中與陰性對照組相比5種菌株自發(fā)回復突變菌落數(shù)均無顯著性差異；體外哺乳動物細胞基因突變試驗中所有組的總突變頻率與陰性對照組相比在統(tǒng)計學上無顯著性差異；體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗中染色體畸變率與陰性對照組相比無顯著性增加。結論：無水乙醇作為浸提介質時對試驗體系中的細菌、細胞生長無影響，且在本試驗條件下無致突變性，選擇無水乙醇作為浸提介質進行試驗是可行的。

血液灌流是通過血液灌流器吸附作用來清除血液中的內源性或外源性毒素，并將凈化了的血液回輸?shù)襟w內的一種血液凈化的方法，可有效清除血液中的中大分子物質，代謝廢物以及毒素[1]。血液灌流器在醫(yī)療領域主要應用于急性藥物和毒物中毒、尿毒癥毒素的清除、降脂的新療法、提高移植腎的存活率及治療皮膚病等。屬于血液循環(huán)短期接觸的外部接入醫(yī)療器械，根據(jù)GB/T 16886.1-2022《醫(yī)療器械生物學評價 第1部分：風險管理過程中的評價與試驗》[2]的要求需進行遺傳毒性試驗。遺傳毒性試驗可用于評價器械及其浸提液引起的基因突變、染色體結構和數(shù)量的改變以及其他DNA或基因毒性。本試驗采用GB/T 16886.3-2019《醫(yī)療器械生物學評價 第3部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗》[3]中推薦的細菌回復突變試驗、體外哺乳動物細胞基因突變試驗和體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗的組合。

由于血液灌流器主要是通過其吸附性對血液進行凈化，當使用含血清培養(yǎng)基作為浸提介質進行遺傳毒性試驗時，會吸附血清蛋白等其他一些未知的營養(yǎng)成分，導致含血清培養(yǎng)基中細胞生長的一些營養(yǎng)物質不足，影響細胞的生長，使得試驗無法正常進行[4]。本試驗采用無水乙醇做為浸提介質，采用灌注的方式進行浸提，探究無水乙醇做為血液灌流器浸提介質進行遺傳毒性實驗的可行性。

1.材料與方法

1.1 一般材料

本試驗起止時間：2022年7月18日～2022年8月25日。

菌株：鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷性菌株TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535（MOLTOX公司），購自上海寶錄生物科技有限公司。使用前經(jīng)組氨酸缺陷型、脂多糖缺陷、R因子、四環(huán)素、uvrB修復缺陷性和自發(fā)回復突變鑒定合格，且傳代次數(shù)均在5代以內[5]。

細胞株：小鼠淋巴瘤細胞（L5178Y TK+/－3.7.2C）、中國倉鼠肺細胞（CHL），均購自中國科學院細胞庫提供，小鼠淋巴瘤細胞經(jīng)過THMG進行自發(fā)突變清除，自發(fā)突變頻率在50×10-6～170×10-6之間[6,7]。

主要試劑：胎牛血清、熱滅活牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、雙抗購自GIBCO公司，無水乙醇、組氨酸、生物素、氯化鈉、三氟胸苷購自、甲磺酸甲酯、絲裂霉素C、秋水仙素均購自Sigma公司，葡萄糖-6-磷酸、輔酶Ⅱ、環(huán)磷酰胺購自阿拉丁試劑有限公司，技術瓊脂粉購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，PBS、底層培養(yǎng)基購自索萊寶生物科技有限公司，甲醇、冰醋酸購自廣州化學試劑廠。0.9%氯化鈉注射液購自廣東科倫藥業(yè)有限公司，S9（MOLTOX公司）現(xiàn)配現(xiàn)用。

主要儀器：生物安全柜（新華醫(yī)療）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）、空氣浴培養(yǎng)搖床（德國IKA）、恒溫水浴鍋（德國JULABO）、渦旋儀（汗諾儀器）、細胞計數(shù)儀（Life Technologies）、倒置顯微鏡（olympus）、顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)（徠卡）、臺式離心機（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 細菌回復突變試驗

1.2.1.1 試驗液制備

試驗組：無菌操作，取樣品整體加入無水乙醇灌滿，在37?C下浸提72h。陰性對照組：無菌操作，取樣品整體加入0.9%氯化鈉注射液灌滿，在37?C下浸提72h。陽性對照：加S9：TA97、TA98、TA100、TA1535 0.1mg/mL 2-氨基芴，TA102 0.5mg/mL 1，8-二羥基蒽醌；不加S9：TA97、TA98、TA102 1.0mg/mL敵克松，TA100、TA1535 1.0mg/mL疊氮化鈉。

1.2.1.2 試驗方法

取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無菌小三角瓶或無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內，在37?C、120r/min振蕩培養(yǎng)12h至對數(shù)生長期，活菌數(shù)不少于1×109CFU/mL。融化頂層培養(yǎng)基分裝于無菌小試管，每管2mL，在45?C水浴中保溫。

在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入樣品液0.1mL、新鮮細菌培養(yǎng)物0.1mL和10%S9混合液0.5mL。無活化組加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL。試管內容物混合后鋪至最低瓊脂營養(yǎng)平板的表面。在培養(yǎng)前待頂層瓊脂固化。樣品組分別設三個平行皿。

陰性對照組分別加入0.1mL同批浸提介質和新鮮細菌培養(yǎng)物0.1mL，活化組再加10% S9混合液0.5mL，無活化組加0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL；陽性對照組分別加入誘變劑0.1mL和新鮮細菌培養(yǎng)物0.1mL，活化組再加10% S9混合液0.5mL，無活化組加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL。陰性及陽性對照組分別設3個平行皿。全部平皿置37?C倒置培養(yǎng)72h觀察各個皿內細菌的生長狀況并對各個皿的菌落數(shù)進行統(tǒng)計。

1.2.2 體外哺乳動物細胞基因突變試驗

1.2.2.1 試驗液制備

試驗組：無菌操作，取樣品整體加入無水乙醇灌滿，在37?C下浸提72h。陰性對照：無菌操作，取樣品整體加入不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基灌滿，在37?C下浸提72h，試驗前加入終濃度為10%的胎牛血清。陽性對照：無活化組為甲磺酸甲酯，活化組為環(huán)磷酰胺。

1.2.2.2 試驗方法

取生長良好的細胞，調整密度為1×106/mL。無活化系統(tǒng)組取10mL細胞懸液與0.2mL試驗液或對照品以及PBS 1mL混合，加入含血清培養(yǎng)基至終體積為20mL；有活化系統(tǒng)組取10mL細胞懸液，加入0.2mL試驗或對照樣品以及S9混合液1mL，加入含血清培養(yǎng)基至終體積為20mL。

將上述混合液置于37?C，5% CO2，飽和濕度條件下處理4h（有和無活化系統(tǒng)）和24h（無活化系統(tǒng)）。處理結束后離心，棄上清液，用磷酸緩沖鹽溶液或不含血清的培養(yǎng)基洗滌細胞2遍，重新懸浮細胞于含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，并調整細胞密度為2×105/mL。

PE0平板：PE0（0天的平板接種效率）測定：取適量細胞懸液，作梯度稀釋至8個細胞/mL，接種96孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6個細胞/孔），每個劑量作2塊板，37?C，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d，計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)。

PE2平板：第2天表達培養(yǎng)結束后，按PE0接種。每天計數(shù)細胞密度并保持密度在106/mL以下。

TEF拮抗平板：第2天表達培養(yǎng)結束后，取適量細胞懸液，調整細胞密度為1×104/mL，加入TFT（三氟胸苷，終濃度為3μg/mL），混勻，接種96孔板（每孔加0.2mL，即平均2000個細胞/孔），每個劑量作2塊板，37?C，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d。

對PE0，PE2平板計算無集落生長的孔數(shù)，對TFT抗性拮抗平板應計算無小集落孔數(shù)、無集落孔數(shù)。每個劑量組數(shù)據(jù)求平均數(shù)，計算平板效率PE=-ln（EW/TW）/1.6、相對存活率RS=PE0(樣品組)/PE0(對照組)×100%、TFT抗性突變頻率T-MF=[-ln(EW/TW)/n]/PE2和小集落突變百分率SCM(%)=(S-MF)/(T-MF)，同時對每組平板突變頻率進行統(tǒng)計學分析。

1.2.3 體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗

1.2.3.1 試驗液制備

試驗組：無菌操作，取樣品整體加入無水乙醇灌滿，在37?C下浸提72h。陰性對照：無菌操作，取樣品整體加入不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基灌滿，在37?C下浸提72h，試驗前加入終濃度為10%的胎牛血清。陽性對照：無活化組為絲裂霉素C，活化組為環(huán)磷酰胺。

1.2.3.2 試驗方法

接種一定數(shù)量細胞，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在細胞長滿培養(yǎng)瓶50%左右時吸出培養(yǎng)液，加入對照品或供試品、S9混合液（不加S9混合液時，需用PBS補足）、以及新鮮培養(yǎng)液，無水乙醇浸提液的終濃度為1%（V/V）。全部置于培養(yǎng)箱中。短期接觸組接觸結束后吸去培養(yǎng)皿中的液體，用PBS清洗細胞3次，加入含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。陰性對照組和陽性對照組同法制備。所有試驗組于24h內收獲細胞，收獲前4h加入終濃度為1μg/mL秋水仙素。接觸處理結束后，加入適量胰酶將細胞消化收集取出，用5mL 0.075mol/L氯化鉀溶液低滲一次，固定液固定兩次后制片。封片晾干后在光學顯微鏡下每一試驗組選擇200個分散良好的中期分裂相進行染色體畸變分析，記錄畸變細胞數(shù)目，計算相對細胞增長數(shù)。

2.結果分析

2.1 細菌回復突變試驗

細菌回復突變試驗結果見表1。72h培養(yǎng)結束后，試驗組的五種菌株均可正常生長，且在加與不加S9條件下，自發(fā)回復突變數(shù)均小于陰性對照組的2倍；陽性對照組自發(fā)回復突變數(shù)均大于陰性對照組的3倍。

表1.細菌回復突變試驗菌落數(shù)

2.2 體外哺乳動物細胞基因突變試驗

體外哺乳動物細胞基因突變試驗結果見表2。與陰性對照組相比較試驗組短期接觸組、活化組和長期接觸組的相對存活率分別為96.36%、109.20%和113.73%，未出現(xiàn)明顯細胞毒性。突變頻率分別為69.53×10-6、66.66×10-6和53.59×10-6，無顯著性差異。

表2.體外哺乳動物細胞基因突變試驗結果統(tǒng)計

2.3 體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗

體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗結果見表3。試驗組各個組的相對細胞增長數(shù)均不低于80%。每組觀察200個分散良好的中期分裂相，活化組陰性對照畸變率為0.5，非活化長期接觸組畸變率為0.5，除陽性對照外其余試驗組均未發(fā)現(xiàn)畸變細胞。

表3.體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗結果

3.討論

血液灌流器屬于血液循環(huán)短期接觸的外部介入醫(yī)療器械，是三類醫(yī)療器械，考慮到其可瀝濾物可能進入血液并在其移除后還會存在，因此需進行遺傳毒性試驗。導致醫(yī)療器械產生遺傳毒性的原因多種多樣，單一試驗無法檢測出所有遺傳毒性物質，需根據(jù)實際情況選擇試驗組合[8,9]。遺傳毒性主要表現(xiàn)為基因突變和染色體損傷，細菌回復突變試驗可檢測出絕大部分的DNA損傷遺傳毒性物質，但某些特定的例如鹵烴類物質卻無法檢出，且細菌為原核生物，采用細菌進行試驗不具有代表性，需增加哺乳動物細胞進行補充試驗。體外哺乳動物細胞基因突變試驗和體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗可檢測出造成DNA損傷和染色體畸變的遺傳毒性物質，本試驗選擇體外哺乳動物細胞基因突變試驗、體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗與細菌回復突變試驗進行組合[10]。遺傳毒性試驗常用的浸提介質有含血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基，0.9%氯化鈉注射液和二甲基亞砜，因不同類型浸提介質可浸提出的物質不同，采用單一浸提介質進行試驗存在潛在風險，所以選擇兩種不同的浸提介質進行試驗[11]。因血液灌流器主要是利用了內部填充物的吸附作用達到治療效果，在使用含血清培養(yǎng)基作為浸提介質進行試驗時，往往會出現(xiàn)細胞無法正常生長導致試驗無法進行的現(xiàn)象。二甲基亞砜作為一種優(yōu)質的有機溶劑，可溶解絕大部分有機物，采用灌注的方式對血液灌流器進行浸提可能會導致某些材料發(fā)生溶解，破壞了器械的完整性。在GB/T 16886.3-2019標準中這是不被允許的。所以含血清培養(yǎng)基和二甲基亞砜不適用于血液灌流器的浸提。而乙醇作為一種有機溶劑，可與試驗體系混溶，且樹脂，活性炭均不溶于乙醇，且由試驗結果可以看出，用無水乙醇作為浸提介質時在細菌回復突變試驗中，5種細菌均可正常生長回復突變數(shù)無明顯變化。在體外哺乳動物細胞基因突變試驗中各試驗組的相對存活率均在90%以上，未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。在體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗中各試驗組的相對細胞增長數(shù)均不低于80%，說明在本試驗條件下，乙醇對CHL細胞為表現(xiàn)出細胞毒性。在遺傳毒性方面三個試驗均未表現(xiàn)出陽性結果，由此可見在本試驗條件下無水乙醇作為浸提介質本身并不具備遺傳毒性[12]。固選擇無水乙醇作為浸提介質進行試驗是可行的。但考慮到細胞毒性的影響，且細胞生長需要較豐富的營養(yǎng)物質，浸提后的0.9%氯化鈉注射液和無水乙醇無法作為試驗液直接進行試驗，在GB/T 16886.3-2019中的附錄A中提到采用0.9%氯化鈉注射液作為浸提介質時需用含血清培養(yǎng)基稀釋至10%再進行試驗，采用無水乙醇作為浸提介質時需用含血清培養(yǎng)基稀釋至1%再進行試驗。由于0.9%氯化鈉注射液和無水乙醇均采用稀釋液進行試驗，考慮到稀釋后可能導致毒性無法檢出，固采用無血清培養(yǎng)基浸提后補充10%血清作為浸提介質與無水乙醇進行組合，對血液灌流器進行遺傳毒性檢測。