王豐 張威鵬 任平一 深圳市市場(chǎng)監(jiān)督管理局許可審查中心 （廣東 深圳 518000）

內(nèi)容提要： 針對(duì)定量體外診斷試劑產(chǎn)品的參考區(qū)間研究資料歸納出審評(píng)關(guān)注點(diǎn)，并分別提供了參數(shù)法與非參數(shù)法建立參考區(qū)間的案例進(jìn)行分析。以期供評(píng)審人員在技術(shù)審評(píng)過(guò)程中參考，幫助企業(yè)理解和把握整個(gè)研究資料的編寫(xiě)要點(diǎn)。

參考區(qū)間通常由其參考上限和參考下限組成，部分產(chǎn)品可僅有參考上限或下限。擬上市產(chǎn)品在注冊(cè)申報(bào)時(shí)主要討論健康人群的參考區(qū)間?，F(xiàn)對(duì)定量體外診斷試劑參考區(qū)間研究資料的審評(píng)關(guān)注點(diǎn)進(jìn)行歸納，并舉例說(shuō)明。

1.審評(píng)關(guān)注點(diǎn)

1.1 確定途徑的選擇

國(guó)內(nèi)外無(wú)上市同類產(chǎn)品應(yīng)建立參考區(qū)間。國(guó)外有已上市產(chǎn)品可驗(yàn)證原始參考區(qū)間在中國(guó)人群的適用性。國(guó)內(nèi)有已上市同類產(chǎn)品，可選擇建立或驗(yàn)證國(guó)內(nèi)已注冊(cè)產(chǎn)品的參考區(qū)間。已經(jīng)有國(guó)內(nèi)共識(shí)、醫(yī)學(xué)決定水平的檢測(cè)項(xiàng)目，可不再建立參考區(qū)間[1]。對(duì)擬上市產(chǎn)品可參照?qǐng)D1進(jìn)行初步判斷，選擇合適的途徑。

圖1.參考區(qū)間的確定路徑圖

關(guān)注點(diǎn)：是否需要建立或可驗(yàn)證轉(zhuǎn)移參考區(qū)間。國(guó)內(nèi)外已有同類且成熟產(chǎn)品，可采用驗(yàn)證的方法轉(zhuǎn)移其參考區(qū)間。

1.2 建立方案的確定

1.2.1 樣本的選擇

應(yīng)制定納排標(biāo)準(zhǔn)，選擇“表觀健康”的適用人群入組，并按臨床決策意義、篩選個(gè)體的特征等因素進(jìn)行分組。入組的參考人群分布組成直接影響著參考區(qū)間建立的科學(xué)性與適用性。根據(jù)最新公布的《體外診斷試劑參考區(qū)間確定注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》[1]，建議申請(qǐng)人通過(guò)多中心招募的形式納入?yún)⒖既巳骸?/p>

關(guān)注點(diǎn)：確定待檢項(xiàng)目的適用人群，明確該項(xiàng)目“表觀健康”的參考個(gè)體，明確納排標(biāo)準(zhǔn)?？蓞⒖紝?duì)比試劑說(shuō)明書(shū)、臨床檢驗(yàn)章程、標(biāo)準(zhǔn)及指導(dǎo)原則等進(jìn)行判斷，考察參考個(gè)體的分布組成是否滿足以上要求。

例如：脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2測(cè)定試劑盒，納入排除標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)排除無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化的患者；雄烯二酮測(cè)定試劑盒要明確是否排除遺傳性腎上腺皮質(zhì)增生、腎上腺皮質(zhì)功能減退等疾病人群；D-二聚體測(cè)定試劑盒的排除標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)考慮產(chǎn)品宣稱的“彌散性血管內(nèi)凝血及溶栓治療”適應(yīng)證；葉酸（Folate）測(cè)定試劑盒是否排除巨幼紅細(xì)胞性貧血人群等。

1.2.2 樣本采集與處理

采樣前應(yīng)確保參考個(gè)體的狀態(tài)良好，并按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣本的采集與處理。

關(guān)注點(diǎn)：納入的參考個(gè)體是否處于良好的狀態(tài)；采集的樣本是否明確其來(lái)源和機(jī)構(gòu)名稱；采用的樣本是否符合說(shuō)明書(shū)聲稱的要求；研究報(bào)告中是否已詳細(xì)說(shuō)明樣本類型、儲(chǔ)存方式等情況。

例如：血液樣本應(yīng)區(qū)分采樣部位，如醛固酮測(cè)定試劑盒需補(bǔ)充仰臥位、直立位樣本的采集方法，且該項(xiàng)目與生理節(jié)律有關(guān)，還應(yīng)明確采血時(shí)間，并相應(yīng)在說(shuō)明書(shū)中列明[2]；尿液樣本應(yīng)明確采集時(shí)間和方式，說(shuō)明是否添加防腐劑等，如尿轉(zhuǎn)鐵蛋白測(cè)定試劑盒。

1.2.3 樣本檢測(cè)

應(yīng)采用產(chǎn)品宣稱的檢測(cè)系統(tǒng)（含樣本前處理產(chǎn)品、檢測(cè)試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、檢測(cè)設(shè)備等）進(jìn)行樣本檢測(cè)。

關(guān)注點(diǎn)：是否與說(shuō)明書(shū)宣稱的保持一致。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

檢測(cè)項(xiàng)目可根據(jù)臨床意義研究參考區(qū)間的單側(cè)或雙側(cè)界限。詳細(xì)的分析過(guò)程見(jiàn)圖2。

圖2.參考區(qū)間建立的數(shù)據(jù)分析過(guò)程

關(guān)注點(diǎn)：參考對(duì)比產(chǎn)品或同類產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)。根據(jù)預(yù)期用途、專家共識(shí)等判斷采用雙側(cè)還是單側(cè)界限。

1.2.4.1 確定樣本數(shù)量

根據(jù)CLSI EP28-A3c[3]的要求，采用90%置信區(qū)間估計(jì)參考區(qū)間時(shí)，樣本量應(yīng)≥120例，如需分組則每組都要≥120例。新生兒、幼兒、老年人等樣本難以獲得的人群可以少于120例[4]。

關(guān)注點(diǎn)：根據(jù)采用的置信區(qū)間不同，審核樣本的例數(shù)是否滿足要求。

例如：孕酮測(cè)定試劑盒應(yīng)根據(jù)孕周的大小對(duì)其參考區(qū)間進(jìn)行分組，如采用90%的置信區(qū)間則每組應(yīng)采用至少120例樣本進(jìn)行研究。

1.2.4.2 繪制分布圖

可通過(guò)繪制分布圖的方法可以直觀地了解所得數(shù)據(jù)的分布特性（如數(shù)據(jù)對(duì)稱性或正態(tài)峰）[1]?？墒褂肧PSS對(duì)參考值的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)的特征進(jìn)行選擇適用的檢驗(yàn)方法。

關(guān)注點(diǎn)：判斷數(shù)據(jù)的分布特征為正態(tài)或偏態(tài)，選擇下一步分析方法及途徑。

例如：糖化血紅蛋白測(cè)定試劑盒需要補(bǔ)充各研究數(shù)據(jù)屬于正態(tài)分布的統(tǒng)計(jì)分析過(guò)程等。

1.2.4.3 判斷離群值

推薦使用Dixon方法和Tukey法兩種方法進(jìn)行離群值的判定。

Dixon法適用于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，通常利用比值D/R≥1/3來(lái)判斷離群值[1]；Tukey法用于正態(tài)分布數(shù)據(jù)，通常取四分位間距上下限[Q3+1.5×IQR，Q1–1.5×IQR]來(lái)判斷其離群值[5,6]。

以上兩種方法確定的離群值均需要有明確原因的才可剔除，如無(wú)明確原因，應(yīng)將該數(shù)據(jù)保留。

關(guān)注點(diǎn)：離群值的判斷是否正確，是否需要剔除，剔除后需補(bǔ)齊樣本數(shù)重新進(jìn)行判定。

1.2.4.4 分組比較

參考區(qū)間的分組比較應(yīng)根據(jù)以下準(zhǔn)則：是否對(duì)臨床決策有意義或是否具有明確的生理學(xué)意義。應(yīng)結(jié)合數(shù)據(jù)的分布特征選擇分析方法，如數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布、且兩組間的比較時(shí)，申請(qǐng)人可采用Z檢驗(yàn)，而多組間比較可采用F檢驗(yàn)等。不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的組間可以合并參考區(qū)間[7]。

關(guān)注點(diǎn)：根據(jù)臨床意義進(jìn)行分組（可參考對(duì)比試劑），分組后每組的樣本量都要滿足要求。

例如：脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2測(cè)定試劑盒的參考區(qū)間與年齡有高度相關(guān)性，應(yīng)確保每個(gè)年齡段有一定的樣本量，并分別統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4.5 建立參考區(qū)間

主要分為參數(shù)法和非參數(shù)法。①參數(shù)法亦稱正態(tài)分布法。采用該方法要求數(shù)據(jù)接近正態(tài)分布或經(jīng)轉(zhuǎn)換后呈正態(tài)分布，樣本量見(jiàn)表1。該方法建立參考區(qū)間的結(jié)果比較穩(wěn)定，不易受到兩端數(shù)據(jù)的影響[1]。②非參數(shù)法亦稱百分位數(shù)法。如參考值數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，可采用非參數(shù)法確定參考區(qū)間，樣本量見(jiàn)表1。該方法容易受到兩端數(shù)據(jù)的影響，不適用于樣本含量較小時(shí)[1]。

表1.采用參數(shù)法/非參數(shù)法的樣本數(shù)量、置信區(qū)間及參考區(qū)間上限和下限

關(guān)注點(diǎn)：分析方法是否適宜，樣本量是否滿足所宣稱置信區(qū)間的最低要求，結(jié)果是否正確。

例如：可溶性生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白檢測(cè)試劑盒，未提供樣本分布狀態(tài)的研究，應(yīng)明確數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布才適用于百分位數(shù)法。

1.3 參考區(qū)間的驗(yàn)證

驗(yàn)證參考區(qū)間必須同時(shí)滿足：原始參考區(qū)間的研究具可信性，如有已發(fā)布實(shí)施的臨床檢測(cè)參考區(qū)間標(biāo)準(zhǔn)等；檢測(cè)系統(tǒng)需具有可比性；分析前因素需具有可比性；參考人群的適宜性，即適用人群相一致，或包含其參考人群[1]。

如不能同時(shí)滿足上述條件，則需要建立自己的參考區(qū)間。參考區(qū)間建立及驗(yàn)證流程可見(jiàn)圖3。

圖3.參考區(qū)間建立及驗(yàn)證流程

關(guān)注點(diǎn)：以上四個(gè)條件缺一不可。

1.3.1 比對(duì)評(píng)估研究

可參照《免于臨床試驗(yàn)的體外診斷試劑臨床評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》[8]，通過(guò)方法學(xué)比對(duì)的方法，對(duì)申報(bào)產(chǎn)品與原始參考區(qū)間建立時(shí)的檢測(cè)系統(tǒng)的可比性進(jìn)行研究。通過(guò)列表的方式，對(duì)比參考人群分布的地理位置、生物特征、參考區(qū)間研究分析前的因素等[1]。

注意，采用驗(yàn)證方法轉(zhuǎn)移參考區(qū)間時(shí)，應(yīng)首選轉(zhuǎn)移注冊(cè)申報(bào)中臨床試驗(yàn)或臨床評(píng)價(jià)所選擇的對(duì)比試劑的參考區(qū)間。

關(guān)注點(diǎn)：注意方法學(xué)比對(duì)的樣本量能否滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，兩檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)高度一致。

例如：超敏C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒在直接驗(yàn)證并轉(zhuǎn)移參考區(qū)間過(guò)程中，申報(bào)試劑與比對(duì)試劑方法學(xué)、工藝不同，參考值不應(yīng)直接進(jìn)行轉(zhuǎn)移，應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后得出自己的參考值范圍。

1.3.2 驗(yàn)證參考區(qū)間

1.3.2.1 小樣本量的驗(yàn)證

依照CLSI/NCCLS C28-A2[3]、WS/T 402-2012[9]的要求，小樣本量的驗(yàn)證應(yīng)選擇至少20例參考個(gè)體進(jìn)行研究。建議制造商、用戶（如醫(yī)院）或接收實(shí)驗(yàn)室采用小樣本量驗(yàn)證并轉(zhuǎn)移已建立的參考區(qū)間。驗(yàn)證通過(guò)法則：原始參考區(qū)間外的觀察值不超過(guò)2例（即10%）。如超過(guò)了2例（即10%），應(yīng)另選至少20例重新進(jìn)行驗(yàn)證[9]。

1.3.2.2 大樣本量的驗(yàn)證

應(yīng)選擇至少60例參考個(gè)體，參照小樣本量的方法進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證并轉(zhuǎn)移原始參考區(qū)間時(shí)，建議采用大樣本量。

關(guān)注點(diǎn)：樣本例數(shù)（含不同組別）是否滿足驗(yàn)證的要求。驗(yàn)證前應(yīng)先做對(duì)比評(píng)估研究，評(píng)估原始參考區(qū)間能否轉(zhuǎn)移。

例如：尿免疫球蛋白G測(cè)定試劑盒直接驗(yàn)證參考區(qū)間的研究試驗(yàn)中，樣本例數(shù)應(yīng)不低于60例。

1.4 其他關(guān)注點(diǎn)

在參考區(qū)間研究資料的技術(shù)審評(píng)過(guò)程中，還存在以下常見(jiàn)的問(wèn)題點(diǎn)，同樣需要引起關(guān)注。①參考區(qū)間確定的方法和依據(jù)不詳細(xì)；②參考區(qū)間研究樣本的來(lái)源不明確；③未對(duì)參考區(qū)間試驗(yàn)資料詳細(xì)地總結(jié)歸納[10]；④關(guān)于非同源樣本，如尿液、血液樣本，應(yīng)分別建立其參考區(qū)間；如不能證明同源樣本（如血清、血漿、全血）之間的一致性，應(yīng)分別建立參考區(qū)間；⑤校準(zhǔn)品和質(zhì)控品不需要提交該項(xiàng)研究資料。

例如：肌紅蛋白測(cè)定試劑盒在建立參考區(qū)間時(shí)，對(duì)比試劑肝素血漿、血清與EDTA血漿參考值差異較大，而申報(bào)試劑不同樣本類型無(wú)差異，應(yīng)應(yīng)分別進(jìn)行不同樣本類型參考值研究；生長(zhǎng)激素測(cè)定試劑盒宣稱可用于新生兒，則需證明臍帶血樣本與靜脈血樣本之間是否可比，針對(duì)每個(gè)年齡段、不具可比性樣本應(yīng)采用至少120例樣本對(duì)參考區(qū)間進(jìn)行研究。

2.案例分析

2.1 案例一：參數(shù)法建立參考區(qū)間

抗凝血酶Ⅲ活性測(cè)定試劑盒臨床上主要用于輔助診斷血栓形成性疾病[11]。研究中共篩選了240例經(jīng)臨床診斷無(wú)心血管疾病史或凝血疾病史、未處于妊娠或哺乳期的健康人群，年齡范圍為10～80歲，男女均等。檢驗(yàn)結(jié)果按男女分為兩個(gè)亞組經(jīng)Z檢驗(yàn)顯示，兩組均值間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（Z0.05）。檢驗(yàn)結(jié)果經(jīng)K-S和S-W正態(tài)性檢驗(yàn)呈正態(tài)分布（P均>0.05），可采用參數(shù)法。經(jīng)查95%參考區(qū)間的參考上下限為X±1.96SD，最終計(jì)算95%的參考區(qū)間為：[80%，120%]。

2.2 案例二：非參數(shù)法建立參考區(qū)間

全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒可作為非特異性炎癥指標(biāo)[12]和用于評(píng)價(jià)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[12]?；诋a(chǎn)品的預(yù)期用途，分別建立超敏C反應(yīng)蛋白和常規(guī)C反應(yīng)蛋白的參考區(qū)間。研究過(guò)程中分別入組400例無(wú)心血管疾病和400例無(wú)非特異性炎癥的正常人，年齡范圍為0～80歲，男女均等。統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)年齡、性別差異分為四個(gè)亞組，采用Z檢驗(yàn)對(duì)各亞組進(jìn)行組間比較，經(jīng)分析樣本中男性和女性、成年與未成年人的C反應(yīng)蛋白檢測(cè)結(jié)果之間沒(méi)有顯著性差異。所測(cè)得的C反應(yīng)蛋白濃度水平經(jīng)K-S檢驗(yàn)數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，可采用百分位數(shù)法。結(jié)合該項(xiàng)目的臨床特點(diǎn)取第95百分位數(shù)測(cè)試結(jié)果作為其參考上限，建立C反應(yīng)蛋白參考區(qū)間：作為非特異性炎癥指標(biāo)時(shí)為0.00～10.00mg/L；用于評(píng)價(jià)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)時(shí)為0.00～1.00mg/L。

3.小結(jié)

產(chǎn)品的參考區(qū)間跟臨床用途緊密聯(lián)系。產(chǎn)品的目標(biāo)人群、使用環(huán)境、樣本類型及要求、檢測(cè)結(jié)果的預(yù)期用途等，都影響著參考區(qū)間的確立[13]。在往常的申報(bào)材料中，企業(yè)針對(duì)參考區(qū)間的研究和認(rèn)識(shí)程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠；甚至是上市后，臨床醫(yī)生的使用過(guò)程中容易跟其他概念混淆。很多企業(yè)并不理解參考區(qū)間的建立、轉(zhuǎn)移/驗(yàn)證的原則，花費(fèi)了大量的時(shí)間和精力去建立常規(guī)試劑盒的參考區(qū)間；在建立入排標(biāo)準(zhǔn)、分組情況時(shí)，未能依照產(chǎn)品的個(gè)性化需求入組符合要求的“健康人群”；不懂統(tǒng)計(jì)方法，無(wú)法識(shí)別數(shù)據(jù)中的錯(cuò)誤；更有企業(yè)納入了大量低于線性范圍的數(shù)據(jù)，導(dǎo)致整個(gè)驗(yàn)證結(jié)果不科學(xué)等[10]。正確了解參考區(qū)間建立的準(zhǔn)則與方法，理解和把握整個(gè)研究資料的編寫(xiě)要點(diǎn)，有助于企業(yè)提高自身研發(fā)能力，優(yōu)化產(chǎn)品的臨床性能，科學(xué)合理地評(píng)價(jià)產(chǎn)品，加快產(chǎn)品上市的步伐。