陳夢(mèng)婷，邱 玲，杜蒙育，徐小瑩，韋雪敏，崇小文，溫紅玲

發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)是發(fā)熱伴血小板減少綜合征(sever fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)的病原體，SFTS病死率可達(dá)30%[1]，被列為世界衛(wèi)生組織建議優(yōu)先緊急研究的十大傳染病之一[2]。SFTS一旦暴發(fā)會(huì)給人類生命健康帶來極大危害，是中國和其他流行國家的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題。2021年該病毒被國際病毒分類委員會(huì)重新命名為大別班達(dá)病毒(Dabie bandavirus)[3]。

SFTSV是單股負(fù)鏈分節(jié)段RNA病毒，基因組由大(L)、中(M)、小(S)3個(gè)片段組成[4]，其中M片段編碼的囊膜糖蛋白前體經(jīng)宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白酶修飾后形成N端糖蛋白(glycoprotein n, Gn)和C端糖蛋白(glycoprotein c, Gc)[5]。Gn在病毒的組裝、病毒顆粒的形成和吸附新的宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]，可與細(xì)胞表面蛋白的非肌球蛋白重鏈ⅡA結(jié)合，從而提高病毒早期感染效率[7]。糖蛋白介導(dǎo)了病毒結(jié)合并進(jìn)入宿主細(xì)胞的復(fù)制周期的第一步，是中和抗體的主要靶點(diǎn)[8-9]。

三維結(jié)構(gòu)建模分析表明，SFTSV Gn頭域折疊成一個(gè)三角形結(jié)構(gòu)，由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)子域構(gòu)成，子域Ⅰ和Ⅱ支撐著在頂部突出的子域Ⅲ[10]。所有可被識(shí)別的B細(xì)胞表位(B cell epitopes, BCEs)都位于SFTSV Gn的表面，確定的5個(gè)BCEs中有3個(gè)位于SFTSV Gn頭域中的子結(jié)構(gòu)域Ⅱ[11]。本課題組前期研究結(jié)果表明SFTSV分離株JS2011-013-1感染Vero細(xì)胞無明顯細(xì)胞病變，經(jīng)多次傳代后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，比對(duì)兩毒株基因序列發(fā)現(xiàn)Gn只有第323位氨基酸發(fā)生突變(I323V)[12]，且該氨基酸位于子結(jié)構(gòu)域Ⅱ，推測(cè)該位點(diǎn)可能是影響病毒毒力的重要氨基酸位點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)SFTSV可引起細(xì)胞自噬并利用自噬通路進(jìn)行病毒的組裝和釋放[13]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein Ⅰ light chain 3, LC3)是目前公認(rèn)的自噬標(biāo)志物[14]，SQSTM1(Sequestosome 1, p62)是自噬降解的指標(biāo)[15]。因此，本研究檢測(cè)SFTSV Gn及其關(guān)鍵氨基酸突變(I323V)引起細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p62及LC3表達(dá)水平的變化情況，以確定其對(duì)細(xì)胞自噬的影響。

本研究通過實(shí)現(xiàn)Gn和Gn(I323V)的真核表達(dá)，進(jìn)而檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活性、病毒復(fù)制和細(xì)胞自噬的影響以及兩者之間的差異，結(jié)合預(yù)測(cè)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究SFTSV Gn的結(jié)構(gòu)與功能以及發(fā)現(xiàn)抗病毒藥物靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞、毒株、載體和抗體 SFTSV毒株JS2011-013-1由江蘇省疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)；Vero細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室傳代保存；BSR-T7/5細(xì)胞(金黃倉鼠腎細(xì)胞)由武漢病毒所彭珂教授課題組惠贈(zèng)；真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)購自武漢淼靈公司；人源SFTSV Gn蛋白單克隆抗體由武漢大學(xué)于學(xué)杰教授課題組惠贈(zèng)[11]；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體購自美國Proteintech公司；鼠抗p62抗體購自abcam公司；鼠抗LC3B抗體購自CST公司；鼠抗β-actin抗體、羊抗鼠抗體購自中杉金橋公司。

1.1.2 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒(E.Z.N.Z.TMViral RNA Ki)購自美國OMEGA公司； Evo M-MLV Plus cDNA合成試劑盒、OK Clon DNA連接試劑盒購自艾科瑞公司；高保真酶(KOD-Plus-)購自TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、XbaⅠ購自TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自上海昂羽公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自Thermo公司；qRT-PCR一步法熒光定量專用預(yù)混液購自諾唯贊公司。

1.2 SFTSV Gn蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 以突變后的SFTSV Gn蛋白序列為模板，在SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線網(wǎng)址上進(jìn)行同源建模，并將輸出的模型在PyMOL軟件中進(jìn)行分析。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)SFTSV毒株和質(zhì)粒pcDNA3.1(+)序列，利用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)同源重組克隆及重疊延伸PCR原理設(shè)計(jì)引物，序列見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.7 建議與意見 問卷學(xué)生認(rèn)為，目前學(xué)校開展的課外活動(dòng)，形式單一，激發(fā)不了大家的積極性。他們希望學(xué)校多組織開展有意義、有趣味、有吸引力、貼近生活、不刻板形式化、能培養(yǎng)創(chuàng)新能力的課外活動(dòng)，如：三觀教育、實(shí)踐活動(dòng)、戶外運(yùn)動(dòng)等；學(xué)生希望擴(kuò)大課外活動(dòng)的參與面，而不總是固定的那幾個(gè)學(xué)生參加活動(dòng)；學(xué)生周末空閑時(shí)間較多，有希望學(xué)校周末開放體育館、提供鍛煉場(chǎng)地的訴求。學(xué)生還反映在校生學(xué)風(fēng)不夠好，“低頭族”群體大，部分學(xué)生素質(zhì)較低、生活習(xí)慣較差等。有的學(xué)生也提出對(duì)學(xué)校沒有門禁、存在安全隱患的擔(dān)心。

表1 擴(kuò)增目的片段引物信息Tab.1 Primer information for amplification of the target fragment

1.4 SFTSV Gn基因的擴(kuò)增和鑒定 提取SFTSV總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以Gn F和Gn R為引物合成Gn；以Gn F和Gn(I323V) R為引物合成Gn1，以Gn(I323V) F和Gn R為引物合成Gn2，再以Gn1和Gn2為模板合成Gn(I323V)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)一步測(cè)序分析。

1.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產(chǎn)物以及經(jīng)Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒通過膠回收進(jìn)行純化，無縫克隆法連接質(zhì)粒和目的片段。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板后挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將雙酶切鑒定正確且測(cè)序結(jié)果一致的重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)。

1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞及相關(guān)檢測(cè)

1.6.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞 將BSR-T7/5細(xì)胞接種到24孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，PBS清洗3次，每孔加入1 mL Opti-MEM。分別將50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基與1.5 μL轉(zhuǎn)染試劑和1 μg重組質(zhì)粒充分混勻，同時(shí)稀釋空載體pcDNA3.1(+)設(shè)置為對(duì)照組；將上述兩管預(yù)混液輕輕混勻后在室溫孵育10～15 min后加入孔板，培養(yǎng)5 h后將培養(yǎng)液換成含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6.2 間接免疫熒光檢測(cè) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，用預(yù)冷的80%丙酮-20 ℃固定12 h以上，PBS洗滌3次后加入1∶750稀釋的人源SFTSV Gn蛋白單克隆抗體，37 ℃孵育1 h?；厥找豢购驪BS洗3次，加入1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的二抗，37 ℃避光孵育1 h，棄去二抗。加入適量DAPI染液室溫孵育5 min，PBS洗3次。熒光顯微鏡下觀察。

1.6.3 Western Blot檢測(cè) 提取轉(zhuǎn)染48 h后的BSR-T7/5總蛋白，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液100 ℃沸水浴10 min使蛋白變性。電泳后將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜，0.5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜3次；加入一抗孵育過夜，TBST洗膜3次；加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗，搖床孵育1 h，TBST洗膜3次?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，之后在Image J(https://ij.imjoy.io/)在線網(wǎng)址對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.6.4 CCK-8檢測(cè) 將BSR-T7/5細(xì)胞接種到96孔板中，共分為空白組、轉(zhuǎn)染空載體組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h，棄去原培養(yǎng)液，避光加入含10% CCK-8試劑的維持液，37 ℃孵育1 h。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)。根據(jù)公式：細(xì)胞存活率(%)=[A(實(shí)驗(yàn))-A(空白)]/[A(對(duì)照)-A(空白)]×100%計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.6.5 qRT-PCR檢測(cè) 將BSR-T7/5細(xì)胞接種到24孔板中，分組同1.6.4，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，按MOI=1的劑量接種SFTSV，分別在接毒后的0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h收集細(xì)胞和上清，反復(fù)凍融3次后提取病毒RNA，利用qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量檢測(cè)病毒核酸載量并繪制病毒復(fù)制曲線。

2 結(jié) 果

2.1 SFTSV Gn三級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè) 將SFTSV Gn氨基酸序列導(dǎo)入SWISS-MODEL后，平臺(tái)自動(dòng)匹配以5y11.1A[9]晶體結(jié)構(gòu)為模板對(duì)SFTSV Gn進(jìn)行同源建模,序列相似性為99.69%。拉氏圖(圖1B)顯示93.6%的殘基位于允許區(qū)域，5.6%的殘基位于額外允許區(qū)域，表明該模型合理性較好，確定了模型的可靠性。將輸出的模型在PyMOL軟件上進(jìn)行分析，分別將Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ子結(jié)構(gòu)域用紅色、黃色和綠色表示，并用藍(lán)色箭頭標(biāo)示發(fā)生突變的第323位氨基酸(圖1A)。

A：Gn頭域三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型B：預(yù)測(cè)模型拉氏圖圖1 Gn頭域三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型及其拉氏圖Fig.1 Tertiary structure prediction model of Gn head domains and Ramachandran plot

2.2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別可在約1.0 kb、0.8 kb(圖2A)及1.7 kb(圖2B)處見單一條帶，與預(yù)期目的片段大小一致。目的基因與載體pcDNA3.1(+)無縫克隆連接后構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒用Hind Ⅲ/XbaⅠ雙酶切后在凝膠電泳約1.7 kb和5.3 kb的位置各有一條帶(圖2C)，且測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)與預(yù)期完全一致，證明質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)構(gòu)建成功。

注：A為擴(kuò)增Gn(I323V)的上下游片段，1為上游片段Gn1，2為下游片段Gn2；B為擴(kuò)增的目的片段，1為Gn，2為Gn(I323V)；C為重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖，1為 pcDNA3.1(+)-Gn，2為 pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)。圖2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定Fig.2 Construction and identification of eukaryotic expression vectors

2.3 檢測(cè)SFTSV Gn在BSR-T7/5細(xì)胞中的表達(dá) 重組質(zhì)粒及空載體轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞48 h后間接免疫熒光(圖3A)及Western Blot(圖3B)檢測(cè)結(jié)果如圖所示。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)的BSR-T7/5細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見特異性綠色熒光，對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組均未檢測(cè)到熒光。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)組在約61 kDa處均有特異性條帶，與預(yù)期的Gn蛋白大小一致，而細(xì)胞對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組未見此條帶，認(rèn)為SFTSV Gn在BSR-T7/5細(xì)胞中成功表達(dá)。

放大倍數(shù)：200×(比例尺50 μm)A：間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 B：Western Blot檢測(cè)結(jié)果圖3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of BSR-T7/5 transfected with recombinant plasmids

2.4 CCK-8檢測(cè)表達(dá)SFTSV Gn對(duì)BSR-T7/5細(xì)胞活性的影響 根據(jù)吸光度計(jì)算的各組細(xì)胞存活率如圖4，轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Gn組和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)組的細(xì)胞存活率低于轉(zhuǎn)染空載體組(t1=2.80,P<0.05;t2=7.47,P<0.01)，且兩組之間的細(xì)胞存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.60，P<0.01)。

注：① P<0.05，② P<0.01，③ P<0.001。圖4 BSR-T7/5細(xì)胞表達(dá)Gn后細(xì)胞活性檢測(cè)Fig.4 Cell activity detection in BSR-T7/5 cells expressing Gn

2.5 qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)SFTSV Gn對(duì)病毒復(fù)制的影響 利用qRT-PCR測(cè)定表達(dá)Gn及Gn(I323V)后不同時(shí)間點(diǎn)病毒RNA含量并繪制病毒復(fù)制曲線，結(jié)果如圖5，空白組的病毒增殖速率最快，轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn組的病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)特征相似，無明顯差異；而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)組的病毒增殖速率明顯低于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn組。

圖5 病毒復(fù)制曲線Fig.5 Proliferation curve of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus

2.6 Western Blot檢測(cè)SFTSV Gn對(duì)細(xì)胞自噬的影響 重組質(zhì)粒及空載體轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞48 h后，Western Blot檢測(cè)結(jié)果如圖6，與空白對(duì)照組相比，p62與LC3 Ⅱ表達(dá)量均增多(t1=5.460，t2=22.10，t3=7.94，t4=28.08，t5=16.44，t6=20.59，均P<0.05)；與轉(zhuǎn)染空載體組相比，除轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)組的LC3 Ⅱ外，p62與LC3 Ⅱ表達(dá)量均增多(t7=18.07，t8=7.60，t9=6.85，均P<0.05)；表達(dá)Gn組的p62與LC3 Ⅱ表達(dá)量均多于表達(dá)Gn(I323V)組(t10=7.35，t11=5.79，均P<0.05)。

A：自噬相關(guān)蛋白Western Blot圖，B：p62蛋白相對(duì)表達(dá)量，C：LC3B Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量注：①P<0.05，②P<0.01，③P>0.05。圖6 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平Fig.6 Expression of autophagy related proteins

3 討 論

SFTSV是引起SFTS的病原體，該病可引起發(fā)熱、血小板減少、胃腸道及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等。自2009年被發(fā)現(xiàn)以來，我國25個(gè)省份相繼報(bào)道了SFTS病例，且每年呈上升趨勢(shì)[16]。然而該病目前尚無公認(rèn)的特異性治療方法和藥物，更無批準(zhǔn)的人和動(dòng)物的有效疫苗，且發(fā)病機(jī)制以及SFTSV與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制尚不清楚。因此，構(gòu)建表達(dá)Gn及Gn(I323V)的真核表達(dá)載體從而研究其與細(xì)胞的相互作用機(jī)制和對(duì)病毒復(fù)制的影響，進(jìn)一步確定該氨基酸突變的生物學(xué)意義，為研究SFTSV Gn的結(jié)構(gòu)和功能以及抗病毒藥物有效靶點(diǎn)的篩選奠定基礎(chǔ)。

既往研究結(jié)果表明，Gn和Gc可能是SFTSV誘導(dǎo)保護(hù)性免疫最有效的抗原[17]。Wu等[10]提出的在SFTSV表面的錨定模型證實(shí)Gn是理想的疫苗靶點(diǎn)。且將表達(dá)SFTSV各蛋白的質(zhì)粒接種于干擾素受體敲除小鼠后，Gn相比于Gc可誘導(dǎo)較高的中和抗體水平且對(duì)SFTSV感染有更好的保護(hù)作用[18]。BSR-T7/5細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶[19]，進(jìn)而保證Gn蛋白的高效表達(dá)。同源重組克隆技術(shù)無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點(diǎn)可定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)，不依賴于連接酶和磷酸酶，具有省時(shí)、高效的優(yōu)點(diǎn)[20]。

本研究采用同源建模的方法預(yù)測(cè)SFTSV Gn的蛋白結(jié)構(gòu)，確定了突變氨基酸位點(diǎn)的位置，成功構(gòu)建并在BSR-T7/5細(xì)胞中表達(dá)真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)，對(duì)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行功能驗(yàn)證。qRT-PCR結(jié)果顯示過表達(dá)Gn對(duì)病毒復(fù)制無明顯影響，但表達(dá)Gn(I323V)后細(xì)胞增殖速率降低。CCK-8及Western Blot結(jié)果表明表達(dá)Gn和Gn(I323V)可不同程度地降低BSR-T7/5細(xì)胞存活率，且除轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)組的LC3 Ⅱ外，p62與LC3 Ⅱ表達(dá)量均不同程度增多。表明SFTSV Gn可能是通過調(diào)控自噬通量來影響細(xì)胞活性且第323位氨基酸突變(I323V)對(duì)宿主細(xì)胞和病毒復(fù)制有影響。p62是一種多功能結(jié)合蛋白，已被發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)自噬、細(xì)胞存活、細(xì)胞死亡、氧化應(yīng)激、DNA修復(fù)和炎癥等多種細(xì)胞過程[21-24]，提示SFTSV Gn可能還與氧化應(yīng)激、DNA修復(fù)和炎癥等通路相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

對(duì)同屬布尼亞病毒科的漢坦病毒(hantann virus, HTNV)研究結(jié)果表明，HTNV的糖蛋白可通過控制自噬通量來抑制宿主細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)并且可能抑制病毒的復(fù)制[25]。本研究結(jié)果表明過表達(dá)Gn并不影響病毒的復(fù)制，但發(fā)現(xiàn)表達(dá)SFTSV Gn后細(xì)胞自噬流明顯被抑制且細(xì)胞存活率降低，與其研究結(jié)果一致，提示可進(jìn)一步加入自噬調(diào)控的誘導(dǎo)劑和抑制劑，從而提供更堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

反向遺傳技術(shù)是研究RNA病毒分子生物學(xué)、發(fā)病機(jī)制、疫苗和抗病毒藥物的有效工具，可拯救出含有定點(diǎn)突變的毒株進(jìn)而研究突變所引起的病毒生物學(xué)功能的改變。目前已有研究成功構(gòu)建SFTSV反向遺傳系統(tǒng)[26-28]，但本課題組多次嘗試未能成功構(gòu)建SFTSV反向遺傳系統(tǒng)，因此未能從病毒水平上研究Gn第323位氨基酸突變對(duì)SFTSV糖蛋白功能的影響。

綜上所述，SFTSV Gn可能是通過抑制自噬流從而影響細(xì)胞活性且第323位氨基酸突變對(duì)宿主細(xì)胞和病毒復(fù)制有影響，為進(jìn)一步研究SFTSV Gn的結(jié)構(gòu)與功能以及抗病毒藥物提供新的理論依據(jù)。

利益沖突：無