石紅妍，鄭煦暘，張 穎

病毒性出血熱(viral hemorrhagic fevers，VHFs)是一類以發(fā)熱、出血、凝血功能障礙、低血壓休克等為特征的急性傳染病?？梢鹑祟?VHFs 的病毒包括沙粒病毒科病毒(如拉沙病毒)、絲狀病毒科病毒[如埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)和馬爾堡病毒]、布尼亞病毒目病毒[如漢坦病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV)、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)]、黃病毒科病毒[黃熱病毒和登革病毒(Dengue virus，DENV)]，披膜病毒科病毒[如基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)]等。近年來，由于全球氣候變暖、貿(mào)易往來增強、人口流動性增加等因素，導(dǎo)致上述病毒流行地域擴(kuò)大、患病人群增加，嚴(yán)重威脅全球公共衛(wèi)生安全。

病毒入侵時，固有免疫系統(tǒng)反應(yīng)迅速，并在激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。模式識別受體(pattern-recognition receptors, PRRs)是執(zhí)行固有免疫功能的重要分子，可分為膜結(jié)合型和細(xì)胞質(zhì)結(jié)合型，前者包括Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)和C型凝集素受體，后者包括維甲酸誘導(dǎo)基因1樣受體(RIG-I-like receptors，RLRs)、核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide oligomerization domain-like receptors，NLRs)和環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)等。在病毒感染過程中，單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)和自然殺傷細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞以及其他組織細(xì)胞(如上皮細(xì)胞)表達(dá)的PRRs均能識別病毒具有的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)(如病毒核酸、蛋白等)，激活多條免疫信號通路，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和干擾素(Interferon，IFN)的產(chǎn)生，從而引發(fā)抗病毒免疫反應(yīng)[1]。因此，模式識別受體作為固有免疫反應(yīng)的起始環(huán)節(jié)，在抗VHFs免疫反應(yīng)中必將發(fā)揮重要作用。同時，某些病毒蛋白與宿主固有免疫分子相互作用，影響宿主的免疫功能，并與病毒免疫逃逸有關(guān)。以下將以受體類型為序，介紹其在VHFs中的最新研究進(jìn)展。

1 TLRs

TLRs是一類膜蛋白，其特征是胞外區(qū)含有不同數(shù)量的富含亮氨酸重復(fù)序列，并由胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。TLRs是重要的PRRs，可識別表達(dá)于病原微生物的脂磷壁酸、雙鏈RNA、脂多糖、鞭毛蛋白、非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸基序等，通過髓樣分化因子88 (myeloid differentiation factor 88，MyD88)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等信號分子啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活相關(guān)炎性細(xì)胞因子和IFN-I 的基因表達(dá)，誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)。TLRs可分為幾個亞家族，每個亞家族都識別相關(guān)的PAMPs。

1.1 TLRs在登革病毒感染中的作用 George等[2]在小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)急性DENV感染可通過TLR2/MyD88途徑誘導(dǎo)CD4+Foxp3+Treg增殖。Lai等[3]研究發(fā)現(xiàn)DENV感染DC后，線粒體DNA釋放到胞漿中，導(dǎo)致TLR9激活及其下游的MAPK p38和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能促進(jìn)DC遷移和IFN的產(chǎn)生，從而限制病毒的復(fù)制。Chao[4]、Quirino-Teixeira等[5]已報道DENV非結(jié)構(gòu)蛋白1(nonstructural protein1，NS1)可通過TLR4-MyD88途徑誘導(dǎo)血小板活化，這可能是DENV感染期間血小板減少和出血的原因之一。Martinez-Moreno等[6]發(fā)現(xiàn)健康受試者連續(xù)10 d口服維生素D(4 000 IU/d)后，使用DENV-2刺激單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(monocyte-derived DCs，MDDCs)，結(jié)果MDDCs上TLR3、TLR7和TLR9的表達(dá)減少，白細(xì)胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)和白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)水平下降，白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)表達(dá)增加，MDDCs對DENV-2感染的敏感性降低。Parthasarathy等[7]對DENV感染的角膜中TLR表達(dá)的分析顯示，感染后TLR4、TLR7、TLR9和TLR10上調(diào)，可能導(dǎo)致角膜中促炎反應(yīng)加劇。在最近一項關(guān)于DENV和CHIKV混合感染的研究中，Sengupta等[8]發(fā)現(xiàn)TLR7、TLR8受體基因多態(tài)性與機體對DENV的易感性有關(guān)。

1.2 TLRs在漢坦病毒感染中的作用 Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，漢灘病毒(Hantaan virus，HTNV)感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可激活TLR3、RIG-I和MDA5信號通路，并通過下游NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子-7(Interferon regulating factor-7, IRF-7)直接與CXC趨化因子配體10(CXC chemokine ligand-10, CXCL10)的啟動子結(jié)合，導(dǎo)致CXCL10表達(dá)增加，并且CXCL10的升高與腎綜合征出血熱的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。Jiang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HTNV包膜糖蛋白(Gn和/或Gc)可能是激活TLR4的成分。HTNV 感染EVC304細(xì)胞后，TLR4 轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、IFN-β 分泌增多。其機制是 TLR4 通過 MyD88 非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子-3(Interferon regulating factor-3, IRF-3)的細(xì)胞核移位，誘導(dǎo)上述細(xì)胞因子的表達(dá)。

1.3 TLRs在其他出血熱病毒感染中的作用 Ayithan等[11]研究發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒樣顆粒(Ebola virus-like particles，eVLP)通過TLR3和TLR4途徑的MyD88和含Toll樣/白細(xì)胞介素-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域的β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF)兩條信號通路來觸發(fā)宿主免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)一系列有效的抗病毒干擾素刺激基因(Interferon stimulated gene，ISG)和IFN產(chǎn)生。Lai等[12]研究發(fā)現(xiàn)高純度的重組EBOV囊膜蛋白GP能有效地被巨噬細(xì)胞內(nèi)化，通過TLR4途徑誘導(dǎo)IL-6，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-5，白細(xì)胞介素-4, 單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)，TNF-α，白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)，IFN-γ，IL-12等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時促進(jìn)免疫細(xì)胞向引流淋巴結(jié)的遷移，并可能促進(jìn)體內(nèi)CD4+T細(xì)胞的激活和增殖。Li等[13]發(fā)現(xiàn)SFTSV感染通過TLR8-MyD88軸觸發(fā)NF-κB通路。Song等[14]通過對70例急性SFTSV感染者血清動態(tài)變化綜合分析得出，單核細(xì)胞與髓系樹突狀細(xì)胞TLR3表達(dá)的抑制與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。回顧性研究發(fā)現(xiàn)，TLR7、8、9和10的基因多態(tài)性與土耳其CCHF患者的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)[15-18]。

2 RLRs

RLRs是一類重要的模式識別受體，介導(dǎo)IFN-I和其他基因的轉(zhuǎn)錄，激活抗病毒固有免疫反應(yīng)。近期研究表明，病毒和宿主來源的RNA都可以激活RLRs，引起有效的抗病毒反應(yīng)，但如果RLRs活性不受控制，將導(dǎo)致免疫病理損傷。在識別病毒RNA序列后，RLRs類模式識別受體RIG-I和MDA5 N端半胱氨酸天冬氨酸酶激活招募結(jié)構(gòu)域與線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS)相互作用，激活I(lǐng)RF3和IRF7，進(jìn)而與NF-κB一起，誘導(dǎo)IFN-I和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

2.1 RLRs在登革病毒感染中的作用 SIRTs是一類脫乙酰酶家族蛋白，通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，在控制炎癥中發(fā)揮重要作用。Li等[19]在HEK293T細(xì)胞進(jìn)行SIRT6基因干擾和過表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT6通過RLR和TLR3信號通路負(fù)向調(diào)節(jié)DENV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其機制是SIRT6核心區(qū)與NF-κB p65的DNA結(jié)合域相互作用，與p65競爭占據(jù)IL-6啟動子。Kamaladasa等[20]將既往嚴(yán)重登革熱(severe dengue，SD)或既往非嚴(yán)重登革熱(non-severe dengue，NSD)的健康人的單核細(xì)胞與自體血清孵育后，感染全部4種DENV血清型。36 h后結(jié)果顯示，與感染非免疫DENV血清型的NSD患者相比，經(jīng)歷過SD的個體顯示RIG-I、IFN-β1和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3，NLRP3)基因顯著上調(diào)。

2.2 RLRs在漢坦病毒及其他出血熱病毒感染中的作用 Ma等[21]研究表明HTNV感染通過RIG-I-IRF7途徑激活了長鏈非編碼RNA核旁斑組裝轉(zhuǎn)錄物1(lncRNA NEAT1)的轉(zhuǎn)錄，而NEAT1通過解除富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪接因子蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制作用促進(jìn)了RIG-I和DExD/H盒解螺旋酶60的表達(dá)。Kell等[22]研究發(fā)現(xiàn)紫外線滅活病毒在體外未能誘導(dǎo)ISG表達(dá)，而單獨的HTNV核酸片段(S、M和L)的體外轉(zhuǎn)錄 RNA在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時可激活抗病毒轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。因此，病毒基因轉(zhuǎn)錄或復(fù)制過程中未被包被的RNA可能作為RLRs識別的PAMPs，在抗HTNV固有免疫過程中發(fā)揮作用。He等[23]研究發(fā)現(xiàn)EBOV的病毒蛋白24(viral protein24, VP24)能有效地抑制依賴RIG-I和MDA5的I型和III型IFN啟動子的激活。Min等[24]研究表明SFTSV可以通過RLR-MAVS信號途徑(尤其是RIG-I-MAVS)感知病毒感染產(chǎn)生的PAMPs(主要是5’-三磷酸化的RNA)，誘導(dǎo)I型IFN、ISG和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，引起免疫和炎癥反應(yīng)，限制病毒復(fù)制。然而，在RIG-I激活階段，RLR介導(dǎo)的抗病毒信號可以被SFTSV的NSs所拮抗。

3 NLRs

NLRs參與炎癥小體蛋白質(zhì)復(fù)合體的組裝，是機體固有免疫反應(yīng)的重要組成部分。NLRs由保守的NAIP、CIITA、HET-E、NACHT和多達(dá)3個其他特征結(jié)構(gòu)域組成(包括LRR、CARD、PYD或BIR結(jié)構(gòu)域)。目前已在人類發(fā)現(xiàn)了23個NLR基因。部分NLRs(包括NLRP1、NLRP3、NLRC4以及AIM2)通常介導(dǎo)含胱天蛋白酶-1前體(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase 1，pro-caspase-1)的激活而協(xié)助清除病原體。其中NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白以及pro-caspase-1組成。該炎癥小體激活后進(jìn)行組裝，促進(jìn)pro-caspase-1的自我裂解，產(chǎn)生活性亞基p20，引起IL-1β和IL-18的成熟和分泌。

3.1 NLRs在登革病毒感染中的作用 Pan等[25-26]發(fā)現(xiàn)DENV感染促進(jìn)IL-1β釋放，導(dǎo)致小鼠組織血管內(nèi)皮通透性增加和血管滲漏，其機制為DENV M蛋白與NLRP3相互作用，促進(jìn)NLRP3炎癥小體的組裝和激活，從而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放。Shrivastava等[27]發(fā)現(xiàn)DENV-2感染誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1中NLRP3炎癥小體的激活，他們還在HMEC-1中過表達(dá)DENV的NS2A、NS2B蛋白，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)NLRP3炎癥體復(fù)合體的組裝，并通過鈣動員或破壞線粒體電位和誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生而導(dǎo)致caspase-1激活和IL-1β的分泌。Khan等[28]將純化的DENV-2包膜蛋白結(jié)構(gòu)域III(envelope protein III region，EIII)與分化的THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測到上清液和細(xì)胞中IL-1β水平增加。其機制為NLRP3炎癥小體的激活和NF-κB的核轉(zhuǎn)位。Lien等研究發(fā)現(xiàn)：1)DENV和EIII在體外誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，NLRP3炎癥小體抑制劑處理后減輕。與野生型小鼠相比，順序注射EIII和DENV的NS1自身抗體的NLRP3炎癥小體級缺陷小鼠的病理生理變化明顯減輕[29]。 2)DENV和EIII作用于小鼠血小板后，可誘導(dǎo)NLRP3依賴的血小板細(xì)胞死亡和血小板減少[30]。3)DENV的EIII可在體內(nèi)外誘導(dǎo)NLRP3依賴的中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)形成，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[31]。

3.2 NLRs在漢坦病毒及其他出血熱病毒感染中的作用 Ye等[32]研究表明漢坦病毒可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中NLRP3型炎癥小體的形成，這可能是腎綜合征出血熱患者IL-1β水平升高的原因之一。Halfmann等[33]研究發(fā)現(xiàn)EBOV感染導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的激活，隨后分泌IL-1β和IL-18。這一過程依賴于NLRP3炎癥小體復(fù)合體的一個組成部分caspase-1，但不依賴于病毒復(fù)制。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)SFTSV感染誘導(dǎo)依賴BAK/BAX的線粒體DNA釋放觸發(fā)NLRP3炎癥小體激活，發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)患者全血樣本BAK表達(dá)水平與疾病進(jìn)展和死亡結(jié)局相關(guān)。Liu等[34]發(fā)現(xiàn)SFTSV感染人PBMC、巨噬細(xì)胞和C57/BL6小鼠均可激活NLRP3分泌IL-1β。Li等[35]發(fā)現(xiàn)SFTS患者血清中IL-1β顯著升高，與病毒載量呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步在體外用SFTSV感染健康人PBMCs，發(fā)現(xiàn)NLRP3型炎癥小體激活導(dǎo)致IL-1β和IL-18分泌增加。

4 結(jié)語與展望

從前期研究發(fā)現(xiàn)，目前研究出血熱病毒模式識別受體相關(guān)內(nèi)容的研究模式主要有：分子表達(dá)與臨床表現(xiàn)或臨床指標(biāo)的相關(guān)性研究、體外病毒感染(感染動物或培養(yǎng)細(xì)胞)與免疫機制研究、病毒蛋白/核酸等成分與PRRs體外相互作用研究、PRRs基因多態(tài)性研究等。在各種出血熱病毒感染中NLRP3的研究最為廣泛，其原因可能是該分子發(fā)現(xiàn)時間較久，抗體引物等各類研究工具較為成熟。其余PRRs在不同出血熱中的研究結(jié)果差異可能是由于病毒種類、核酸及蛋白結(jié)構(gòu)的不同，但可能也與研究所用的細(xì)胞/動物及進(jìn)行研究的PRRs種類選擇有關(guān)。表1中總結(jié)了目前模式識別受體在VHFs中的部分重要研究信息。

表1 模式識別受體在病毒性出血熱中的研究Tab.1 Research of pattern recognition receptors in viral hemorrhagic fever

目前多數(shù)有關(guān)VHFs中PRRs作用的研究仍有待進(jìn)一步完善，在未來的研究中，可能采取的改進(jìn)優(yōu)化思路有：1)構(gòu)建更加全面反映相關(guān)疾病主要病變(如發(fā)熱、血管滲漏、凝血功能紊亂等)的動物模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行有關(guān)PRRs功能缺失研究(如基因敲除、表達(dá)干擾等)，從而明確在感染發(fā)病中起關(guān)鍵作用的PRRs。2)在基于臨床樣本的研究中，更多的采用基因芯片、單細(xì)胞測序等技術(shù)，較為全面的了解各類PRRs及其下游信號分子在臨床病程中的變化，避免因研究對象選擇而產(chǎn)生結(jié)果的偏向性。3)更多聚焦病毒與機體PRRs相互作用的具體結(jié)構(gòu)成分(如某種蛋白結(jié)構(gòu)域或核酸片段等)及后續(xù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，深入探索不同病毒間關(guān)鍵成分差異對其與PRRs相互作用的影響。另外值得注意的是，TLR基因為代表的部分PRRs的遺傳變異或基因多態(tài)性可能使機體產(chǎn)生對同一病原體的不同先天免疫反應(yīng)，從而影響感染個體的疾病易感性和臨床結(jié)局，將PRRs基因多態(tài)性對其分子結(jié)構(gòu)和功能的影響與臨床表現(xiàn)差異相聯(lián)系，也是一個可能的研究方向。

利益沖突：無