李 莉, 熊海平, 嚴炳清, 田微微, 蔡秀麗

禽流感病毒屬正粘病毒科，有多個血清型，能感染人和多種動物。甲型流感病毒粒子囊膜上的血凝素 (hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)決定了病毒的血清分型。已報道人類感染的的禽流感病毒亞型有H4、H5、H9、H7、H6 和 H10等亞型。值得注意的是，低致病性H5和H7亞型禽流感病毒感染家禽后，經(jīng)常會由于HA基因發(fā)生突變而成為高致病性禽流感病毒[1]，亞型重組病毒的出現(xiàn)使禽流感的防治更加困難。通過分析2019-2021年南通市活禽市場外環(huán)境禽流感病毒的流行特征，了解本地活禽市場禽流感病毒分布特點，掌握禽類相關外環(huán)境中禽流感病毒的檢出狀況和變化趨勢，為高效防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣本來源 本次研究采用了2019-2021年南通市崇川區(qū)、通州區(qū)、海安市、如皋市的活禽市場外環(huán)境禽流感病毒檢測數(shù)據(jù)，采樣選取籠具表面擦拭物，清洗禽鳥類的污水和禽鳥類飲水等外環(huán)境標本，采好的標本用3 mL的病毒保存液裝載，并置4 ℃條件下保存，于 24 h 內(nèi)送實驗室進行核酸檢測。

1.1.2 試劑核酸 提取試劑盒，上海之江生物科技股份有限公司；流感病毒(甲、乙型)雙重核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)，國械注準20193400100，深圳生科原生物股份有限公司；人感染H7N9禽流感病毒RNA檢測試劑盒(熒光PCR探針法)、禽流感病毒H9亞型核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)，粵食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20040999號，中山大學達安基因股份有限公司；禽流感病毒H5N1亞型核酸檢測試劑盒(熒光RT-PCR法)，江蘇達伯藥業(yè)有限公司。

1.1.3 儀器核酸 提取儀器：上海之江生物EX3600全自動核酸提取儀。核酸擴增儀器：Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System。

1.2 方 法

1.2.1 檢測方法 標本采集后在4 ℃條件下48 h內(nèi)送至實驗室，采用實時熒光反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)對標本進行甲型流感(FluA)核酸檢測，陽性樣本再進行H7、H9、H5亞型檢測；50 ℃ 15 min，95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，58 ℃(H7) / 55 ℃(H9) 45 s，45個循環(huán)。42 ℃ 20 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，51 ℃ 40 s，40個循環(huán)(H5)。具體檢測依據(jù)參照《江蘇省環(huán)境及職業(yè)從業(yè)人群動物流感監(jiān)測方案》。

1.2.2 統(tǒng)計學分析 采用 Excel 2013軟件錄入并整理全部檢測數(shù)據(jù)，應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各組陽性率之間的比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 總體監(jiān)測情況 2019-2021年隨機采集南通市崇川區(qū)、通州區(qū)、海安市、如皋市的活禽市場外環(huán)境樣本650份。甲型禽流感病毒核酸陽性率為21.69%(141/650)。其中H5亞型陽性率為0.62%(4/650)、H7亞型陽性率為0.31%(2/141)、H9亞型陽性率為18.62%(121/650)、混合亞型(樣品中無H亞型，只有N2、N6、N8、N9亞型)陽性率為2.15%(14/650)(表1)。

2.2 地區(qū)分布 崇川區(qū)檢出甲型禽流感病毒核酸陽性樣本52份，陽性率為 32.50%(52/160)；通州區(qū)檢出陽性樣本30份，陽性率為18.18%(30/165)；海安市檢出陽性樣本0份，陽性率為0(0/165)；如皋市檢出陽性樣本59份，陽性率為36.88%(59/160)；各監(jiān)測地區(qū)禽流感病毒核酸陽性率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=79.619，P<0.001)。除海安市，崇川區(qū)、通州區(qū)、如皋市的H9亞型陽性率均高于H5和H7亞型。通州區(qū)的混合亞型陽性率(5.45%)高于其他監(jiān)測點，各監(jiān)測點的不同亞型陽性率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=27.623，P<0.001)，見表1。

表1 2019-2021年南通市活禽市場外環(huán)境標本禽流感病毒陽性率地區(qū)分布情況Tab.1 Regional distribution of avian influenza virus positivity rates outside live poultry markets in Nantong City, 2019-2021

2.3 時間分布 2019-2021年南通市活禽市場禽流感病毒核酸檢出率逐年升高。H5和H7型集中在每年第一季度出現(xiàn)，H9分布在全年4個季度中，并在第四季度中陽性率達到最高。2019-2021年的4個季度中檢出禽流感病毒核酸陽性率分別為15.00%(52/160)、20.50%(41/200)、25.63%(41/160)、26.92%(35/130)，各季度陽性率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.937，P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 2019-2021年南通市活禽市場禽流感病毒核酸檢出率Fig.1 Nucleic acid detection rate of avian influenza virus in live poultry markets of Nantong City, 2019-2021

表2 2019-2021年南通市活禽市場外環(huán)境禽流感病毒陽性率各季度分布情況Tab.2 Seasonal distribution of avian influenza virus positivity rate outside live poultry markets in Nantong City, 2019-2021

2.4 標本類型分布 共采集禽鳥籠具表面、宰殺或擺放禽肉案板表面、禽鳥糞便或肛拭子、清洗禽鳥類的污水、禽鳥類飲水、禽鳥內(nèi)臟共6大類樣本。禽鳥內(nèi)臟樣本陽性率最高，達到 50.00%；其次是宰殺或擺放禽肉案板表面擦拭子，陽性率為 40.57%；禽鳥糞便或肛拭子的陽性率最低14.36%；各類標本的陽性率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=40.041，P<0.001)，見表3。

表3 2019-2021年南通市活禽市場外環(huán)境禽流感病毒陽性率樣本類型分布情況Tab.3 Distribution of avian influenza virus positive samples in the environment inlive poultry markets in Nantong City, 2019-2021

3 討 論

自2018年11月江蘇省首次報告人感染H5N6亞型禽流感病例以來，H9N2 和 H5N6 病毒是目前江蘇省活禽市場主要流行的禽流感病毒[1]。此次研究顯示，南通市活禽市場的主要流行的禽流感病毒亞型和與全省情況相符，其中H9亞型的陽性率在地區(qū)分布和時間分布上都是最高。H5和H7亞型禽流感病毒的陽性率與全省的低流行水平一致[2]，且只在崇川區(qū)的活禽市場中零星出現(xiàn)。

地區(qū)分布顯示，南通市的如皋市活禽市場中禽流感病毒陽性率高于其他3個監(jiān)測地區(qū)，各監(jiān)測地區(qū)活禽市場外環(huán)境禽流感病毒檢出率差異較大，陽性率在0～36.88%，監(jiān)測地區(qū)陽性率按地理方位由北向南依次降低。海安市的陽性檢出率為0，可能與當?shù)鼗钋菔袌銮鍧嵪绢l率及活禽市場準入規(guī)定有關，需做進一步調(diào)查研究。

從季度分布看，2019-2021年南通市活禽市場禽流感病毒核酸檢出率逐年升高?；钋菔袌龅腍5和H7型集中在每年第一季度出現(xiàn)，H9分布在全年四個季度中，并在第四季度中陽性率達到最高。提示冬春季節(jié)為活禽市場禽流感重點防控時節(jié)[3-4]。

不同標本類型結果顯示，禽流感病毒外環(huán)境污染程度存在明顯差異，其中禽鳥內(nèi)臟樣本陽性率和宰殺或擺放禽肉案板表面擦拭子陽性率最高，即污染程度最嚴重，這與梅州市、衢州市、珠海市的調(diào)查結果[5-7]一致。提示在進行市場環(huán)境清潔消毒時，應將宰殺或擺放禽肉案板表面和清理禽類內(nèi)臟作為重點消毒對象。海安市與如皋市均有三種樣本采集數(shù)無，可能與各地區(qū)不同的生活習慣和方式有關，該些地區(qū)應規(guī)范管理活禽市場，增加采樣種類。

綜上所述，各類型動物流感對人類的潛在威脅持續(xù)存在[8-9]。為及時分析環(huán)境及動物中流感病毒的變異情況及分布特點，掌握禽流感病毒致病力和傳播力的變化，應繼續(xù)加強禽流感病毒病原學的監(jiān)測力度，根據(jù)監(jiān)測結果制定綜合性的防控措施；切實做好活禽市場禽流感防控工作，降低人群感染的風險。

利益沖突：無