湯憲時(shí)，梁幼生，許永良，吳瀟瀟，季文翔，仝德勝

華支睪吸蟲成蟲多寄生于宿主肝膽管內(nèi)，蟲體的機(jī)械性刺激和排泄分泌產(chǎn)物可導(dǎo)致宿主肝臟長期慢性損傷，引起肝內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，激活肝星狀細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，引發(fā)宿主肝纖維化病變[7]。已有研究在各種華支睪吸蟲感染的動(dòng)物模型上觀察到華支睪吸蟲感染致肝纖維化和肝星狀細(xì)胞的激活[8-9]。華支睪吸蟲感染晚期可導(dǎo)致肝功能衰竭和門脈高壓，很可能與肝癌和膽管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)[10-12]。因此早期有效地抑制和逆轉(zhuǎn)肝纖維化對(duì)華支睪吸蟲病臨床治療有重要意義。

青蒿琥酯(artesunate，ART)和雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)是具有倍半萜結(jié)構(gòu)的青蒿素的衍生物，不僅是高效抗瘧藥[13]，而且具有抗纖維化作用。研究表明，青蒿琥酯能抑制肝星狀細(xì)胞增殖，對(duì)四氯化碳致大鼠肝纖維化、大鼠免疫性肝纖維化以及日本血吸蟲誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化具有拮抗作用[14-16]。雙氫青蒿素能夠改善膽管結(jié)扎導(dǎo)致的大鼠和小鼠肝纖維化病理改變[17-18],也能夠緩解四氯化碳導(dǎo)致的纖維化肝臟門脈高壓[19]。本研究在小鼠華支睪吸蟲病模型基礎(chǔ)上，觀察、評(píng)估兩種青蒿素衍生物對(duì)華支睪吸蟲所致肝纖維化的治療作用，為探索華支睪吸蟲病藥物治療方法和拓展青蒿素臨床應(yīng)用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及麥穗魚 SPF級(jí)BALB/c小鼠(6周齡)購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于江蘇省血吸蟲病防治研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的飼養(yǎng)及取材均遵守《江蘇省寄生蟲病研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》。含華支睪吸蟲囊蚴的麥穗魚捕撈于江蘇省徐州市睢寧縣野外淡水環(huán)境。

1.1.2 主要儀器及試劑 ND-2L型球磨機(jī)(南京南大天尊電子有限公司)；JC301攪拌器(浙江蘇泊爾股份有限公司)；80目標(biāo)準(zhǔn)篩(河北海吉金屬絲網(wǎng)制造有限公司)；組織切片機(jī)(北京軒泰儀公司)；切片刀(德國Leica公司)；Nanodrop 2000 熒光分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；PCR儀(德國Eppendorf公司)；LightCycler480熒光定量PCR儀(美國BD公司)；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；恒溫箱(北京樂普納科技有限公司)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；AU680全自動(dòng)生化分析儀(美國Beckman公司)。青蒿琥酯(桂林南藥股份有限公司)；雙氫青蒿素(重慶華立武陵山制藥有限公司)；聚氧乙烯蓖麻油(美國Sigma公司)；吡喹酮(美國Sigma公司)；氯化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；胃蛋白酶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；鹽酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；多聚甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；石蠟(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；二甲苯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；正丁醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；HE染色試劑盒(索萊寶科技有限公司)；Masson染色試劑盒(索萊寶科技有限公司)；Trizol試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司)；HiScript○R兩步法qRT-PCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；AceQ○R通用型高特異性染料法定量PCR檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；RT-PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；BCA試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；脫脂奶粉(碧云天生物科技有限公司)；Tris(碧云天生物科技有限公司)；甘氨酸(碧云天生物科技有限公司)；SDS(碧云天生物科技有限公司)；SDS-PAGE預(yù)制膠(碧云天生物科技有限公司)；α-SMA一抗(英國Abcam公司)；Collagen Ⅰ一抗(美國Affinity Biosciences公司)；Collagen Ⅲ一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；GAPDH一抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；HRP 羊抗兔二抗(碧云天生物科技有限公司)；HRP羊抗鼠二抗(碧云天生物科技有限公司)；HRP化學(xué)發(fā)光液(美國Affinity Biosciences公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(上海復(fù)星診斷科技有限公司)；堿性磷酸酶測定試劑盒(上海復(fù)星診斷科技有限公司)；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 華支睪吸蟲囊蚴收集 清洗數(shù)條麥穗魚，刮鱗，取肌肉組織，用攪拌器打碎，置于2 000 mL燒瓶中。配制胃蛋白酶消化液(NaCl 12 g，胃蛋白酶10 g，加入單蒸水溶解定容至1 000 mL，用鹽酸調(diào)pH值至 2.0)。向燒瓶中加入胃蛋白酶消化液1 000 mL，攪拌均勻，37 ℃恒溫箱中消化5 h，利用磁力攪拌器幫助消化。消化處理后，通過80目篩網(wǎng)過濾至1 000 mL量杯中，加生理鹽水至滿，靜置1 h，去上清，重復(fù)上述步驟3次，達(dá)到純化效果，收集沉淀物。顯微鏡下觀察、挑取、計(jì)數(shù)華支睪吸蟲囊蚴，保存于4 ℃生理鹽水中，當(dāng)天使用。

1.2.2 華支睪吸蟲病小鼠模型建立 BALB/c小鼠10只，雄性，6周齡，體重(20±0.5) g。小鼠飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組小鼠每只經(jīng)口灌胃感染約30個(gè)華支睪吸蟲囊蚴，對(duì)照組小鼠以生理鹽水灌胃。飼養(yǎng)30 d后，鏡下查感染囊蚴小鼠的糞便蟲卵,將蟲卵陽性的小鼠麻醉處死，留取肝組織，一部分置于-80 ℃冰箱保存，用于提取小鼠肝臟總蛋白質(zhì)和Western blot檢測，一部分置于4%多聚甲醛固定，用于HE和Masson染色，評(píng)估實(shí)驗(yàn)組小鼠肝纖維化程度以及模型是否成功。

1.2.3 藥物治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 6周齡雄性BALB/c小鼠35只，每只經(jīng)口灌胃感染約30個(gè)華支睪吸蟲囊蚴，飼養(yǎng)30 d后，鏡下查小鼠糞便蟲卵，將蟲卵陽性的小鼠隨機(jī)分為7組，分別為青蒿琥酯組(ART組)、氯化鈉組(NaCl組)、吡喹酮組(PZQ組)、(吡喹酮+青蒿琥酯)組[(PZQ+ART)組]、雙氫青蒿素組(DHA組)、聚氧乙烯蓖麻油組(EL組)、(吡喹酮+雙氫青蒿素)組[(PZQ+DHA)組]，每組5只,見表1。各組小鼠于室溫20～25 ℃下飼養(yǎng)，相對(duì)濕度約60%，光照每12 h明暗交替，小鼠自由飲食。給藥結(jié)束后，各組小鼠麻醉后眼球采血處死，無菌留取肝組織，置于-80 ℃冰箱保存，用于提取小鼠肝臟的總RNA和蛋白質(zhì)。

表1 藥物治療動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組Tab.1 Animal groupings according to different drug treatments

1.2.4 蘇木素-伊紅(HE)和Masson三色染色 小鼠解剖時(shí)快速將形態(tài)完好的肝組織放入4 %多聚甲醛固定液中4 ℃固定，1周后進(jìn)行肝臟組織脫水透明、石蠟包埋切片，分別按照HE和Masson染色試劑盒說明書進(jìn)行染色操作，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織病理變化和膠原增生情況。

3.合理的收入是影響員工幸福感的基本因子。有實(shí)驗(yàn)研究表明，一個(gè)國家中最富有的階層不一定是最幸福的階層。也就是說，收入水平與幸福感之間并不是直線關(guān)系，而是曲線關(guān)系。通常來說，當(dāng)一個(gè)人對(duì)最基本的溫飽問題都得不到滿足的時(shí)候，那么他不可能感到幸福。因此，一個(gè)人在基本需求得到滿足之前，會(huì)因?yàn)槭杖氲闹鸩教岣?，其幸福感也?huì)相對(duì)得到相應(yīng)的提升。相反，當(dāng)一個(gè)人的基本需求得到滿足，收入的提高卻并沒有給他帶來更大的幸福感，有成衰減的態(tài)勢，并且工資薪水越高，越明顯，有時(shí)甚至可以忽略不計(jì)。

1.2.5 肝組織α-SMA、TGF-β、Col I、Col III mRNA表達(dá)檢測 取100 mg小鼠肝臟組織，按試劑說明書以Trizol法提取肝臟總RNA，用Nanodrop 2000 紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度，去除其中基因組DNA后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。運(yùn)用Oligo6軟件設(shè)計(jì)通過熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因CollagenⅠ(ColI)、CollagenIII(ColIII)、TGF-β、α-SMA和管家基因β-actin的引物(表2)。反應(yīng)體系(20 μL)為： cDNA 1 μL， 2×預(yù)混液10 μL，上、下游引物濃度10 μmol/L, 各0.4 μL，去RNA酶水8.2 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。以ΔΔCT法相對(duì)定量各基因mRNA表達(dá)，并進(jìn)行相對(duì)量的計(jì)算和分析。

1.2.6 肝組織α-SMA、Col I、Col III蛋白表達(dá)檢測 取20～40 mg解凍的小鼠肝臟組織，放入4 ℃ RIPA裂解液中研磨，冰上裂解2 h，離心取上清，為可溶性肝臟蛋白，以BCA法測定蛋白濃度。按照Western Blot操作步驟依次進(jìn)行蛋白變性、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，4 ℃管家基因GAPDH和目標(biāo)蛋白α-SMA、Col I、Col III抗體孵育12 h、二抗孵育、化學(xué)發(fā)光、曝光拍照。使用Image J軟件標(biāo)示各蛋白條帶灰度值，計(jì)算各基因蛋白表達(dá)量。以GAPDH蛋白表達(dá)量為基準(zhǔn)，比較各組小鼠肝臟各目標(biāo)基因的相對(duì)蛋白表達(dá)。

表2 基因表達(dá)檢測引物序列Tab.2 Sequences of primers for gene expression detection

1.2.6 肝功能檢測 采集各組小鼠眼球靜脈血1 mL，37 ℃恒溫箱中靜置1 h，分離血清。分別選擇丙氨酸底物法、天門冬氨酸底物法和NPP底物-AMP緩沖液法檢測小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)含量，嚴(yán)格遵循各試劑盒說明書開展上機(jī)檢測。

2 結(jié) 果

2.1 華支睪吸蟲感染小鼠肝纖維化模型建立

2.1.1 染色結(jié)果 HE染色(圖1a)顯示，未感染華支睪吸蟲小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，輪廓清晰，肝細(xì)胞大小均一，染色均勻，呈輻射狀排列在中央靜脈周圍，無變性壞死，匯管區(qū)無異常。感染組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，紊亂，肝索結(jié)構(gòu)消失，中央靜脈充血明顯，周圍的肝細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)周圍出現(xiàn)大量膠原纖維，內(nèi)部可見蟲卵(圖1b、c)，Masson染色(圖1d)顯示匯管區(qū)肝組織中纖維化明顯，圍繞蟲卵沉積排列。

注：a為未感染組(HE，100×)；b為感染組(HE，100×)；c為感染組(HE，400×)；d為感染組(Masson，400×)。圖1 感染華支睪吸蟲小鼠肝組織病理學(xué)改變和膠原增生情況Fig.1 Pathological changes and collagen hyperplasia of liver tissue in mice infected with Clonorchis sinensis

2.1.2 Western Blot結(jié)果 感染組小鼠肝臟Col III表達(dá)量(1.26±0.01)高于未感染組(0.75±0.14)(t=2.01,P<0.05)，而感染組的Col I(0.54±0.17)和α-SMA(0.49±0.007)表達(dá)量與未感染組(0.59±0.18、0.78±0.2)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

注：與未感染組比較，*P<0.05圖2 感染和未感染華支睪吸蟲小鼠肝組織Col I、Col III、α-SMA蛋白表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of Col I, Col III and α-SMA in liver tissues in mice with or without Clonorchis sinensis infection

2.2 小鼠肝組織ColI、α-SMA、TGF-β、ColIII基因mRNA表達(dá)水平 熒光定量PCR結(jié)果(圖3)顯示，接受ART治療的小鼠，各組間(NaCl組、ART組、PZQ組、PZQ+ART組)ColI(1.23±0.84、9.4±11.17、0.84±0.41、0.59±0.41)、α-SMA(3.17±2.33、4.68±2.93、1.84±1.55、0.91±0.37)、TGF-β(3.09±3.27、18.89±19.63、8.39±13.81、1.82±0.74)、ColIII(1.09±0.53、4.89±4.45、0.67±0.31、0.65±0.28)基因mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ColI(tNaClvsART=-4.32,tNaClvsPZQ=0.20,tNaClvsPZQ+ART=0.33,tARTvsPZQ=0.38,tARTvsPZQ+ART=0.39,tPZQvsPZQ+ART=0.30)、α-SMA(tNaClvsART=-0.28,tNaClvsPZQ=0.25,tNaClvsPZQ+ART=0.43,tARTvsPZQ=0.48,tARTvsPZQ+ART=0.64,tPZQvsPZQ+ART=0.29)、TGF-β(tNaClvsART=-2.15,tNaClvsPZQ=-0.72,tNaClvsPZQ+ART=0.17,tARTvsPZQ=0.26,tARTvsPZQ+ART=0.43,tPZQvsPZQ+ART=0.23)、ColIII(tNaClvsART=-3.16,tNaClvsPZQ=0.35,tNaClvsPZQ+ART=0.37,tARTvsPZQ=0.47,tARTvsPZQ+ART=0.47,tPZQvsPZQ+ART=0.03))。接受DHA治療的小鼠，PZQ+DHA組TGF-β基因mRNA表達(dá)水平低于DHA組(t=0.48,P<0.05)，PZQ+DHA組Col III基因mRNA表達(dá)水平高于PZQ組(t=-3.36,P<0.05)，除此之外，各組間(EL組、DHA組、PZQ組、PZQ+DHA組)ColI(1.85±2.49、5.1±4.35、0.84±0.41、3.12±1.97)、α-SMA(2.46±2.97、11.06±16.39、1.84±1.55、3.57±2.57)、TGF-β(4.59±5.57、9.57±6.23、8.39±13.81、2.81±1.8)、ColIII(1.61±1.8、3.72±2.84、0.67±0.31、2.81±1.43)基因mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ColI(tELvsDHA=-0.58,tELvsPZQ=0.18,tELvsPZQ+DHA=-0.22,tDHAvsPZQ=0.43,tDHAvsPZQ+DHA=0.20,tPZQvsPZQ+DHA=-2.73)、α-SMA(tELvsDHA=-1.29,tELvsPZQ=0.09,tELvsPZQ+DHA=-0.16,tDHAvsPZQ=0.25,tDHAvsPZQ+DHA=0.20,tPZQvsPZQ+DHA=-0.55)、TGF-β(tELvsDHA=-0.39,tELvsPZQ=-0.30,tELvsPZQ+DHA=0.14,tDHAvsPZQ=0.08,tDHAvsPZQ+DHA=0.48,tPZQvsPZQ+DHA=0.20)、ColIII(tELvsDHA=-0.52,tELvsPZQ=0.23,tELvsPZQ+DHA=-0.29,tDHAvsPZQ=0.47,tDHAvsPZQ+DHA=0.14,tPZQvsPZQ+DHA=-3.36))。

注：與DHA組比較，*P<0.05(TGF-β);與PZQ組比較，*P<0.05(Col III)。圖3 感染華支睪吸蟲小鼠藥物治療后肝組織Col I、α-SMA、TGF-β、Col III基因mRNA表達(dá)水平Fig.3 mRNA expression levels of Col I, α-SMA, TGF-β and Col III genes in liver tissues in mice infected with Clonorchis sinensis after drug treatment

2.3 小鼠肝組織α-SMA、ColI、ColIII基因蛋白表達(dá)水平 Western Blot結(jié)果(圖4,5)顯示，接受ART治療的小鼠，ART組(0.32±0.04、0.81±0.09)和PZQ+ART組(0.16±0.01、1.02±0.18)的ColI、ColIII蛋白表達(dá)水平都低于NaCl組(1.54±0.38、2.24±0.35)(ColI(tNaClvsART=1.83,P<0.01；tNaClvsPZQ+ART=2.07,P<0.05)、ColIII(tNaClvsART=2.29,P<0.01；tNaClvsPZQ+ART=1.97,P<0.05)，PZQ+ART組的ColI表達(dá)水平低于ART組(t=1.98,P<0.05)。接受DHA治療的小鼠, DHA組(1.00±0.63、0.78±0.43)、PZQ+DHA組(0.66±0.22、1.13±0.26)α-SMA、Col I蛋白表達(dá)水平與EL組(0.62±0.19、1.22±0.18)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(α-SMA(tELvsDHA=-0.98,tELvsPZQ+DHA=-0.1)、Col I(tELvsDHA=1.19,tELvsPZQ+DHA=0.23)。

注：與NaCl組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 感染華支睪吸蟲小鼠ART治療后肝組織Col I、Col III蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of Col I and Col III proteins in liver tissue in mice infected with Clonorchis sinensis after ART treatment

圖5 感染華支睪吸蟲小鼠DHA治療后肝組織α-SMA、Col I蛋白表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of α-SMA and Col I proteins in liver tissue in mice infected with Clonorchis sinensis after DHA treatment

2.4 小鼠肝功能檢測 如圖6A所示，接受ART治療的小鼠，各組血清ALP(62.5±12.92、132±143.41、66.33±13.05、86.66±68.64 U/L)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tNaClvsART=-2.68,tNaClvsPZQ=-0.14,tNaClvsPZQ+ART=-0.93,tARTvsPZQ=0.22,tARTvsPZQ+ART=0.15,tPZQvsPZQ+ART=-0.89)；PZQ組(58±8.71 U/L)血清ALT水平高于NaCl組(33.5±8.1 U/L)(tNaClvsPZQ=-1.51,P<0.05)，與ART組(74±39.94 U/L)和PZQ+ART組(43.66±11.01 U/L)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，NaCl組、ART組、PZQ+ART組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tNaClvsART=-2.49,tNaClvsPZQ=-1.51,tNaClvsPZQ+ART=-0.62,tARTvsPZQ=0.2,tARTvsPZQ+ART=0.37,tPZQvsPZQ+ART=0.94)；ART組(197.75±8.84 U/L)和PZQ+ART組(234.66±42.54 U/L)血清AST水平與NaCl組(150±20.29 U/L)比較明顯升高(tNaClvsART=-1.17,P<0.01;tNaClvsPZQ+ART=-2.08,P<0.05)，PZQ組(195±31.22 U/L)與NaCl組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ART組和PZQ+ART組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tNaClvsART=-1.17,tNaClvsPZQ=-1.1,tNaClvsPZQ+ART=-2.08,tARTvsPZQ=0.15,tARTvsPZQ+ART=-2.08,tPZQvsPZQ+ART=-0.73)。

如圖6B所示，接受DHA治療的小鼠，各組血清ALP(57±7.83、102.5±57、66.33±13.05、65±17.56 U/L)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tELvsDHA=-2.9,tELvsPZQ=-0.59,tELvsPZQ+DHA=-0.51,tDHAvsPZQ=0.31,tDHAvsPZQ+DHA=0.32,tPZQvsPZQ+DHA=0.05)。PZQ+DHA組(29±12.98 U/L)血清ALT水平與EL組(107.25±54.26 U/L)和PZQ組(58±8.71 U/L)比較明顯降低(tELvsPZQ+DHA=0.72,tPZQvsPZQ+DHA=1.92,P均<0.05)，EL組、DHA組(53.5±36.2 U/L)和PZQ組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PZQ+DHA組與DHA組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tELvsDHA=0.49,tELvsPZQ=0.45,tELvsPZQ+DHA=0.72,tDHAvsPZQ=-0.06,tDHAvsPZQ+DHA=0.33,tPZQvsPZQ+DHA=1.92)。PZQ+DHA組(143±27.43 U/L)血清AST水平與EL組(207±42.48 U/L)比較顯著降低(tELvsPZQ+DHA=0.75,P<0.05)，與DHA組(165±17.98 U/L)和PZQ組(195±31.22 U/L)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，EL組、DHA組和PZQ組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tELvsDHA=0.49,tELvsPZQ=0.14,tELvsPZQ+DHA=0.75,tDHAvsPZQ=-0.83,tDHAvsPZQ+DHA=0.61,tPZQvsPZQ+DHA=0.96)。

注：與NaCl或EL組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 感染華支睪吸蟲小鼠藥物治療后血清ALP、ALT、AST水平Fig.6 Serum ALP, ALT and AST levels in mice infected with Clonorchis sinensis after drug treatment

3 討 論

本研究選擇從野生麥穗魚肌肉獲取華支睪吸蟲囊蚴，因?yàn)樾⌒鸵吧~類如麥穗魚感染率高，感染程度重，囊蚴幾乎遍布魚體全身，但以肌肉內(nèi)為最多[20]。華支睪吸蟲囊蚴在終宿主消化道內(nèi)經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶作用，囊壁軟化，十二指腸內(nèi)的膽汁進(jìn)入囊內(nèi)，引發(fā)幼蟲破囊壁而出，童蟲經(jīng)總膽管進(jìn)入肝膽管發(fā)育為成蟲，成蟲蟲卵隨宿主膽汁進(jìn)入小腸，隨糞便排出體外[20]。本研究以30個(gè)囊蚴灌胃小鼠后約30 d在小鼠糞便中發(fā)現(xiàn)蟲卵。發(fā)現(xiàn)蟲卵后30 d，肝臟病理切片顯示肝內(nèi)膽管及周邊組織發(fā)生明顯病變，Masson染色顯示大量膠原纖維藍(lán)染，Western blot結(jié)果顯示Col III顯著增高，確認(rèn)肝臟病變部位周圍出現(xiàn)纖維組織增生，證明華支睪吸蟲所致肝纖維化小鼠模型建立成功，該模型的建立是后續(xù)青蒿素藥物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。

本研究選擇文獻(xiàn)報(bào)道過的用于小鼠肝纖維化治療的青蒿琥酯(ART)和雙氫青蒿素(DHA)劑量濃度和給藥方法。有研究按照60 mg/kg劑量每天腹腔注射ART，連續(xù)2周，較好地早期干預(yù)了日本血吸蟲感染所致小鼠肝纖維化[21]；有研究報(bào)道20 mg/kg的DHA灌胃，1 次/d，共12次，有效抑制膽總管結(jié)扎引起的小鼠肝纖維化和四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化[18-19]。由于本研究選擇在肝纖維化形成過程中全程用藥，連續(xù)用藥30 d，所以本研究降低文獻(xiàn)中ART劑量至20 mg/kg，與DHA相同，用于治療華支睪吸蟲所致小鼠肝纖維化。除此之外，本研究治療組中增加吡喹酮300 mg/kg連續(xù)2 d用藥殺滅肝膽管內(nèi)成蟲，去除繼續(xù)刺激肝臟導(dǎo)致肝纖維化的病因，作為輔助治療增強(qiáng)青蒿素抗纖維化的治療效果。

本研究在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平顯示青蒿素抗華支睪吸蟲所致肝纖維化的有效性。雖然在轉(zhuǎn)錄水平與未治療組相比各ART用藥組纖維化相關(guān)分子指標(biāo)表達(dá)量沒有顯著差異，但在蛋白表達(dá)水平上，ART治療組肝臟膠原蛋白(Col I & III)表達(dá)顯著下降，并且經(jīng)PZQ殺蟲后ART治療可使膠原蛋白(Col I)水平進(jìn)一步顯著下降，證明ART在20 mg/kg劑量下對(duì)華支睪吸蟲所致肝纖維化有治療作用，合并殺蟲對(duì)ART抗纖維化有重要意義。但是各DHA用藥組纖維化分子指標(biāo)無論在轉(zhuǎn)錄還是蛋白表達(dá)水平都與對(duì)照組沒有顯著差異，證明DHA在20 mg/kg劑量下抗華支睪吸蟲所致肝纖維化作用有限，同時(shí)證明沒有青蒿素的抗纖維化作用，PZQ殺蟲本身不能對(duì)肝纖維化治療起到關(guān)鍵作用。本研究部分治療組q-PCR結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差較大，提示組內(nèi)存在個(gè)體差異，這可能與灌胃后囊蚴在各小鼠體內(nèi)存活、發(fā)育為成蟲的數(shù)量以及成蟲發(fā)育程度不均一有關(guān)。ART治療組各纖維化分子指標(biāo)mRNA水平和蛋白表達(dá)量不一致的原因可能是各基因以相同水平轉(zhuǎn)錄后，ART藥物作用使蛋白翻譯水平降低，或者翻譯后由于藥物作用蛋白降解增加。

本研究探討ART和DHA連續(xù)用藥對(duì)小鼠肝功能的保護(hù)作用。與對(duì)照組相比，ART在20 mg/kg劑量下沒有明顯改善小鼠肝功能作用，相反會(huì)引起血清AST的顯著增高。DHA在20 mg/kg劑量下也沒有明顯改善小鼠肝功能，但合并PZQ可以顯著降低血清ALT和AST水平，起到一定程度的保肝作用。PZQ單獨(dú)使用對(duì)肝功能保護(hù)作用不明顯。肝功能檢測結(jié)果提示適當(dāng)降低ART劑量或給藥次數(shù)可能既保證其抗纖維化作用又減少其肝毒性，而加大DHA劑量可能會(huì)更好發(fā)揮其抗纖維化和保肝作用。后續(xù)研究將探索ART和DHA在不同劑量下對(duì)華支睪吸蟲所致肝纖維化和肝功能的作用，將更全面地了解兩種青蒿素衍生物的功能效用和治療作用，為進(jìn)一步探索青蒿素對(duì)肝臟的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

利益沖突：無