李蘇勝，孟錦昕，何于雯，楊振興，李楠，王靜林

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

緣腹細(xì)蜂科昆蟲屬于膜翅目order細(xì)腰亞目寄生部Apocrita (Parasitica)，與廣腹細(xì)蜂科Platygastridae 共同組成廣腹細(xì)蜂總科Platygastroidea。該科昆蟲廣泛分布于世界各地，種類繁多。早在20世紀(jì)90年代，英國(guó)記載的已超過100種，北美記載有600種[1]。在我國(guó)，對(duì)緣腹細(xì)蜂科黑卵蜂屬做的研究相對(duì)較多，報(bào)道了黃斑草毒蛾黑卵蜂(Telenomusgynaephorae)[2]、四川黑卵蜂(TelenomusmanolusNixon)[3]、大竹嵐黑卵蜂(Telenomusdazhulanensis)[4]、油茶枯葉蛾黑卵蜂〔Telenomus(Aholcus)lebedae〕[5]、東方蝗卵蜂(Scelioorientalis)[6]、蘆毒蛾黑卵蜂(Telenomuslaelia)[7]、松毛蟲黑卵蜂(Telenomusdendrolimusi)[8]、古毒蛾黑卵蜂(Telenomusmonticola)[9]、夜蛾黑卵蜂(TelenomusremusNixon)[10]等30余種，并對(duì)其習(xí)性做了一些研究[11]，但其他屬的研究較少，還沒有系統(tǒng)的緣腹細(xì)蜂科或廣腹細(xì)蜂總科綜述性成果發(fā)表[12]。緣腹細(xì)蜂科昆蟲很多種類是農(nóng)業(yè)中的益蟲，它們寄生在蝗蟲、草地貪夜蛾等害蟲的卵上，影響宿主的發(fā)育，并能隨寄主遷移[13]，對(duì)蟲害綠色防控具有重要作用。如夜蛾黑卵蜂已經(jīng)多項(xiàng)研究證實(shí)對(duì)草地貪夜蛾具有控害能力，在拉丁美洲多個(gè)國(guó)家已進(jìn)行規(guī)模飼養(yǎng)并用于夜蛾科害蟲的防治[14]；飛蝗黑卵蜂(SceliouvaroviOgloblin)以東亞飛蝗卵為主要寄主，寄生率為10%～50%，Sceliopembertoni在20世紀(jì)70年代就已被用作昆蟲寄生劑防治中華稻蝗[1]。近年來，云南省暴發(fā)嚴(yán)重的草地貪夜蛾和黃脊竹蝗蟲害，但生物防控方面的措施應(yīng)用較少。本研究采集到一只膜翅目緣腹細(xì)蜂科昆蟲，對(duì)其形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征進(jìn)行描述，以期為蟲害的生物防控技術(shù)和膜翅目昆蟲相關(guān)研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 昆蟲采集

昆蟲于2022年4月在昆明市金殿青龍山一樹林(北緯25°5′35″，東經(jīng)102°45′21″，海拔1900m)，用60目的捕蟲網(wǎng)進(jìn)行采集。采集后將蟲體置于75%酒精中，4℃保存。

1.2 昆蟲形態(tài)特征觀察

于體視顯微鏡(OLYMPUS，SZX7，日本)下，對(duì)昆蟲整體形態(tài)進(jìn)行觀察，然后將蟲體放入1.5mL離心管中，加入250μL緩沖液GA(天根公司)和20μL蛋白酶K(天根公司)，混勻，56℃消化過夜。消化液用于提取核酸。消化后的蟲體用蒸餾水洗2次，每次15min；然后置于10% KOH溶液中60℃腐蝕3h；再依次放入50%、75%、85%、90%乙醇溶液中脫水，每次脫水時(shí)間15min。將蟲體放入丁香油中浸泡過夜，然后將頭、胸、腹切開，制作玻片標(biāo)本，參照《昆蟲分類學(xué)》[15]進(jìn)行形態(tài)觀察。

1.3 昆蟲DNA提取與PCR擴(kuò)增

參照天根公司微量樣品基因組DNA提取試劑盒“從毛囊中提取基因組DNA”的方法，從蟲體消化液中提取DNA。用COⅠ基因特異引物[16]，取2μL DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：ddH2O 16.85μL、10×PCR緩沖液2.5μL、2.5mmol/L dNTP 2μL、上下游引物各0.5μL、Ex Taq酶0.15μL，充分混勻。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃ 30s、54℃ 30s、72℃ 40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，然后送生工生物工程公司測(cè)序。

1.4 序列分析

將測(cè)序獲得的基因序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，用DNAStar MegAlign進(jìn)行同源性分析；用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用最大似然法(ML)，Bootstrap值為1000。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征

在體視顯微鏡下，觀察到蟲體為黑色(圖A)，體型中小型，約2mm，胸部與腹部連接處收縮為細(xì)腰狀，前翅有痣脈；觸角12節(jié)，其中柄節(jié)較長(zhǎng)，柄節(jié)和梗節(jié)之間呈膝狀彎曲，觸角第3-7節(jié)念珠狀，其中第6節(jié)最小，第8-11節(jié)較大、圓隆，第12節(jié)呈圓錐形；產(chǎn)卵器從腹末伸出，有脛節(jié)距1個(gè)。見圖1。

A B C

2.2 COⅠ基因序列分析

COⅠ基因特異引物PCR擴(kuò)增為陽性，測(cè)序獲得475nt的核酸序列。經(jīng)BLAST比對(duì)，在顯示的100條核酸序列中，共有4個(gè)種類，其中與加拿大的膜翅目未指名種Hymenopterasp.(KM996976.1)、廣腹細(xì)蜂科未指名種Platygastridaesp.(KM558316.1)、美國(guó)的緣腹細(xì)蜂科粒卵蜂屬未指名種Gryonsp.(MZ513514.1)、加拿大的緣腹細(xì)蜂科未指名種Scelioninaesp.(KY829883.1)一致性分別為90.43%、90.43%、87.25%、86.62%。選取BLAST比對(duì)結(jié)果中4個(gè)種類，以及緣腹細(xì)蜂科的黑卵蜂屬(genusTelenomus)、粒卵蜂屬(genusGryon)和genusTrissolcus，廣腹細(xì)蜂科的genusFidiobia、genusSynopeas、無脈細(xì)蜂屬(genusAmitus)和廣腹細(xì)蜂屬(genusPlatygaster)，以及分盾細(xì)蜂科、小蜂科的COⅠ基因序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，該昆蟲與緣腹細(xì)蜂科的黑卵蜂屬、粒卵蜂屬和genusTrissolcus同處一個(gè)進(jìn)化分支，其中與粒卵蜂屬的親緣關(guān)系更近；與廣腹細(xì)蜂科分屬兩個(gè)進(jìn)化支系。見圖2。

注：“?feng”代表本次采集的昆蟲。圖2 采集昆蟲COⅠ基因序列(475 nt)系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)公開報(bào)道的緣腹細(xì)蜂科昆蟲研究資料較少，僅黑卵蜂屬等昆蟲的分類及習(xí)性等方面有一些報(bào)道，整體還不系統(tǒng)、不全面。本研究采集到的昆蟲，在體視顯微鏡下觀察呈現(xiàn)緣腹細(xì)蜂科的特征，其中觸角形狀與陳泰魯報(bào)道的撫寧黑卵蜂(Telenomusfuningensis)[4]、油茶枯葉蛾黑卵蜂[6]等黑卵蜂的雌蟲類似，區(qū)別在于本研究中昆蟲的觸角為12節(jié)，黑卵蜂的觸角為11節(jié)。廣腹細(xì)蜂科昆蟲的觸角則為8-10節(jié)[15]。在分子生物學(xué)數(shù)據(jù)方面，該蟲與加拿大報(bào)道的Platygastridaesp.(KM558316.1)同源性最高，在分類上Platygastridaesp.(KM558316.1)屬于廣腹細(xì)蜂科，但從系統(tǒng)發(fā)育樹看，該昆蟲與緣腹細(xì)蜂科處于同一進(jìn)化分支，與廣腹細(xì)蜂科分屬不同進(jìn)化分支，提示該昆蟲可能屬于緣腹細(xì)蜂科，親緣關(guān)系上與粒卵蜂屬更近。該昆蟲COⅠ基因序列與NCBI上公開的核酸序列相比，同源性最高僅90%左右，在形態(tài)學(xué)上與公開報(bào)道的昆蟲有一定差別。本文對(duì)采集到的昆蟲形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征進(jìn)行了描述，可供后續(xù)相關(guān)研究參考。

緣腹細(xì)蜂科很多種類的昆蟲寄生在害蟲卵上，可作為蟲害綠色防控的生物材料。在生態(tài)環(huán)境保護(hù)日趨重要、農(nóng)藥減量增效持續(xù)推進(jìn)的背景下，加強(qiáng)對(duì)緣腹細(xì)蜂科等寄生蜂的研究，對(duì)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)綠色高效發(fā)展具有重要意義。