劉亞杰，李玉娣，黎凱鋒，陳哲鋒，凌莉

卒中是世界范圍內(nèi)致死率和致殘率最高的疾病之一，腦梗死占卒中的60%～80%，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此，迫切需要研究減輕腦梗死后組織損傷、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的藥物。腦梗死的病理損傷機(jī)制非常復(fù)雜，涉及興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等多個方面，這可能是針對單一靶點(diǎn)的藥物臨床療效欠佳的原因。近年來的研究表明，中藥復(fù)方可能作用于腦梗死后病理損傷的多個分子靶點(diǎn)和信號通路，在腦梗死的治療方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[1-3]。補(bǔ)陽還五湯是清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)的經(jīng)典名方，數(shù)百年來在治療急性卒中及其后遺癥方面具有較好的臨床療效?，F(xiàn)代研究表明，補(bǔ)陽還五湯對腦梗死動物模型有明確的神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]。但其作用的分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究采用高通量RNA-Seq技術(shù)分析補(bǔ)陽還五湯對急性腦梗死小鼠缺血腦組織基因表達(dá)的影響，從多個分子靶點(diǎn)的角度闡明補(bǔ)陽還五湯治療小鼠腦梗死的分子機(jī)制，為補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死提供新的思路與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物 補(bǔ)陽還五湯由生黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍5 g、川芎3 g、地龍（去土）3 g、桃仁3 g、紅花3 g組成。本研究中所有中藥飲品均由深圳市中醫(yī)院藥房提供。水煎濃縮成含生藥1.859 g/mL，于4 ℃冰箱保存。根據(jù)人與小鼠等效換算，按18.59 g/kg小鼠體重生藥量每天予小鼠灌胃。

1.2 實驗動物、腦梗死模型制作和實驗分組共購買30只10周雄性C57BL/6J小鼠（體重20±3 g，來自廣東省實驗動物中心）。飼養(yǎng)于溫度20～23 ℃，相對濕度40%～60%的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級動物房，自由進(jìn)食與進(jìn)水。本實驗已通過南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)（動物倫理批號：2022-001）。

參照本課題組前期方法制作左側(cè)永久性大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的小鼠腦梗死模型12只[6]：先予3%水合氯醛腹腔麻醉，在手術(shù)顯微鏡下于左眼裂外側(cè)與左耳根連線中點(diǎn)切開皮膚，分離肌肉，在左側(cè)顴弓根前方顳骨上鉆開一個直徑為1 mm的骨窗，暴露左側(cè)大腦中動脈，在大腦中動脈跨越嗅束的遠(yuǎn)端采用雙極電凝器將其凝閉，然后結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈7 min，逐層縫合切口并常規(guī)消毒。術(shù)后采用電熱毯使小鼠體溫保持在37±0.5 ℃。小鼠麻醉清醒后置于SPF級動物房飼養(yǎng)。

將腦梗死小鼠隨機(jī)分為治療組和模型組（每組6只小鼠），分別從MCAO術(shù)后1 d起每天灌胃生藥量為18.59 g/kg的補(bǔ)陽還五湯或等容積蒸餾水，每天分兩次灌胃，連續(xù)7 d。假手術(shù)組小鼠（6只）僅于同一部位開顱并暴露左側(cè)大腦中動脈，但不作電凝，完畢縫合術(shù)口。

1.3 神經(jīng)功能評分 于治療前和MCAO術(shù)后第7天采用改良神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評分（modified neurological severity scores，mNSS）對各組小鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評估[包括行為測試（偏癱及自由行走）、平衡木測試和反射缺失][7]，評分越高提示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.4 小鼠腦組織RNA提取和cDNA文庫制備MCAO術(shù)后第7天，將治療組和模型組小鼠麻醉后取腦梗死灶周組織，同時取假手術(shù)組小鼠相應(yīng)部位腦組織，使用總RNA抽提試劑提取總RNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（cDNA），對純化的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)，通過PCR擴(kuò)增和純化構(gòu)建cDNA文庫，然后對文庫進(jìn)行質(zhì)檢。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析 文庫構(gòu)建并質(zhì)檢合格后采用Illumina HiSeg 4000平臺進(jìn)行高通量測序（每組3只）。測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾（去除帶接頭的和低質(zhì)量的數(shù)據(jù)）得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)用于分析。本研究采用Hisat 2軟件進(jìn)行基因組比對，采用HTSeq軟件對各樣品的基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，將組間差異基因表達(dá)的閾值設(shè)定為|log2（fold change）|≥0.58，且P＜0.05。

1.6 測序結(jié)果的驗證 為驗證高通量測序結(jié)果的可靠性，本研究采用簡單隨機(jī)法挑選6 個差異表達(dá)基因進(jìn)行定量反轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcriptasemediated PCR，qRT-PCR）驗證（每組6只），引物由上海生因公司合成，使用β-肌動蛋白（β-actin）基因作為內(nèi)部對照（引物序列見表1）。qRT-PCR方法按試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行，使用2-ΔΔCt法計算樣品之間基因的相對表達(dá)水平。

1.7 生物信息學(xué)分析 為了推測補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死的作用機(jī)制，分別對模型組對比假手術(shù)組上調(diào)的基因和治療組對比模型組表達(dá)下調(diào)的基因、模型組對比假手術(shù)組下調(diào)的基因和治療組對比模型組表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行交集，得出補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死后逆轉(zhuǎn)的差異表達(dá)基因，進(jìn)一步對這部分基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。GO分析通過生物過程、細(xì)胞成分、分子功能3個方面來描述基因的功能；KEGG則通過對基因集合進(jìn)行生物通路富集分析來預(yù)測生物學(xué)功能。

表1 驗證的差異表達(dá)基因和內(nèi)參的引物序列

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25～P75）表示，比較采用Kruskal-WallisH檢驗，總體比較以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步兩兩比較選用α分割法，以P＜0.017表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯對小鼠腦梗死神經(jīng)功能評分的影響 治療前，與假手術(shù)組相比，模型組和治療組小鼠mNSS升高，治療組和模型組小鼠mNSS差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MCAO術(shù)后7 d，治療組小鼠mNSS評分低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

2.2 補(bǔ)陽還五湯治療小鼠腦梗死后逆轉(zhuǎn)的差異基因表達(dá)譜 本研究通過高通量RNA-Seq分析獲得治療組、模型組和假手術(shù)組小鼠腦組織樣品的差異基因的表達(dá)譜，各組間差異表達(dá)基因數(shù)如韋恩圖（圖1A）所示。模型組與假手術(shù)組相比，篩選得到1672個差異性表達(dá)的基因（1413個上調(diào)基因和259個下調(diào)基因）（圖1B）；治療組與模型組相比，篩選得到301個差異性表達(dá)的基因（110個上調(diào)基因和191個下調(diào)基因）（圖1C）。

各組間差異表達(dá)基因的交集分析結(jié)果顯示，模型組與假手術(shù)組相比上調(diào)且補(bǔ)陽還五湯治療后下調(diào)的差異基因有134個，而模型組與假手術(shù)組相比下調(diào)且補(bǔ)陽還五湯治療后上調(diào)的差異基因有19個。補(bǔ)陽還五湯逆轉(zhuǎn)腦梗死后的差異基因的層次聚類分析結(jié)果見圖2。

2.3 補(bǔ)陽還五湯治療小鼠腦梗死后逆轉(zhuǎn)的差異基因的驗證 qRT-PCR驗證結(jié)果顯示，模型組小鼠腦梗死灶周Myd88、Map3k8、Lamc2、Il1r1、Tlr9基因的mRNA表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯升高，而補(bǔ)陽還五湯治療后下降；模型組小鼠缺血腦組織中Cxcl10基因的mRNA表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯下調(diào)，而補(bǔ)陽還五湯治療后明顯上調(diào)（圖3）。本研究qRT-PCR驗證結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果完全一致，證實本研究的高通量測序結(jié)果是準(zhǔn)確和可靠的。

2.4 補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死小鼠后逆轉(zhuǎn)的差異基因的GO分析 交集部分的差異基因的GO分析結(jié)果顯示，腦梗死后顯著上調(diào)且補(bǔ)陽還五湯治療后顯著下調(diào)的134個基因顯著富集到508條GO條目，其中生物過程421條，細(xì)胞成分23條，分子功能64條。差異基因主要富集的前10個生物過程包括與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及細(xì)胞死亡密切相關(guān)的“對干擾素β反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞殺傷、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、中性粒細(xì)胞遷移、急性炎癥反應(yīng)、Myd88依賴性Toll樣受體信號通路、參與細(xì)胞發(fā)育的程序性細(xì)胞死亡及自噬”；主要富集的前10個細(xì)胞成分包括主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類蛋白復(fù)合物、高爾基內(nèi)側(cè)池、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口部位、吞噬囊泡、內(nèi)吞囊泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的組成部分、溶酶體、細(xì)胞器膜的組成部分、基底膜及細(xì)胞器膜固有成分；主要富集的前10個分子功能條目包括CD8受體結(jié)合、β2-微球蛋白結(jié)合、Toll樣受體結(jié)合、肽抗原結(jié)合、T細(xì)胞受體結(jié)合、免疫受體活性、堿性氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、IL-1受體結(jié)合、細(xì)胞因子結(jié)合及生長因子受體結(jié)合（圖4A）。

表2 治療前和MCAO術(shù)后7 d三組小鼠神經(jīng)功能評分比較

圖1 治療組、模型組和假手術(shù)組小鼠腦組織的差異表達(dá)基因

圖2 治療組、模型組和假手術(shù)組小鼠腦組織差異表達(dá)基因聚類圖

腦梗死后顯著下調(diào)且補(bǔ)陽還五湯治療后顯著上調(diào)的19個基因顯著富集到202條GO條目，其中生物過程132條，細(xì)胞成分37條，分子功能33條。差異基因主要富集的前10個生物過程包括與神經(jīng)可塑性有密切關(guān)系的“突觸小泡中的神經(jīng)遞質(zhì)負(fù)荷、錐體神經(jīng)元分化、突觸可塑性的正向調(diào)節(jié)、突觸囊泡循環(huán)、神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸、軸突引導(dǎo)、神經(jīng)元投射引導(dǎo)、小泡介導(dǎo)的突觸轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞連接維持及神經(jīng)元遷移的調(diào)節(jié)”；主要富集的前10個細(xì)胞成分包括興奮性突觸、突觸前膜的組成部分、過氧物酶體、層粘連蛋白復(fù)合體、突觸前膜、突觸小泡、胞外囊泡、細(xì)胞投射膜、神經(jīng)元胞體膜及運(yùn)輸囊泡；主要富集的前10個分子功能涉及神經(jīng)肽Y受體活性、腺苷酸環(huán)化酶活性、L-谷氨酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、神經(jīng)遞質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、蛋白磷酸酶2A結(jié)合、連接酶活性、血清素受體活性、陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、鈉離子通道的活動及熱激蛋白（heat shock protein，HSP）70結(jié)合（圖4B）。

2.5 補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死小鼠后逆轉(zhuǎn)的差異基因的KEGG分析 交集部分的差異基因的KEGG富集通路分析結(jié)果顯示，腦梗死后上調(diào)且補(bǔ)陽還五湯治療后下調(diào)的基因主要富集到抗原處理和呈遞、Toll樣受體信號通路、噬菌體、IL-17信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、細(xì)胞衰老、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、NF-κB信號通路、NOD樣受體信號通路和趨化因子信號通路等（圖5A）；腦梗死后顯著下調(diào)且補(bǔ)陽還五湯治療后顯著上調(diào)的基因主要富集到萜類主鏈生物合成、糖胺聚糖生物合成硫酸肝素/肝素、醛固酮調(diào)節(jié)鈉重吸收、味覺傳導(dǎo)、谷氨酸能突觸、脂肪細(xì)胞脂肪分解的調(diào)節(jié)、長壽調(diào)節(jié)途徑-多物種、長時程增強(qiáng)、逆行內(nèi)源性大麻素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等信號通路（圖5B）。

圖3 補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死小鼠后逆轉(zhuǎn)的差異表達(dá)基因的定量反轉(zhuǎn)錄PCR驗證

圖4 補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死小鼠后逆轉(zhuǎn)的差異基因GO分析

圖5 補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死小鼠后逆轉(zhuǎn)的差異基因KEGG通路分析

3 討論

補(bǔ)陽還五湯是治療缺血性卒中氣虛血瘀癥的中藥名方。研究證實，補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死患者效果好[8-9]，但其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚不完全清楚。

本研究采用高通量RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組、模型組和治療組小鼠腦組織的基因表達(dá)譜存在顯著差異，qRT-PCR驗證結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致，炎癥反應(yīng)是急性腦缺血后組織損傷的重要機(jī)制之一。有研究表明，促炎細(xì)胞因子Myd88、Map3k8、IL1r1、Tlr9等在腦缺血后表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[10-14]。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)陽還五湯降低了小鼠腦梗死灶周Myd88、Map3k8、IL1r1、Tlr9基因的mRNA表達(dá)水平，表明補(bǔ)陽還五湯可作用于多個分子靶點(diǎn)來減輕腦梗死后的神經(jīng)炎癥，這可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的重要機(jī)制。

本研究進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，GO分析顯示，小鼠腦梗死后顯著上調(diào)且補(bǔ)陽還五湯治療后下調(diào)的差異基因有134個，GO分析顯示這些差異表達(dá)基因主要富集到急性炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡等生物學(xué)過程，這些均為腦梗死后組織損傷的主要病理機(jī)制。KEGG分析表明，IL-17信號通路、Nod樣受體信號通路、NF-κB信號通路等為差異表達(dá)基因主要富集的信號通路。文獻(xiàn)報道，腦缺血可誘發(fā)IL-17表達(dá)上調(diào)，激活Nod樣受體及NF-κB等炎癥信號通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[15-17]。由此，推測IL-17信號通路、Nod樣受體信號通路及NF-κB信號通路等可能是補(bǔ)陽還五湯減輕小鼠腦梗死后腦組織損傷的潛在信號通路。

對小鼠腦梗死后下調(diào)且補(bǔ)陽還五湯治療后上調(diào)的差異基因的GO分析顯示，這些差異基因主要富集到錐體神經(jīng)元分化、突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬镞^程；與神經(jīng)元、細(xì)胞投射膜及突觸等細(xì)胞組分密切相關(guān)；參與神經(jīng)肽Y受體的活性蛋白質(zhì)、谷氨酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性及神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性等分子功能，這些生物功能對于腦梗死后神經(jīng)結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能重塑是必不可少的。KEGG分析顯示，補(bǔ)陽還五湯治療后顯著上調(diào)的基因顯著富集到逆行內(nèi)源性大麻素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、長壽調(diào)節(jié)通路及長時程增強(qiáng)等信號通路。這些通路不僅參與腦損傷后神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)，而且對缺血腦組織具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[18-19]。本研究結(jié)果提示，補(bǔ)陽還五湯治療可能通過上調(diào)與神經(jīng)重塑相關(guān)基因的表達(dá)水平，促進(jìn)小鼠腦梗死后神經(jīng)修復(fù)。

本研究表明，補(bǔ)陽還五湯可作用于與炎癥反應(yīng)和神經(jīng)可塑性密切相關(guān)的多個分子靶點(diǎn)，減輕炎癥導(dǎo)致的腦組織損傷并促進(jìn)神經(jīng)重塑，從而加快受損神經(jīng)功能的修復(fù)。本研究為探討補(bǔ)陽還五湯治療急性腦梗死的作用機(jī)制提供了新的思路，不足之處是樣本量不夠大，同時通過生物信息分析得出的信號通路比較多，沒有進(jìn)一步研究補(bǔ)陽還五湯糾正炎癥及促進(jìn)神經(jīng)重塑相關(guān)信號通路涉及的上游或下游相關(guān)受體及蛋白。