謝瑤欣，張璟怡，陶 鑄，2,3* ，姚國新，2，湯亞芳，2，溫 馨，2

(1. 湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000；2. 湖北工程學(xué)院 特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 孝感 432000；3. 湖北工程學(xué)院 湖北省植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖北 孝感 432000)

野菊花(ChrysanthemumindicumL.)是菊科多年生草本植物的干燥頭狀花序，廣泛用作中藥材和茶葉原料[1]，也被稱為“苦薏”、“山菊花”、“路邊菊”、“野黃菊”等[2]。其資源比較豐富，主要生長在山坡、草地、河邊、路邊等潮濕處，廣泛分布于我國東北、華北、華中、華東及西南地區(qū)[3-4]，在東亞地區(qū)如韓國、日本和在歐洲東北部得到了廣泛的應(yīng)用[5-6]。野菊花味苦、辛，性微寒，歸肝心經(jīng)；具有清熱解毒、瀉火平肝的功效，含有黃酮類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油和萜類等化學(xué)成分，主要用于治療目赤腫痛、頭痛眩暈等病癥，目前廣泛應(yīng)用于茶飲、香料、食品、化妝品等[7]。

進(jìn)入21世紀(jì)后，茶飲料成為飲料新貴，市場(chǎng)需求量越來越大，已經(jīng)上升到以療效、營養(yǎng)為目標(biāo)，而且這種要求越來越迫切，因此茶飲料更要適應(yīng)消費(fèi)者的需求，開發(fā)具有自身特點(diǎn)的新產(chǎn)品。野菊花飲品主要是由晾曬、蒸煮、干燥、精制過的新鮮野菊花制成，可以單獨(dú)飲用或與其他配方搭配飲用，或做成保健飲料。但野菊花干燥后的提取液長時(shí)間暴露在空氣中，會(huì)發(fā)生明顯的褐變，甚至?xí)a(chǎn)生渾濁，因此，如何將野菊花適當(dāng)?shù)丶庸こ删哂袃?yōu)良口感和外觀的野菊花飲品，具有較大的研究價(jià)值[8]。

野菊花是一種傳統(tǒng)的藥食兩用的植物資源，對(duì)其進(jìn)行更深層次的研究一直是生物、醫(yī)藥工作者和食品科研工作者所關(guān)注的問題。但目前對(duì)野菊花茶的研究文獻(xiàn)較少，且大都處在初步發(fā)展階段，市場(chǎng)上常見的為將新鮮的菊花經(jīng)晾曬、蒸煮、干燥、精制后制成野菊花茶飲品，至今還處于初級(jí)加工階段，很少有野菊花的衍生產(chǎn)品，其附加值較低，需要進(jìn)一步開發(fā)，可考慮加工成外觀更好、風(fēng)味更佳的飲料，從而獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。本研究主要是對(duì)野菊花進(jìn)行水提取、濃縮、過濾等工藝，獲得提取物，并對(duì)其進(jìn)行調(diào)配，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面法，構(gòu)建回歸方程預(yù)測(cè)模型，并結(jié)合感官評(píng)價(jià)確定最佳配方，生產(chǎn)出外觀品質(zhì)良好、風(fēng)味更佳并具有保健功能的野菊花茶飲料，為其生產(chǎn)工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

野菊花(湖北大悟縣中醫(yī)院)，白砂糖(市售)，山梨糖醇(山東綠健生物技術(shù)有限公司)，無水檸檬酸(濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司制造)，無水乙醇(武漢市中天化工有限責(zé)任公司)，LC5090高效液相色譜儀(浙江福立分析儀器股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

野菊花預(yù)處理→提取→濃縮→過濾→調(diào)配→檢驗(yàn)(蒙花苷含量測(cè)定)→包裝→成品。

1)預(yù)處理、提取。稱取45.5 g野菊花，洗凈、干燥，加入20倍純凈水，然后將其混合液倒入容量瓶中，在磁力攪拌器回流提取，至溫度上升到90 ℃開始計(jì)時(shí)，回流提取2次，每次1.5 h。每次回流提取后倒出提取液，用真空泵進(jìn)行抽濾，將濾液在4 ℃條件下靜置12 ～ 24 h。

2)濃縮。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮提取的濾液，直至相對(duì)密度在常溫下保持在1.055 ～ 1.065，然后在4 ℃條件下將濃縮液靜置12 ～ 24 h。

3)過濾、調(diào)配。將靜置后的濃縮液進(jìn)行真空抽濾，即得混合提取物。將一定量的白砂糖、山梨糖醇和檸檬酸與該提取物混合，并加入適量的純凈水進(jìn)行調(diào)配，攪拌均勻。

4)檢驗(yàn)。將靜置后的調(diào)配液利用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定。

5)包裝、成品。將調(diào)配液包裝封口、貼標(biāo)，制成瓶裝茶飲料，即為成品。

1.2.2 野菊花茶飲料的單因素試驗(yàn)

選取白砂糖用量、野菊花用量、山梨糖醇用量、檸檬酸用量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)表1設(shè)定各試驗(yàn)的因素、水平和條件，以感官評(píng)分為指標(biāo)，考核各因素對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分的影響。

表1 單因素試驗(yàn)因素和水平

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇白砂糖、野菊花、山梨糖醇、檸檬酸4個(gè)因素作為響應(yīng)變量，以野菊花茶飲料的感官評(píng)價(jià)作為響應(yīng)值，利用Design Expert8.0.6軟件，進(jìn)行Box-Behnken方法設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)(見表2)。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.4 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

飲料的感官得分是由10名品評(píng)人員根據(jù)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估，主要從產(chǎn)品的外觀色澤、香味、口感、組織狀態(tài)進(jìn)行綜合評(píng)分，以其平均值為最終得分(見表3)。

表3 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3 高效液相色譜法測(cè)定蒙花苷含量

1.3.1 色譜條件

參照《中國藥典》2020版方法測(cè)定蒙花苷含量，以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為色譜柱的填充劑，以甲醇-水-冰醋酸(26∶23∶1)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為334 nm，流速1.0 mL/min，柱溫20 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)時(shí)間26 min[9]。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

取蒙花苷對(duì)照品適量，精密稱重，加甲醇溶解并配制成0.1 mg/mL的溶液，即得。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將配制好的蒙花苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋成0.05 mg/mL、0.01 mg/mL、0.006 mg/mL、0.003 mg/mL、0.001 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，并做一個(gè)空白甲醇，各取1 mL過膜后分別置于液相小瓶中，放入液相色譜儀的自動(dòng)進(jìn)樣器中。以蒙花苷質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.4樣品含量測(cè)定

取樣品溶液1 mL，按1.3.3的方法，在高效液相色譜儀中測(cè)定，得到峰面積，代入回歸方程中得到試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將成品飲料制成6份，包裝封口，分別置于4 ℃下，放置7 d后，比較感官指標(biāo)前后變化[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 白砂糖用量對(duì)野菊花茶飲料感官品質(zhì)的影響

從圖1可以看出，在其他條件相同的情況下，野菊花茶飲料的感官評(píng)分隨著白砂糖用量的增加而升高，在白砂糖用量為160 g/L時(shí)，野菊花茶飲料的外觀色澤、香氣、口感、組織狀態(tài)均較好，感官評(píng)分達(dá)到了最高，而當(dāng)白砂糖的含量超過160 g/L時(shí)，其感官評(píng)分開始顯著下降。結(jié)果表明，選擇白砂糖的含量為160 g/L是最合適的。

圖1 白砂糖用量對(duì)野菊花茶飲料感官品質(zhì)的影響

2.1.2 野菊花用量對(duì)野菊花茶飲料感官品質(zhì)的影響

從圖2可以看出，在其他條件相同的情況下，野菊花茶飲料的感官評(píng)分隨著野菊花用量的增加而升高，在野菊花用量為80 g/L時(shí)，野菊花茶飲料的外觀色澤、香氣、口感、組織狀態(tài)均較好，感官評(píng)分達(dá)到了最高，而當(dāng)野菊花的含量超過80 g/L時(shí)，其感官評(píng)分開始顯著下降。結(jié)果表明，選擇野菊花的含量為80 g/L是最合適的。

圖2 野菊花用量對(duì)野菊花茶飲料感官品質(zhì)的影響

2.1.3 山梨糖醇用量對(duì)野菊花茶飲料感官品質(zhì)的影響

從圖3可以看出，在其他條件相同的情況下，野菊花茶飲料的感官評(píng)分隨著山梨糖醇用量的增加而升高，在山梨糖醇用量為160 g/L時(shí)，野菊花茶飲料的外觀色澤、香氣、口感、組織狀態(tài)均較好，感官評(píng)分達(dá)到了最高，而當(dāng)山梨糖醇的含量超過160 g/L時(shí)，其感官評(píng)分開始顯著下降。結(jié)果表明，選擇山梨糖醇的含量為160 g/L是最合適的。

圖3 山梨糖醇用量對(duì)野菊花茶飲料感官品質(zhì)的影響

2.1.4 檸檬酸用量對(duì)野菊花茶飲料感官品質(zhì)的影響

從圖4可以看出，在其他條件相同的情況下，野菊花茶飲料的感官評(píng)分隨著檸檬酸用量的增加而升高，在檸檬酸用量為0.8 g/L時(shí)，野菊花茶飲料的外觀色澤、香氣、口感、組織狀態(tài)均較好，感官評(píng)分達(dá)到了最高，而當(dāng)檸檬酸的含量超過0.8 g/L時(shí)，其感官評(píng)分開始顯著下降。結(jié)果表明，選擇檸檬酸的含量為0.8 g/L是最合適的。

圖4 檸檬酸用量對(duì)野菊花茶飲料感官品質(zhì)的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見表4。應(yīng)用DesignExpert 8.0.6軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，通過分析，得到二次多項(xiàng)回歸擬合方程：

Y=+88.68+0.86×A-1.81×B+1.20×C+0.30×D+1.35×A×B+0.00×A×C-0.075×A×D+0.40×B×C+0.025×B×D-0.35×C×D-1.77×A2-5.52×B2-0.46×C2-0.18×D2

式中：Y為野菊花茶飲料的感官評(píng)分，A、B、C、D分別表示白砂糖用量、野菊花用量、山梨糖醇用量、檸檬酸用量。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 回歸模型的方差分析

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

在其他試驗(yàn)因素不變的情況下，白砂糖用量、野菊花用量、山梨糖醇用量、檸檬酸用量4個(gè)因素兩兩交互作用對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分影響的趨勢(shì)圖分別如圖5所示。

從圖5(a)可以看出，白砂糖的坡面比野菊花的平緩，說明野菊花用量對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分的影響較為顯著；二者等高線圖趨于橢圓形，說明二者交互作用對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分有顯著影響，由等高線可以確定最佳配方為：白砂糖用量為160 g/L，野菊花用量為80 g/L。

從圖5(b)可以看出，白砂糖的坡面比山梨糖醇的平緩，說明山梨糖醇用量對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分的影響較為顯著；二者等高線圖弧度較小，說明二者交互作用對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分無顯著影響，由等高線可以確定最佳配方為：白砂糖用量為160 g/L，山梨糖醇用量為160 g/L。

從圖5(c)可以看出，白砂糖的坡面比檸檬酸的陡峭，說明白砂糖用量對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分的影響較為顯著；二者等高線圖弧度較小，說明二者交互作用對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分無顯著影響，由等高線可以確定最佳配方為：白砂糖用量為160 g/L，檸檬酸用量為0.8 g/L。

從圖5(d)可以看出，野菊花的坡面比山梨糖醇的陡峭，說明野菊花用量對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分的影響較為顯著；二者等高線圖弧度較小，說明二者交互作用對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分無顯著影響，由等高線可以確定最佳配方為：野菊花用量為80 g/L，山梨糖醇用量為160 g/L。

從圖5(e)可以看出，野菊花的坡面比檸檬酸的陡峭，說明野菊花用量對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分的影響較為顯著；二者等高線圖弧度較小，說明二者交互作用對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分無顯著影響，由等高線可以確定最佳配方為：野菊花用量為80 g/L，檸檬酸用量為0.8 g/L。

從圖5(f)可以看出，山梨糖醇的坡面比檸檬酸的陡峭，說明山梨糖醇用量對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分的影響較為顯著；二者等高線圖弧度較小，說明二者交互作用對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分無顯著影響，由等高線可以確定最佳配方為：山梨糖醇用量為160 g/L，檸檬酸用量為0.8 g/L。

(a)白砂糖用量與野菊花用量的交互作用

2.2.3 試驗(yàn)最佳配方

從圖5中可以看出有最大的響應(yīng)值，通過軟件分析，預(yù)測(cè)野菊花茶飲料的最佳配方為：白砂糖164.13 g/L、野菊花77.95 g/L、山梨糖醇180 g/L、檸檬酸0.78 g/L。根據(jù)實(shí)際情況，將最佳配方改為白砂糖160 g/L、野菊花80 g/L、山梨糖醇180 g/L、檸檬酸0.8 g/L。

2.3 含量測(cè)定結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取樣品溶液1 mL，按1.3.3的方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=389.34x+0.0784，R2=0.9995，如圖6所示。蒙花苷濃度在0到-0.1 mg/mL范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

圖6 蒙花苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 野菊花飲料中蒙花苷含量的測(cè)定

蒙花苷是野菊花中含量較高的重要化學(xué)成分之一，也是野菊花質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一。在高效液相色譜儀中測(cè)定樣品溶液，得到峰面積為1.2955，代入回歸方程中得到蒙花苷含量為0.0031 mg/mL。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果(見圖7)表明野菊花茶飲料在4 ℃條件下，放置7 d后，產(chǎn)品的外觀色澤、香氣、口感、組織狀態(tài)均無明顯變化，說明該飲料制品至少在7 d內(nèi)可以保持穩(wěn)定。

圖7 飲料制品放置7 d前后對(duì)比

3 結(jié)論與討論

本研究以野菊花、白砂糖、山梨糖醇、檸檬酸等為主要原料，制作野菊花茶飲料，以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)確定因素水平，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化，建立的二次多項(xiàng)回歸擬合方程擬合度和可信度均很好，能夠合理地反映野菊花用量、白砂糖用量、山梨糖醇用量和檸檬酸用量對(duì)野菊花茶飲料感官評(píng)分的影響。利用此模型得到的野菊花茶飲料的最佳配方為白砂糖160 g/L、野菊花80 g/L、山梨糖醇180 g/L、檸檬酸0.8 g/L，在此條件下利用高效液相色譜法測(cè)得飲料中蒙花苷的含量為0.0031 mg/mL。制成的成品飲料呈淡黃色，澄清透明，具有野菊花主體的香味，無異味且香氣濃郁，酸甜可口，苦澀味基本沒有，容易被接受。本試驗(yàn)方法經(jīng)濟(jì)便捷、健康安全，可以為野菊花茶飲料產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝研究提供參考依據(jù)。

制作野菊花茶飲料的過程受很多因素的影響，主要在前期預(yù)處理過程中很容易會(huì)造成野菊花中蒙花苷的損失，導(dǎo)致其藥用價(jià)值降低，不能達(dá)到很好的保健功能的作用。并且茶飲料的品質(zhì)最易因消毒問題，導(dǎo)致產(chǎn)品不合格，有效的滅菌可以延長產(chǎn)品的保質(zhì)期，從而使穩(wěn)定性更好。因此，本文中的生產(chǎn)工藝還需進(jìn)一步優(yōu)化，以期研究出更高效的工藝方法，提高產(chǎn)品的質(zhì)量。