劉中敢　于霞　李靜

摘要：維生素C生產(chǎn)中的重要一步是L-山梨糖發(fā)酵。該發(fā)酵采用細(xì)菌將D-山梨醇氧化為L(zhǎng)-山梨糖，分批發(fā)酵時(shí)，存在明顯的底物抑制作用，因此很難獲得高產(chǎn)率的山梨糖，而通過(guò)補(bǔ)料方式可消除底物抑制作用，改善山梨糖產(chǎn)率。本文在山梨糖發(fā)酵分批時(shí)采用了兩種不同的補(bǔ)料方法：以0.6lh-1的恒定速率補(bǔ)入山梨醇含量為600gl-1的營(yíng)養(yǎng)物，山梨糖的產(chǎn)率為12.64 gl-1h-1；以0.5-0.04lh-1的線性降低速率補(bǔ)入山梨醇含量為600gl-1的營(yíng)養(yǎng)物，山梨糖的產(chǎn)率為17.01gl-1h-1。在產(chǎn)率方面后一種補(bǔ)料方式具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可以提高山梨糖產(chǎn)率，是較好的底物補(bǔ)料方法。

關(guān)鍵詞：弱氧化醋酸桿菌 山梨醇 山梨糖 補(bǔ)料方法

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ924 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2015）02-0083-01

1 材料和方法

1.1 材料

70%山梨醇溶液，酵母粉，磷酸二氫胺，硫酸鎂。

1.2 菌種及種子培養(yǎng)

菌種：NRRLB-72。

種子培養(yǎng)：培養(yǎng)48小時(shí)后的成熟斜面接種于試管，試管培養(yǎng)基裝量為10ml，30℃靜止培養(yǎng)72小時(shí)，接種于1L搖瓶，搖瓶培養(yǎng)基裝量為100ml，控制溫度在30℃，搖床轉(zhuǎn)速250rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

1.3.1 發(fā)酵條件

發(fā)酵采用7.0L攪拌發(fā)酵罐，培養(yǎng)基配方如上，通氣量2.2vvm，轉(zhuǎn)速700rpm，培養(yǎng)溫度30℃，pH通過(guò)加入3N HCl自動(dòng)控制在6.0。

1.3.2 600gl-1 山梨醇，0.6lh-1衡速補(bǔ)料分批發(fā)酵

發(fā)酵初始，體積為2.5L，山梨醇濃度為100gl-1 ，當(dāng)生物量達(dá)4.2gl-1 時(shí)（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約發(fā)酵8小時(shí)）開(kāi)始以0.6lh-1衡速補(bǔ)入2.0L含有600gl-1 山梨醇的培養(yǎng)基，為了排除其他影響，培養(yǎng)基中其余成分按山梨醇比例相應(yīng)增加。補(bǔ)料結(jié)束后繼續(xù)發(fā)酵至山梨醇完全耗盡。

1.3.3 補(bǔ)料速率線性降低分批發(fā)酵

發(fā)酵中補(bǔ)料速率線性降低：F=500.00-62.64×t（F單位是ml h-1，t單位是h）。發(fā)酵初始，體積為2.5L，山梨醇濃度為100gl-1 ，當(dāng)生物量達(dá)3.8gl-1 時(shí)（約發(fā)酵6小時(shí)）開(kāi)始補(bǔ)入2.0L含有600gl-1 山梨醇的培養(yǎng)基，為了排除其他影響，培養(yǎng)基中其余成分按山梨醇比例相應(yīng)增加，補(bǔ)料速率線性降低（0.5-0.04lh-1）。補(bǔ)料結(jié)束后繼續(xù)發(fā)酵至終點(diǎn)。

1.4 山梨糖總產(chǎn)率的計(jì)算

山梨糖總產(chǎn)率計(jì)算如下：產(chǎn)生的山梨糖（gl-1）/發(fā)酵周期（h）。

2 結(jié)果與討論

2.1 600gl-1 山梨醇，0.6lh-1恒速補(bǔ)料分批發(fā)酵

0.6lh-1恒速補(bǔ)料對(duì)發(fā)酵的影響。此條件下發(fā)酵周期、生物量、山梨糖濃度分別為25小時(shí)、9.85、316.00gl-1 ，山梨糖總產(chǎn)率為12.16 gl-1 h-1。由于補(bǔ)料較快，導(dǎo)致發(fā)酵11.5小時(shí)時(shí)反應(yīng)液中山梨醇濃度由10gl-1 突然增至210gl-1，不利于菌體的生長(zhǎng)，這也可能是山梨糖產(chǎn)率降低的原因，此時(shí)后山梨糖產(chǎn)率一直較低16.5 gl-1 h-1 。因此，為了在高山梨糖濃度時(shí)依然獲得高產(chǎn)率，需要改變補(bǔ)料速率使山梨醇濃度低于抑制水平。

2.2 補(bǔ)料速率線性降低的分批發(fā)酵

由于補(bǔ)料過(guò)快，使山梨醇濃度由10gl-1 突然累積到210gl-1，產(chǎn)生底物抑制作用，這樣補(bǔ)料結(jié)束后，仍需要發(fā)酵一段時(shí)間。為了消除這一不利影響采取將補(bǔ)料速率線性降低（起始0.5lh-1）的方法。理論上，發(fā)酵與補(bǔ)料同時(shí)結(jié)束，有利于縮短發(fā)酵周期，提高山梨糖產(chǎn)率。

補(bǔ)料速率線性降低時(shí)的微生物生長(zhǎng)和山梨醇、山梨糖濃度，發(fā)酵周期、生物量、山梨糖濃度分別為16小時(shí)、12.41、272.37gl-1，山梨糖總產(chǎn)率為17.01 gl-1 h-1 。

此補(bǔ)料方法與衡速補(bǔ)料相比，可以降低培養(yǎng)過(guò)程中山梨醇濃度（50-120 gl-1 ，6-13h；10-210 gl-1 ，8-11.5h）減弱對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用（生物量12.41，9.85），補(bǔ)料結(jié)束后 再發(fā)酵時(shí)間也由13.5h降低到3h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明補(bǔ)料速率線性降低是個(gè)好方法，可以提高山梨糖產(chǎn)率。

在分批發(fā)酵的補(bǔ)料策略方面，也有許多其他方面的報(bào)道，Bosjnak et等嘗試采用梯度補(bǔ)料，山梨糖產(chǎn)率為11.62gl-1 h-1；Mori 等采用純氧通氣，提高山梨糖產(chǎn)率到44.85 gl-1 h-1，但不經(jīng)濟(jì)；Srivastava和Lasrado的補(bǔ)料發(fā)酵研究山梨糖產(chǎn)率為12.6gl-1 h-1。與這些研究結(jié)果相比，補(bǔ)料速率線性降低優(yōu)勢(shì)明顯。

3 結(jié)語(yǔ)

在山梨糖補(bǔ)分批發(fā)酵中，山梨醇濃度為600 gl-1的培養(yǎng)基以0.6 l h-1衡速補(bǔ)料時(shí)，發(fā)酵周期25h，山梨糖產(chǎn)率及產(chǎn)量分別為12.64 gl-1 h-1和316.00gl-1；然而，以線性降低速率補(bǔ)料時(shí)，發(fā)酵周期16h，山梨糖產(chǎn)率及產(chǎn)量分別為17.01 gl-1 h-1和272.37gl-1。前者由于補(bǔ)料速度過(guò)快，使發(fā)酵液中山梨醇濃度處于抑制水平，延長(zhǎng)了發(fā)酵周期，形成所謂“二次分批發(fā)酵”；而后者補(bǔ)料量呈線性遞減，發(fā)酵液中山梨醇始終處于較適宜濃度，隨著發(fā)酵進(jìn)入惡化階段，補(bǔ)入的山梨醇量也逐漸減少，這樣使發(fā)酵達(dá)到最優(yōu)化。

參考文獻(xiàn)

[1] Lockwood LB. Ketogenic fermentation processes. In： Under-kofl er LA， Hickey RJ， editors. Industrial Fermentations. Chemi-cal Publishing Co， 1954：1-23.

[2] Boudrant J. Microbial processes for ascorbic acid biosynthesis： areview. Enzyme Microb Technol 1990；12：322–9.

[3] Damodaran M， Subramanian SS. Bacterial oxidation of sorbitolto sorbose. J Sci Ind Res 1951；5（10）：7–13.

[4] Bosjnak M， Pintar P， Gomercic K. Gradient fed-batch culture aseffi cient microbial oxidation method. Med Fac LandbouwwRijksuniv Gent 1991；56：1723–30.