李蘇華

中山大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，廣州 510006

2022年Carolyn R. Bertozzi、Morten Meldal、K. Barry Sharpless三位教授因點(diǎn)擊化學(xué)與生物正交化學(xué)獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)(圖1)。諾貝爾獎(jiǎng)官網(wǎng)對三位教授的貢獻(xiàn)作了簡單的描述：Sharpless教授首先提出了點(diǎn)擊化學(xué)的概念；接著Meldal教授和Sharpless教授分別獨(dú)立發(fā)展了最為重要的點(diǎn)擊化學(xué)——銅催化疊氮和炔的環(huán)加成反應(yīng)，也是我們常說的CuAAC反應(yīng)；Bertozzi教授將點(diǎn)擊化學(xué)發(fā)展到了一個(gè)更高的層次，即能夠在極為復(fù)雜的生物體系兼容的生物正交反應(yīng)。

圖1 2022年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者(左起分別為Bertozzi、Meldal、Sharpless, 圖片來源：https://www.britannica.com/biography/)

生命世界是極為復(fù)雜多樣的，但生物體所用的基本有機(jī)結(jié)構(gòu)單元其實(shí)非常有限，如堿基、氨基酸、單糖，這些加起來大概也只有幾十種，遠(yuǎn)少于有機(jī)合成所用的基礎(chǔ)原料。這些結(jié)構(gòu)單元只需要經(jīng)過高效、精準(zhǔn)并按照一定順序的連接，通過構(gòu)建磷酯鍵、酰胺鍵和糖苷鍵(圖2)，就可以構(gòu)建無窮多的生物大分子，如DNA／RNA、蛋白、聚糖等。而這些生物大分子分別執(zhí)行不同的功能，并最終構(gòu)建無窮多樣的生命世界。Sharpless教授正是受此啟發(fā)，提出單純的構(gòu)建連接就可以產(chǎn)生功能。如果能發(fā)展出少量非常高效、精準(zhǔn)的化學(xué)連接，就能夠快速構(gòu)建新的功能[1]。

圖2 通過構(gòu)建磷酯鍵、酰胺鍵和糖苷鍵形成無窮多的生物大分子

在這一思想的指導(dǎo)下，Sharpless教授從已知反應(yīng)里總結(jié)了三類最具潛力的反應(yīng)[1]：第一是張力環(huán)的親核開環(huán)(nucleophilic opening of springloaded rings)，spring-loaded是壓縮的彈簧，表示具有張力或高能的分子；第二是環(huán)加成反應(yīng)(cycloaddition reactions)；第三是保護(hù)基反應(yīng)(“protecting group” reactions)，通常能用作保護(hù)基的反應(yīng)都是非常高效的，也基本上是酸堿反應(yīng)。下面這個(gè)反應(yīng)是他給出的具體例子(圖3)。如這個(gè)環(huán)氧是具有環(huán)張力的分子，疊氮化鈉可以對其高效地親核開環(huán)，得到的疊氮分子可以和缺電子的炔烴直接發(fā)生[3+2]偶極環(huán)加成，從相對簡單的環(huán)氧通過兩步連接就可以高效構(gòu)建相對復(fù)雜的分子。值得一提的是，Sharpless提出的這三條原則對后續(xù)的點(diǎn)擊化學(xué)發(fā)展起到非常重要的指導(dǎo)作用，高效的生物正交反應(yīng)也遵循前兩條原則。第三條保護(hù)基反應(yīng)在第一代點(diǎn)擊化學(xué)的發(fā)展中很少用到，但它促進(jìn)了第二代點(diǎn)擊化學(xué)的發(fā)展。

圖3 通過簡單連接構(gòu)建復(fù)雜分子

點(diǎn)擊化學(xué)最核心的理念是構(gòu)建高效快速模塊化的連接，在盡可能短的時(shí)間內(nèi)獲取盡可能多的功能。Sharpless教授最初是在1999年的美國化學(xué)年會(huì)上提出這個(gè)概念的[2]，但投稿到《美國化學(xué)會(huì)志》，直接被拒了。后來他改投到《德國應(yīng)用化學(xué)》(Angew. Chem. Int. Ed.)，開始所有的評委也都拒稿，但時(shí)任主編Peter G?litz力排眾議，接收了這篇文章[1]。此后他最重要的點(diǎn)擊化學(xué)工作都發(fā)表在《德國應(yīng)用化學(xué)》上。這篇文章的引用數(shù)已經(jīng)超過1萬次，是《德國應(yīng)用化學(xué)》歷史上引用最多的文章。

概念提出后，最重要的事情就是把高效的反應(yīng)做出來。根據(jù)前面提到的三類高效反應(yīng)，如果能將高張力分子或高能分子和環(huán)加成結(jié)合起來，將有可能發(fā)展出一種特別高效的連接反應(yīng)。事實(shí)上，Huisgen教授做了大量關(guān)于[3+2]偶極環(huán)加成反應(yīng)的工作(圖4)[3-4]。這個(gè)反應(yīng)是4π+2π的體系，和Diels-Alder反應(yīng)類似，在基態(tài)就可以反應(yīng)。Huisgen教授研究了疊氮和炔的環(huán)加成反應(yīng)，但常規(guī)的疊氮和炔烴反應(yīng)需要比較高的溫度，而且會(huì)產(chǎn)生1,4和1,5取代的異構(gòu)體。這些早期的基礎(chǔ)性工作使Huisgen教授成為諾貝爾獎(jiǎng)的熱門人選，但非常遺憾的是，他在2020年去世了。

圖4 Rolf Huisgen教授(右)和他發(fā)展的[3+2]偶極環(huán)加成反應(yīng)(圖片來源：https://en.wikipedia.org/wiki/Rolf_Huisgen)

Sharpless教授在點(diǎn)擊化學(xué)概念性文章中展示了缺電子的炔烴可以提高效率，但這個(gè)反應(yīng)仍需要在70 ℃才能反應(yīng)。疊氮分子是一個(gè)高能量的分子，根據(jù)前面提出的三條原則，他希望能在疊氮和炔烴中尋找高效的連接方法。

在20世紀(jì)80～90年代，已有利用酶的空腔位點(diǎn)來結(jié)合小分子并促進(jìn)空間鄰近的兩個(gè)化合物相連接的工作報(bào)道，但一般是通過巰基與羰基-α-氯代物，這類反應(yīng)效率不高且有較多副反應(yīng)。M. G. Finn，Sharpless教授的學(xué)生，曾在Scripps研究所獨(dú)立工作，并于2013年加入佐治亞理工大學(xué)。Sharpless教授與Finn合作，利用乙酰膽堿酯酶，在其已知的兩個(gè)抑制劑上分別接上不同鏈長的炔和疊氮，然后直接讓酶去選擇。酶在眾多底物中選擇性地將含2個(gè)亞甲基的疊氮及6個(gè)亞甲基的炔烴高效地連接起來，得到的產(chǎn)物是1,5-選擇性的(圖5，右)。通過人工合成制備了兩個(gè)三氮唑的異構(gòu)體，并發(fā)現(xiàn)1,4-三氮唑?qū)σ阴Ｄ憠A酯酶的抑制活性相對較弱，而乙酰膽堿酯酶自身合成的1,5-三氮唑具有非常高的活性，其解離常數(shù)達(dá)到飛摩爾級別，基本可以達(dá)到這兩個(gè)抑制劑理想狀態(tài)下協(xié)同作用的效果(圖5)。這一反應(yīng)也被稱為原位點(diǎn)擊反應(yīng)(in situ click chemistry)[5]。

圖5 供乙酰膽堿酯酶選擇性反應(yīng)的端炔和疊氮抑制劑及原位反應(yīng)的產(chǎn)物抑制劑(右)

2001年Sharpless教授因不對稱氧化獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，其頒獎(jiǎng)報(bào)告中大概只有一半時(shí)間用來回顧不對稱氧化反應(yīng)的工作，另外一半在講述點(diǎn)擊化學(xué)的概念，并談到了這個(gè)原位點(diǎn)擊化學(xué)的工作[6]。

酶雖然可以高效促進(jìn)疊氮和炔的高效連接，但由于生物體的保守性，這并不是一個(gè)通用的連接方法，還需要發(fā)展更加普適性的化學(xué)合成途徑。

在Sharpless教授報(bào)道了原位點(diǎn)擊反應(yīng)沒多久，丹麥哥本哈根大學(xué)的Meldal教授于2002年4月2日發(fā)表了一篇銅促進(jìn)炔和疊氮高效連接的文章[7]。Meldal教授主要研究多肽合成，他發(fā)現(xiàn)在固相合成中，將端炔和疊氮分別引入多肽或小分子片段，然后在當(dāng)量銅的作用下，這兩個(gè)片段發(fā)生[3+2]偶極環(huán)加成進(jìn)行連接的效率大大提高，而且選擇性地得到1,4-三氮唑(圖6)。這項(xiàng)工作發(fā)表在J. Org. Chem.上。之后，Meldal教授在這個(gè)領(lǐng)域里做的工作相對較少，因此可以說，他是單憑這一篇文章獲獎(jiǎng)的。

圖6 Meldal教授發(fā)展的CuI促進(jìn)疊氮和含端炔的多肽高效連接

在Meldal的文章發(fā)表3個(gè)月后，Sharpless教授和Valery Fokin教授一起報(bào)道了催化版本的CuAAC反應(yīng)[8]。Fokin是Sharpless教授的博士后，后來留在組里做了助理教授，并在2015年左右加入南加州大學(xué)。在這個(gè)反應(yīng)中，疊氮和炔在1%的銅鹽催化作用下，在叔丁醇和水中室溫下就可以高效地發(fā)生[3+2]環(huán)加成反應(yīng)，并將兩個(gè)分子片段高效連接起來。這個(gè)反應(yīng)甚至可以用單質(zhì)銅來催化(圖7)。

圖7 Sharpless教授和Fokin發(fā)展的銅催化的疊氮和炔的環(huán)加成反應(yīng)

這個(gè)銅點(diǎn)擊反應(yīng)發(fā)展出來最直接的應(yīng)用是能加速新化合物庫的構(gòu)建。例如：2個(gè)炔和2個(gè)疊氮進(jìn)行組合連接，就是4個(gè)化合物；100個(gè)炔、100個(gè)疊氮組合連接就是1萬個(gè)化合物。利用這個(gè)方法，加州大學(xué)圣地亞哥分校的Eckmann教授與Sharpless教授合作，將幾種有活性的含有疊氮的硝基咪唑與多種炔烴組合連接構(gòu)建了一個(gè)化合物庫，很快就獲得了多個(gè)高活性治療腹瀉的藥物分子(圖8)[9-10]。這里要說明的一點(diǎn)是，點(diǎn)擊化學(xué)不是關(guān)注合成三氮唑，三氮唑本身沒有什么藥物活性或者重要的功能，其目的僅是將兩個(gè)片段連起來，而不管這個(gè)連接子是什么。當(dāng)然，早期的銅反應(yīng)在復(fù)雜體系的活性很低，而且銅離子有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。這些問題不解決，其應(yīng)用也會(huì)大大受限。

圖8 點(diǎn)擊化學(xué)應(yīng)用于組合化學(xué)快速構(gòu)建化合物庫

Sharpless教授特別喜歡多個(gè)連接子的化合物，經(jīng)常畫一些含多個(gè)端炔或疊氮的分子讓學(xué)生合成出來。很多純粹是出于好奇與好玩(Just for fun)，并非為了發(fā)文章或者其他目的。就是在這些研究中，F(xiàn)okin發(fā)現(xiàn)部分多炔和疊氮的反應(yīng)要明顯快于單炔的反應(yīng)。他們認(rèn)為這個(gè)反應(yīng)有可能有一個(gè)自催化的過程，即生成的三氮唑能催化CuAAC反應(yīng)。他們對這個(gè)配體的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)TBTA(圖9)具有較高的活性[11]。

圖9 TBTA配體能大大加速CuAAC反應(yīng)

有了Fokin發(fā)展的配體，F(xiàn)inn嘗試將CuAAC反應(yīng)用于更復(fù)雜的體系[12]。他選取了豇豆花葉病毒作為模型，這個(gè)病毒高度對稱，有60個(gè)裸露在外的半胱氨酸殘基和賴氨酸殘基。通過過量的縮合試劑將它們分別接上60個(gè)疊氮。在銅和配體共同作用下，這60個(gè)疊氮可以高效地將60個(gè)含有端炔的熒光基團(tuán)連接到病毒上，產(chǎn)率可以達(dá)到95%(圖10)。這也是首次實(shí)現(xiàn)點(diǎn)擊化學(xué)在生命體系中的應(yīng)用。Finn通過這個(gè)展示，證明了CuAAC反應(yīng)在生物體系中的應(yīng)用潛能。連續(xù)60步反應(yīng)要達(dá)到95%的產(chǎn)率，需要每步的效率高達(dá)99.9%。我們通常認(rèn)為95%的產(chǎn)率是一個(gè)非常優(yōu)秀的產(chǎn)率，但連續(xù)做60步只有5%左右的產(chǎn)率。

圖10 CuAAC首次應(yīng)用于生命體系

Fokin發(fā)展的TBTA配體僅能應(yīng)用于一些相對簡單的生物體系，在低濃度下其活性仍不夠高。在他工作的基礎(chǔ)上，Peng Wu(吳鵬)教授發(fā)展了幾個(gè)更為高效的配體，BTTES和BTTPS(圖11)[13-15]。Peng Wu是Sharpless教授的學(xué)生，Bertozzi教授的博士后。他發(fā)現(xiàn)將TBTA中的兩個(gè)芐基變成叔丁基、一個(gè)芐基變成烷基磺酸酯時(shí)，可以大大提升催化效率。當(dāng)疊氮的濃度是100 μmol/L時(shí)，炔為50 μmol/L，不加配體基本沒有活性。TBTA催化的反應(yīng)產(chǎn)率只有百分之十幾，BTTES可以達(dá)到80%多。在配體的作用下，銅的毒性可以受到大大抑制。目前CuAAC反應(yīng)水相中最好用的配體是BTTPS，如果是有機(jī)相則是BTTP。

圖11 Peng Wu教授發(fā)展的幾個(gè)高效的CuAAC反應(yīng)配體

Wu教授目前主要研究糖化學(xué)，他將甘露糖衍生物(GDP-FucAl)通過代謝標(biāo)記到斑馬魚的受精卵，然后通過BTTES促進(jìn)的CuAAC反應(yīng)，3 min就可以將熒光染料連接到細(xì)胞上(圖12)[13]。

圖12 利用甘露糖衍生物代謝標(biāo)記細(xì)胞，并用配體促進(jìn)的CuAAC點(diǎn)亮細(xì)胞

點(diǎn)擊化學(xué)的主要目的是用盡可能短的時(shí)間獲得盡可能多的功能。要實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，一是高效的反應(yīng)，二是需要能用作連接子的化合物庫。CuAAC反應(yīng)已經(jīng)非常高效，但小分子疊氮的制備相對較慢，這制約了CuAAC反應(yīng)的應(yīng)用。董佳家教授很好地解決了這個(gè)問題。他是Sharpless教授的博士后，回國后在中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所發(fā)展了這個(gè)反應(yīng)，2022年加入上海交通大學(xué)。他利用氟磺?；B氮重氮轉(zhuǎn)移反應(yīng)，將伯胺高效轉(zhuǎn)化成疊氮化合物。這個(gè)反應(yīng)極為高效，非常復(fù)雜的底物也可以很好地進(jìn)行反應(yīng)。另外，該反應(yīng)可以在96孔板中進(jìn)行，文章中展示了1 200多個(gè)伯胺的轉(zhuǎn)化(圖13)[16]。后來他在短時(shí)間內(nèi)做了數(shù)以萬計(jì)的疊氮化合物。這一方法大大加速了CuAAC反應(yīng)在藥物活性分子中的應(yīng)用。

圖13 董佳家教授發(fā)展的氟磺酰疊氮快速構(gòu)建疊氮化合物庫

除了上面列舉的工作，點(diǎn)擊化學(xué)在材料科學(xué)領(lǐng)域也有著非常廣泛的應(yīng)用，如材料的合成和修飾、刺激響應(yīng)型材料、表面修飾等。

這次Sharpless教授官方的獲獎(jiǎng)理由主要是提出了點(diǎn)擊化學(xué)概念及發(fā)展了CuAAC反應(yīng)。這里也簡單介紹一下他最近發(fā)展的第二代點(diǎn)擊化學(xué)——硫氟交換反應(yīng)(SuFEx)[17]。一代點(diǎn)擊化學(xué)CuAAC反應(yīng)需要預(yù)先給體系裝上一個(gè)炔烴或疊氮，然后才能去做連接；二代點(diǎn)擊化學(xué)希望能直接與體系相互作用。這個(gè)挑戰(zhàn)性非常大，是因?yàn)樯w系的復(fù)雜性及基本結(jié)構(gòu)單元的相似性。但至少從目前看，二代點(diǎn)擊化學(xué)提供了這樣一個(gè)可能性。

Sharpless教授于2014年提出并發(fā)展了SuFEx，董佳家博士和Larissa Krasnova博士是這項(xiàng)工作的共同第一作者[17]。前面提到的點(diǎn)擊化學(xué)三類反應(yīng)中的保護(hù)基反應(yīng)在前期發(fā)展一代點(diǎn)擊化學(xué)時(shí)一直沒有用到。硫氟交換反應(yīng)最初來源于對Ts保護(hù)基的思考。一般做Ts保護(hù)醇或胺時(shí)，用TsCl產(chǎn)率非常高，但很少會(huì)關(guān)注到這里面的問題。Sharpless教授注意到TsCl在用作保護(hù)反應(yīng)時(shí)，會(huì)有部分四價(jià)硫的副產(chǎn)物生成，也就是發(fā)生了氧化還原反應(yīng)。他認(rèn)為氧化還原反應(yīng)的存在會(huì)導(dǎo)致這個(gè)S(VI)-Cl連接不完美，而轉(zhuǎn)向六價(jià)硫氟化合物。S-F化合物在做連接時(shí)沒有氧化還原反應(yīng)的問題。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這個(gè)硫氟鍵可能主要是通過氫鍵活化，然后在特定的方向上接受親核試劑的進(jìn)攻。這個(gè)特點(diǎn)使其有可能與生命體系中的某些大分子直接進(jìn)行選擇性相互作用。

硫酰氟可以將兩個(gè)酚高效地拼接，而乙烯基磺酰氟(ESF)既可用于和胺高效連接，也可以和羰基化合物高效連接(圖14)[17]。目前基于硫酰氟的SuFEx反應(yīng)已經(jīng)在高分子合成領(lǐng)域有了較好的應(yīng)用，如制備聚磺酸酯[18-19]。這個(gè)聚合物的較多性能要優(yōu)于結(jié)構(gòu)類似的聚碳酸酯。這類氟磺酸酯另一個(gè)重要的應(yīng)用是前面提到的它可以直接與細(xì)胞作用，可以在眾多蛋白中高選擇性地與特定蛋白的特定位點(diǎn)形成共價(jià)連接[20-21]。

圖14 SuFEx連接

Sharpless教授于2017年發(fā)展了基于SOF4的多維點(diǎn)擊化學(xué)[22]。在這之前，點(diǎn)擊化學(xué)都只能實(shí)現(xiàn)兩個(gè)片段在二維平面延伸，而利用SOF4可以實(shí)現(xiàn)三個(gè)片段在三維空間的高效拼接(圖15)。多維點(diǎn)擊化學(xué)目前已應(yīng)用于新型螺旋聚合物的制備以及其后修飾[23]，另外還可以高選擇性地直接作用于更加重要的功能蛋白，如PARP1[24]。這些和蛋白高選擇性相互作用的例子證明，發(fā)展直接作用于生命體系的化學(xué)工具是可行的。多維點(diǎn)擊化學(xué)及其應(yīng)用中化學(xué)部分的工作主要由筆者在Sharpless教授課題組從事博士后研究工作期間完成。

圖15 基于SOF4的多維點(diǎn)擊化學(xué)及其在生物和高分子材料中的應(yīng)用

前面提到Wu教授發(fā)展的系列配體可以將細(xì)胞毒性降到一個(gè)比較低的水平，但還是有少量毒性，因此要在活體中做反應(yīng)還有困難。而生物正交反應(yīng)提供了一個(gè)解決途徑。

早期，Werner Reutter發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能夠通過代謝將非天然的唾液酸引入細(xì)胞表面[25]。Bertozzi教授希望通過在唾液酸上引入一些具有反應(yīng)活性的基團(tuán)，然后通過代謝將這些基團(tuán)引入到細(xì)胞上，再通過特定的化學(xué)反應(yīng)將外加基團(tuán)與細(xì)胞相連，從而在細(xì)胞上連接特定功能的化合物。

早在1919年，Hermann Staudinger發(fā)展了利用三價(jià)有機(jī)膦化合物還原疊氮到伯胺的方法(圖16)[26]。該方法會(huì)生成一個(gè)氮葉立德中間體，而這個(gè)中間體不穩(wěn)定，經(jīng)過水解就可以得到伯胺。因?yàn)榀B氮化合物制備相對容易，該方法也是早期制備伯胺的一條簡易路線。

圖16 Hermann Staudinger教授(右)發(fā)展的Staudinger反應(yīng)(圖片來源：https://en.wikipedia.org/wiki/Hermann_Staudinger)

盡管氮葉立德會(huì)水解，但Bertozzi教授創(chuàng)造性地利用了兩個(gè)有機(jī)合成的基本原則讓該中間體變?yōu)橐粋€(gè)具有良好生物兼容性的偶聯(lián)試劑：第一，分子內(nèi)的反應(yīng)要遠(yuǎn)快于分子間的反應(yīng)；第二，五元環(huán)的構(gòu)建最為容易。根據(jù)這兩個(gè)原則，Bertozzi教授在三苯基膦的磷原子鄰位引入一個(gè)親電試劑酯基，這樣生成的氮葉立德對其發(fā)生親核加成而從分子間變成分子內(nèi)，并且生成的是五元磷雜內(nèi)酰胺，可以大大加速反應(yīng)，即便在有水的條件下也可以在水解之前構(gòu)建兩個(gè)片段的連接(圖17)。利用這個(gè)方法，Bertozzi教授通過唾液酸在細(xì)胞表面引入疊氮分子，再通過連有功能基團(tuán)并帶有鄰位酯基的三苯基膦就可以高選擇性地與唾液酸上的疊氮分子反應(yīng)，從而構(gòu)建穩(wěn)定的化學(xué)連接[27]。由于Bertozzi教授的貢獻(xiàn)，這個(gè)反應(yīng)被命名為Staudinger-Bertozzi連接反應(yīng)。

圖17 Staudinger-Bertozzi連接反應(yīng)原理及其應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記

在這項(xiàng)工作基礎(chǔ)上，Bertozzi教授于2003年首次提出了生物正交反應(yīng)的概念[28-29]，指一類反應(yīng)能在生物體系中進(jìn)行但不影響生物體本身。這里面有兩個(gè)基本的要求：第一，反應(yīng)物或反應(yīng)基團(tuán)是天然生物體系沒有的；第二，兩個(gè)反應(yīng)的基團(tuán)相遇時(shí)能直接反應(yīng)或在特定條件下高效、高選擇性地反應(yīng)。

盡管Staudinger-Bertozzi連接反應(yīng)具有很好的選擇性和生物兼容性，但該反應(yīng)相對較慢。Bertozzi教授利用具有高張力的環(huán)辛炔與疊氮可以高效地發(fā)生[3+2]偶極環(huán)加成，構(gòu)建三氮唑穩(wěn)定的共價(jià)連接(圖18)[30-31]。該反應(yīng)相對Staudinger-Bertozzi連接反應(yīng)速率有了明顯的提升，并且不需要銅鹽的參與，也被稱為無銅的AAC反應(yīng)。由于該反應(yīng)的高效、高選擇性，且對生物體無毒，目前該連接技術(shù)已大量應(yīng)用于活體動(dòng)物。值得一提的是，這個(gè)反應(yīng)仍然遵循Sharpless教授在點(diǎn)擊化學(xué)概念文章中提到的前兩條原則，即張力環(huán)分子／高能分子以及環(huán)加成反應(yīng)的結(jié)合。

圖18 Bertozzi教授發(fā)展的高張力環(huán)辛炔與疊氮的環(huán)加成反應(yīng)

這個(gè)反應(yīng)存在少量副反應(yīng)，如蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基會(huì)和少量環(huán)辛炔發(fā)生thiol-ene反應(yīng)(圖19)[32]。

圖19 半胱氨酸殘基與環(huán)辛炔發(fā)生thiol-ene反應(yīng)

Diels-Alder(DA)反應(yīng)通過雙烯體和親雙烯體反應(yīng)構(gòu)建六元環(huán)，是有機(jī)合成中使用最為廣泛的反應(yīng)之一。要使其高效反應(yīng)，一般有兩種策略：一種是使用富電子的雙烯體和缺電子的親雙烯體，這也是正常電子需求的DA反應(yīng)；或者完全反過來，即缺電子的雙烯體和富電子的親雙烯體組合，即反電子需求的DA反應(yīng)。Scripps研究所的Dale L. Boger教授在反電子需求的DA反應(yīng)領(lǐng)域中做了系統(tǒng)性工作，發(fā)展了系列三嗪和四嗪作為缺電子雙烯體的DA反應(yīng)(圖20)。在該反應(yīng)中先發(fā)生DA反應(yīng)，再通過逆DA反應(yīng)脫除一分子腈或氮?dú)鈁33-36]。

圖20 Dale L. Boger教授發(fā)展的反電子需求DA反應(yīng)

在此基礎(chǔ)上，特拉華大學(xué)的Joseph M. Fox教授發(fā)展了反式環(huán)辛烯與四嗪的DA反應(yīng)。該反應(yīng)極為快速，接了硫氧還蛋白(Trx)的反式環(huán)辛烯在15 μmol/L時(shí)能夠和四嗪在5 min內(nèi)反應(yīng)完全(圖21)[37]。這個(gè)反應(yīng)同樣符合Sharpless教授提出的高張力環(huán)反應(yīng)及環(huán)加成反應(yīng)原則。該反應(yīng)的高效和高選擇性，使其目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物體系。

圖21 Fox教授發(fā)展的反式環(huán)辛烯與四嗪的反電子需求的DA反應(yīng)

目前該反應(yīng)已經(jīng)應(yīng)用到了人體臨床試驗(yàn)。例如，阿霉素可用于治療十幾種不同的癌癥，包括乳腺癌、卵巢癌和肝癌，但治療的同時(shí)會(huì)引起嚴(yán)重的副反應(yīng)。如果將阿霉素上的氨基保護(hù)起來做成氨基甲酸酯，毒性就可以大大降低。通過先將含有上述四嗪片段的聚糖富集在腫瘤細(xì)胞附近，然后注射含反式環(huán)辛烯保護(hù)的阿霉素，這些被保護(hù)的阿霉素對身體的其他部位毒性影響相對較小，但經(jīng)過腫瘤細(xì)胞時(shí)能快速與四嗪反應(yīng)構(gòu)建連接，富集并釋放出高毒性的阿霉素，從而殺死癌細(xì)胞，達(dá)到靶向治療的效果(圖22)[38]。

圖22 通過反式環(huán)辛烯與四嗪的反電子需求DA反應(yīng)富集并釋放高毒性藥物分子

點(diǎn)擊化學(xué)自概念的提出到后面原位點(diǎn)擊反應(yīng)、CuAAC及SuFEx反應(yīng)的發(fā)展，目前已廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、生物偶聯(lián)、材料等諸多領(lǐng)域，這一強(qiáng)有力的工具極大地推動(dòng)了這些領(lǐng)域的發(fā)展。生物正交化學(xué)對生物兼容性、反應(yīng)效率和選擇性的追求使其成為通過化學(xué)方法研究生命體系的一個(gè)不可或缺的工具，是化學(xué)生物學(xué)的基礎(chǔ)，并已經(jīng)應(yīng)用于人體的藥物試驗(yàn)。點(diǎn)擊化學(xué)和生物正交化學(xué)的核心都是構(gòu)建高效的連接，筆者相信這一理念將指導(dǎo)化學(xué)家們發(fā)展出更加高效、生物兼容性更好的連接反應(yīng)，并推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域發(fā)展到一個(gè)前所未有的高度。