陳 晨，史國華，張 瑞，張 濤，嚴(yán)陶陶，陳勃旭，張子侖，張 巖，周 巍,2,*

（1.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050071；2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024）

羊乳由于其營養(yǎng)成分中脂肪酸組成、含氮量、蛋白組成相比較于牛乳更貼近母乳[1-3]而被廣大消費(fèi)者喜愛，素有“奶中之王”的美譽(yù)。羊乳中不含牛乳中的αS1-酪蛋白、β-乳球蛋白等容易引起人體過敏的物質(zhì)，更適合消費(fèi)群體的需求，降低了易敏人群的致敏的風(fēng)險(xiǎn)。羊奶粉目前處于整體品類上升期，仍處于初級(jí)階段，目前市場份額占比僅占乳品行業(yè)的4%，還有很大的發(fā)展空間，由于羊奶其獨(dú)特的營養(yǎng)價(jià)值，越來越多的廠家進(jìn)軍羊奶粉市場，對(duì)牛奶粉形成了劇烈沖擊，但奶羊的養(yǎng)殖區(qū)域的限制，奶羊上游產(chǎn)業(yè)仍需要較長時(shí)間才能建成，制約了羊奶粉產(chǎn)業(yè)的生長。市場上以牛乳冒充羊乳的商品欺詐現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，這不僅對(duì)市場造成影響，更因牛乳中含有易致敏的營養(yǎng)物質(zhì)，增加了消費(fèi)者的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重危害了消費(fèi)者的健康。

近幾年，食品行業(yè)已經(jīng)成為國民經(jīng)濟(jì)的支柱行業(yè)，食品安全事件也層出不窮，現(xiàn)在日益全球化的生產(chǎn)鏈?zhǔn)沟檬称窊郊僮兊萌菀譡4]，食品摻假不僅會(huì)讓消費(fèi)者喪失對(duì)市場監(jiān)管部門的信任，還會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康造成威脅，如出現(xiàn)痙攣、過敏甚至癱瘓現(xiàn)象[5-6]。目前市場上乳品的消費(fèi)已經(jīng)不再局限于新生兒的范疇，也是成年人及兒童重要營養(yǎng)物質(zhì)的來源[7-8]。隨著乳制品全球化的迅猛發(fā)展，一些生產(chǎn)商為降低生產(chǎn)成本，追求經(jīng)濟(jì)利益，在其中加入一些摻假物質(zhì)，最為常見的為三聚氰胺，但假蛋白的加入會(huì)使摻假者面臨查處的風(fēng)險(xiǎn)。為使得摻假產(chǎn)品達(dá)到真實(shí)的效果，生產(chǎn)商采用隱蔽性更強(qiáng)且同源的摻假形式，其中最為代表性的就是羊乳中加入牛乳降低成本[9-11]。目前鑒定乳源的方法有理化方法[12-15]、免疫技術(shù)[16-19]、基因方法[19-24]、蛋白檢測[25-29]等，由于羊乳粉含量復(fù)雜，常用檢測方法具有一定的局限性，數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）克服了傳統(tǒng)方法操作復(fù)雜的弊端，更加準(zhǔn)確地進(jìn)行了定量檢測。

數(shù)字PCR是現(xiàn)代新型的核酸絕對(duì)定量技術(shù)，是將其含有核酸模板的體系進(jìn)行微滴化處理，進(jìn)而進(jìn)行PCR，反應(yīng)結(jié)束后檢測熒光信號(hào)進(jìn)而分析出樣品中核酸的濃度。該技術(shù)計(jì)算的是核酸的最原始的濃度，不再依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)品。Floren等[30]應(yīng)用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)牛、馬、豬源進(jìn)行了定量檢測。苗麗等[31]利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)建立了羊肉質(zhì)量和拷貝數(shù)的關(guān)系。楊碩等[32]采用多重微滴式數(shù)字PCR完成了核桃露中核桃、大豆成分的物種定量鑒定。本研究建立了微滴式數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)羊乳粉的定量檢測方法研究，通過質(zhì)量、DNA質(zhì)量濃度、拷貝數(shù)，以DNA質(zhì)量濃度為中間值，建立拷貝數(shù)與質(zhì)量的關(guān)系式，再通過摻假模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證。以期為建立羊乳粉摻假的市場監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊乳粉購自陜西羊乳粉企業(yè)。

深加工食品DNA提取試劑盒（非離心柱型）天根生化科技（北京）有限公司；氯仿 北京酷來博科技有限公司；無水乙醇、異丙醇（均為分析純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；ddPCRTMSupermix for Probes（no dUTP）、Droplet Generation Oil for Probes、ddPCRTM Droplet Reader Oil 美國Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州潤華電器有限公司；Sigma 3K15冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；NanoDrop 2000微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司；LightCycler 480II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 德國羅氏診斷有限公司；C1000 Touch Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀、PCR Plate Sealer、QX200 Droplet Generator、QX200Droplet Reader、QX200 Droplet Generator、DG8 cartridge微滴生成卡、Holder微滴發(fā)生器 美國Bio-Rad公司；冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

采用改良版的深加工食品DNA提取試劑盒，稱取5～100 mg，加1 000 μL緩沖液GMO1和40 μL的蛋白酶K（20 mg/mL），渦旋振蕩1 min。60 ℃孵育2 h。孵育過程中始終保持振蕩。將孵育好的樣本分別加入GMO2和三氯甲烷，加入量為200、400 μL，渦旋振蕩1 min，靜置10 min。在4 ℃、12 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管中，并加入0.7 倍體積的異丙醇，充分混勻。在4 ℃、12 000 r/min離心3 min，去上清液留沉淀。加入700 μL 70%乙醇溶液，渦旋振蕩5 s，在離心機(jī)上以12 000 r/min離心2 min，去除上清液。重復(fù)此步驟一次。開蓋，在生物安全柜中，打開抽風(fēng)放置20 min，徹底晾干殘留乙醇。向其中加入洗脫緩沖液TE 30 μL，渦旋1 min，并測定DNA含量和純度。

1.3.2 引物探針

由于羊乳粉存在物種間的差異性，選用針對(duì)綿羊和山羊都有效的特異性探針進(jìn)行檢測，引物和探針引用自[33]，見表1，結(jié)果顯示該探針與其他物種間不存在交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，可應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 羊引物探針Table 1 Sheep-specific primer and probe sequences

1.3.3 微滴式數(shù)字PCR

1.3.3.1 微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)條件

數(shù)字PCR反應(yīng)條件包括2×ddPCR Super Mix為10 μL、上游引物用量為1.2 μL（10 μmol/L）、下游引物用量為1.2 μL（10 μmol/L）、探針用量為0.4 μL（10 μmol/L）、DNA模板為4.0 μL、ddH2O補(bǔ)齊20 μL體系。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min；56 ℃退火45 s；進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，98 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3.3.2 微滴式數(shù)字PCR操作步驟

1）先將所需實(shí)驗(yàn)?zāi)０灏匆欢ㄌ荻冗M(jìn)行稀釋，制成實(shí)驗(yàn)樣品轉(zhuǎn)移到微滴發(fā)生卡中，同時(shí)加入微滴發(fā)生油70 μL，進(jìn)行微滴的制備。2）將制備好的微滴轉(zhuǎn)移到96 孔板中，應(yīng)用封膜儀進(jìn)行封膜處理。3）將封好膜的96 孔板，放到C1000 Touch Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。4）擴(kuò)增結(jié)束后將96 孔板放到QX200 Droplet Reader中，根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)排版進(jìn)行信息錄入，讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)微滴發(fā)出的熒光信號(hào)的強(qiáng)度判定陽性和陰性結(jié)果，并記錄下每個(gè)樣品的陽性和陰性的微滴數(shù)。信號(hào)采集完畢后，軟件Quantasoft將計(jì)算出最終結(jié)果并以圖像形式給出。

1.3.4 特異性檢測

微滴式數(shù)字PCR檢測分別用羊乳粉、牛乳粉、駱駝乳粉、馬乳粉、驢乳粉、豬、雞、鴨、核桃、杏仁、花生、大豆的基因組DNA作為特異性檢測的擴(kuò)增對(duì)象，無菌雙蒸水作為空白對(duì)照，每個(gè)樣本設(shè)置兩個(gè)平行。

1.3.5 質(zhì)量與拷貝數(shù)關(guān)系曲線的建立

1.3.5.1 羊乳粉質(zhì)量與提取DNA質(zhì)量濃度的關(guān)系

稱取羊乳粉10～180 mg不同質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)樣本，進(jìn)行不同質(zhì)量實(shí)驗(yàn)樣本的DNA提取，每個(gè)質(zhì)量重復(fù)4次，減少實(shí)驗(yàn)誤差，經(jīng)Nanodrop 2000測定DNA的含量，從而建立質(zhì)量和其DNA質(zhì)量濃度之間的關(guān)系。

1.3.5.2 羊乳粉DNA質(zhì)量濃度與數(shù)字PCR拷貝數(shù)關(guān)系的建立

將提取得到的羊乳粉基因組DNA進(jìn)行系列稀釋，稀釋梯度為5、10、20、40、60、80、100 ng/μL，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，為得到準(zhǔn)確的拷貝數(shù)，需對(duì)其稀釋的精確性有較高要求，以無菌雙蒸水作為對(duì)照，通過進(jìn)行微滴式數(shù)字PCR檢測得到DNA含量和拷貝數(shù)的關(guān)系。

1.3.6 建立摻假模型及市售樣本的檢測

在羊乳粉摻假模型的建立中，羊乳粉為主要被摻假對(duì)象，構(gòu)成摻假模型，摻假模型以100 mg為最大摻假質(zhì)量進(jìn)行設(shè)計(jì)，摻假比例為5∶95、10∶90、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20、100。之后將摻假的實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行DNA的提取，并將提取好的基因組DNA進(jìn)行10 倍稀釋，取4 μL進(jìn)行微滴式數(shù)字PCR的檢測，得到的結(jié)果通過公式推算出實(shí)際值和測量值的差異，進(jìn)而衡量所建立公式的準(zhǔn)確性。

為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，本研究在市場上購買了一批標(biāo)簽顯示為羊乳粉的商品進(jìn)行測試，市售樣本的測試均保證與實(shí)驗(yàn)樣本操作過程一致，減小誤差，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Excel進(jìn)行圖表編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測

基于微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，選取羊乳粉、牛乳粉、駱駝乳粉、驢乳粉、馬乳粉及豬、雞、鴨、核桃、杏仁、花生、大豆的基因組DNA作為特異性檢測對(duì)象，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)羊的引物探針特異性良好，可應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 羊乳粉特異性圖譜Fig. 1 Specificity map of goat milk powder

2.2 提取質(zhì)量、含量及拷貝數(shù)的關(guān)系曲線

為探索羊乳粉質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系，稱取不同質(zhì)量羊乳粉10～180 mg，對(duì)其進(jìn)行基因組DNA提取，經(jīng)測量得到不同質(zhì)量梯度下的DNA質(zhì)量濃度，進(jìn)而得到質(zhì)量濃度（y）與質(zhì)量（x）的關(guān)系曲線，結(jié)果見表2，在稱取的質(zhì)量范圍內(nèi)質(zhì)量與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，y＝5.175 4x+3.839 4，R2＝0.992 7，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的可信性。羊乳粉DNA質(zhì)量濃度梯度圖譜見圖2。

表2 羊乳粉DNA提取結(jié)果Table 2 Results of DNA extraction from goat milk powder

圖2 羊乳粉DNA質(zhì)量濃度梯度圖譜Fig. 2 DNA concentration gradient map from goat milk powder

統(tǒng)計(jì)學(xué)中規(guī)定變異系數(shù)小于15%，數(shù)據(jù)可靠。分析每個(gè)梯度各重復(fù)間羊乳粉DNA含量的最大變異系數(shù)為10.65%，所以數(shù)據(jù)具有可信性。將提取的基因組DNA分別稀釋為5、10、20、40、60、80、100 ng/μL，取4 μL稀釋后的DNA進(jìn)行數(shù)字PCR檢測，進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果見表3，取DNA拷貝數(shù)的平均值（y）與DNA質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性擬合，y＝1.717 3x+2.149 3，R2＝0.998 1，結(jié)果顯示兩者的線性關(guān)系良好。

表3 羊乳粉DNA含量與拷貝數(shù)結(jié)果Table 3 DNA concentration and copy number from goat milk powder

2.3 質(zhì)量與拷貝數(shù)公式的建立

根據(jù)2.2節(jié)曲線結(jié)果，以DNA含量為中間值進(jìn)行換算時(shí)，DNA質(zhì)量濃度先經(jīng)過了10 倍稀釋，再取4 μL進(jìn)行計(jì)算，由此得到羊乳粉質(zhì)量與DNA拷貝數(shù)之間的計(jì)算公式。M＝（C-4.75）/3.56，其中，M為羊乳粉質(zhì)量（mg），C為DNA拷貝數(shù)（copies/μL）。

2.4 摻假模型的數(shù)字PCR檢測

在羊乳粉摻假模型中，共設(shè)置7個(gè)不同的摻假比例，并對(duì)其樣本進(jìn)行基因組DNA的提取，并將提取的基因組DNA進(jìn)行10 倍稀釋，取4 μL進(jìn)行上機(jī)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并分析個(gè)各重復(fù)間的變異系數(shù)，并將拷貝數(shù)的平均值代入公式中進(jìn)行計(jì)算得到目標(biāo)物種的質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)學(xué)中規(guī)定變異系數(shù)小于15%，數(shù)據(jù)可靠，本摻假模型中變異系數(shù)最大為11.27%，所得結(jié)果均在統(tǒng)計(jì)學(xué)許可范圍內(nèi)。摻假模型的檢測結(jié)果驗(yàn)證了本研究所建立的定量方法具有一定的準(zhǔn)確性，可應(yīng)用于市售羊乳粉的檢測。具體結(jié)果見表4、圖3。

表4 已知摻假比例的分析結(jié)果Table 4 Results of analysis of known adulteration levels

2.5 市售樣本的數(shù)字PCR檢測

在進(jìn)行引物引用時(shí)考慮到了不同物種的羊的差異性，引證文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行了羊源性成分引物和探針的種內(nèi)包容性和種間特異性，所以應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的羊乳粉的微滴式數(shù)字PCR檢測方法，對(duì)市場上標(biāo)簽為羊乳粉商品進(jìn)行檢測，市售羊乳粉的處理方法同摻假模型的方法一致，由表5可知，在檢測的20 批次市售羊乳粉中，1 批次樣本明顯跟標(biāo)簽不符，標(biāo)明是羊乳粉但實(shí)際檢測羊乳粉含量為0，其他批次的樣本中多少也存在一定的摻假現(xiàn)象。

表5 市售羊乳粉樣本分析Table 5 Results of analysis of commercially available samples

3 結(jié) 論

采用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)羊乳粉進(jìn)行摻假定量檢測，通過羊乳粉的質(zhì)量及其DNA含量，DNA含量及其擴(kuò)增DNA拷貝數(shù)之間的線性擬合關(guān)系，得到羊乳粉質(zhì)量和擴(kuò)增DNA拷貝數(shù)的計(jì)算公式，從而可以快速鑒別羊乳粉的摻假情況。

為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，構(gòu)建羊乳粉摻假模型，計(jì)算羊乳粉的實(shí)際摻入量，經(jīng)擴(kuò)增得到的實(shí)驗(yàn)值和實(shí)際加入的摻假質(zhì)量相差不大，最大變異系數(shù)為11.27%，小于統(tǒng)計(jì)學(xué)中規(guī)定的15%的范圍，且摻假模型中羊乳粉數(shù)據(jù)變異系數(shù)遠(yuǎn)小于規(guī)定值，說明數(shù)據(jù)具有一定的可靠性。

為驗(yàn)證本研究的市場應(yīng)用價(jià)值，對(duì)羊乳粉市售樣本進(jìn)行微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的檢測。11 批次羊乳粉市售樣本均存在摻假現(xiàn)象，結(jié)果表明市場上存在一定羊乳粉摻假，同時(shí)也證明該方法具有一定的實(shí)際應(yīng)用能力。羊乳粉相對(duì)于牛乳粉來說，具有巨大的商業(yè)價(jià)值，羊乳粉適用人群廣，價(jià)值高是現(xiàn)在受市場青睞的原因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，市場上存在為牟取不正當(dāng)利益，利用牛乳粉充當(dāng)羊乳粉的現(xiàn)象，從定量的角度進(jìn)行摻假檢測能更好地鑒別是人為摻假還是無意沾染，檢測的結(jié)果能準(zhǔn)確得知摻假的質(zhì)量，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，能更加有利于市場監(jiān)管部門的監(jiān)管，為其提供技術(shù)支持。

綜上所述，微滴式數(shù)字PCR技術(shù)能夠準(zhǔn)確進(jìn)行羊乳粉的定量檢測，這為市場上羊乳粉摻假定量問題提供了一種技術(shù)手段，同時(shí)本研究也為除羊乳粉之外的其他乳粉定量檢測提供了一種檢測方向，健全了定量檢測體系。