盧春霞，閆圣坤，劉成江，林祥群，王雙慧，馮曉汀

（1.長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 408100；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所，新疆 烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000；4.新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

蘇丹紅是一種人工合成的親脂類偶氮染料，主要包括蘇丹紅I、II、III、IV 4種類型。由于其增色效應(yīng)顯著，常被作為非法添加劑用于改良番茄、辣椒等產(chǎn)品外觀，直接或間接危害人體健康。蘇丹紅被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為三類致癌物，其中蘇丹紅III的初級代謝產(chǎn)物4-氨基偶氮苯被列為二類致癌物[1]。我國及歐盟嚴(yán)禁將蘇丹紅作為色素添加劑在食品和飼料中使用。除了人為添加，一些農(nóng)產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中由于環(huán)境污染、肥料、農(nóng)藥和塑料包裝等不規(guī)范使用以及一些不明因素，導(dǎo)致其一定程度上受到蘇丹紅交叉污染[2]。因此，準(zhǔn)確、靈敏、快速地檢測食品中蘇丹紅染料的方法對食品安全監(jiān)管有著十分重要意義。

目前，蘇丹紅檢測方法主要包括儀器分析方法，如高效液相色譜法[3]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)[4]。色譜與質(zhì)譜技術(shù)靈敏度較高、結(jié)果可靠，但樣品預(yù)處理復(fù)雜、檢測成本高、有機(jī)溶劑用量大、且儀器設(shè)備昂貴，需要專業(yè)的操作人員。免疫分析方法[5]是應(yīng)用較為廣泛的快篩檢測方法，與儀器分析法相比具有特異性強(qiáng)、操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但抗體制備周期長，成本較高。

核酸適配體是與靶分子特異性結(jié)合的一段單鏈DNA或RNA，由指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)從隨機(jī)單鏈寡核苷酸庫中篩選獲得。適配體與靶標(biāo)結(jié)合時可折疊成發(fā)夾、莖環(huán)、假結(jié)體及G-四鏈體等結(jié)構(gòu)，通過氫鍵、范德華力和堿基堆積等作用進(jìn)行分子識別。基于隨機(jī)文庫的龐大庫容和單鏈核苷酸空間結(jié)構(gòu)的多樣性，適配體幾乎可以與所有種類的靶標(biāo)[6-12]發(fā)生結(jié)合。與傳統(tǒng)的抗體相比，核酸適配體具有不受免疫原限制、可人工合成、成本低廉、應(yīng)用范圍廣、易于標(biāo)記和保存等優(yōu)點(diǎn)。因此，適配體作為新型識別探針在食品分析領(lǐng)域得到廣泛研究和應(yīng)用[13-15]。

在常規(guī)比色檢測中，納米材料和生物酶常作為發(fā)光信號標(biāo)記在識別探針上。但是這種標(biāo)記方法耗時耗力，且天然酶成本高，對保存環(huán)境要求高。血紅素/G-四鏈體DNA酶則是近年來迅速發(fā)展起來的一種人工合成的DNA酶。富含鳥嘌呤堿基（G）的DNA序列通過氫鍵作用折疊成特殊的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，當(dāng)與氯化血紅素結(jié)合后，形成一種具有過氧化物酶活性的DNA酶，能催化H2O2氧化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）或2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二胺鹽（2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS），生成藍(lán)色TMB+或綠色ABTS陽離子自由基。與天然酶相比，該酶熱穩(wěn)定性高、價格便宜、合成簡單、易于標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域[16]。由于食品樣品成分復(fù)雜、干擾大，基質(zhì)效應(yīng)可能影響檢測靈敏度。為實現(xiàn)對靶標(biāo)的高靈敏檢，有研究者將G-四鏈體DNA酶與雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hybridization chain reaction，HCR）相結(jié)合，構(gòu)建生物傳感器應(yīng)用于生物標(biāo)記物、微生物、毒素、金屬離子等檢測[17-18]。但目前尚未見到基于適配體識別-氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶檢測蘇丹紅的研究報道。

本研究以蘇丹紅III適配體為識別元件，以氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶為信號探針，結(jié)合HCR信號放大策略構(gòu)建一種比色生物傳感器。檢測原理如圖1所示，該傳感器由一個檢測探針和兩個發(fā)夾DNA探針（H1和H2）組成，檢測探針由蘇丹紅III適配體序列、觸發(fā)HCR反應(yīng)的啟動序列，以及與適配體互補(bǔ)的序列組成，H1和H2包括非活性構(gòu)型的G-四鏈體序列作為功能元件。無靶標(biāo)時，檢測探針形成發(fā)夾折疊結(jié)構(gòu)，無法引發(fā)HCR反應(yīng)，當(dāng)靶標(biāo)結(jié)合適配體后打開檢測探針引發(fā)HCR反應(yīng)，生成大量富G-四鏈體的雙鏈DNA納米線，加入血紅素后，形成具有過氧化物酶活性的氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶，催化H2O2氧化底物并顯色。構(gòu)建的傳感器可用于簡單、靈敏、快速地進(jìn)行蘇丹紅比色檢測，為食品中蘇丹紅的檢測提供一定的技術(shù)支撐。

圖1 基于氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色測定蘇丹紅示意圖Fig. 1 Schematic illustration of colorimetric detection of Sudan based on hemin/G-quadruplex DNAzymes

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火鍋料、辣椒醬、辣椒粉均購于本地超市。

蘇丹紅I（CAS號842-07-9）、蘇丹紅II（CAS號3118-97-6）、蘇丹紅III（CAS號85-86-9）、蘇丹紅IV（CAS號85-83-6）、對位紅（CAS號6410-10-2）、日落黃（CAS號2783-94-0）標(biāo)準(zhǔn)品 上海安譜實驗科技股份有限公司；牛血清白蛋白、二甲基亞砜、氯化血紅素、吐溫-20、TMB顯色試劑盒、HgCl2、Pb(NO)2、CdCl2、AgNO3生工生物工程（上海）股份有限公司；鏈霉親和素包被的酶標(biāo)板 蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

用乙腈將蘇丹紅配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的蘇丹紅原液，置于-20 ℃避光保存。使用時用pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（含8 g NaCl、0.2 g KCl、0.24 g KH2PO4、1.44 g Na2HPO）稀釋蘇丹紅原液至所需的質(zhì)量濃度。

將氯化血紅素溶于二甲基亞砜中配制成5 mmol/L的氯化血紅素原液，置于4 ℃避光保存。使用時用PBS稀釋至所需濃度。

生物素化檢測探針由蘇丹紅III核酸適配體[19]和觸發(fā)HCR反應(yīng)的啟動序列組成；發(fā)夾DNA探針在5'（或3'）和3'（或5'）端分別含有3/4和1/4的G-四鏈體序列[20]；探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其堿基序列見表1。

表1 檢測探針及發(fā)夾DNA探針序列Table 1 Sequences of the detection probe and hairpin DNA probes

1.2 儀器與設(shè)備

5MX 96 孔板混勻儀 美國賽洛捷克公司；Mk3酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司；MS3 basic渦旋混合器德國IKA公司；Milli-QReference超純水系統(tǒng) 美國密理博公司；5424R臺式冷凍離心機(jī) 德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器測定蘇丹紅III

鏈霉親和素包被的酶標(biāo)板使用前用PBST溶液（0.05%吐溫-20+PBS）洗滌3次，加入100 μL 80 nmol/L生物素化檢測探針，室溫孵育20 min。PBST溶液洗滌3次，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的牛血清白蛋白溶液，封閉2 h，PBST洗滌后備用。將100 μL一定質(zhì)量濃度的蘇丹紅III標(biāo)準(zhǔn)品加入到酶標(biāo)板，室溫孵育30 min，PBST洗滌。H1和H2使用前于95 ℃加熱5 min，然后緩慢冷卻至室溫。分別向酶標(biāo)板中加入50 μL 400 nmol/L的H1和H2，37 ℃孵育60 min。PBST洗滌后加入100 μL 0.8 μmol/L氯化血紅素，室溫孵育30 min。PBST洗滌，加入100 μL TMB底物（含H2O2），室溫孵育5～8 min后，加入100 μL 1 mol/L HCl溶液停止反應(yīng)。通過顏色變化定性檢測蘇丹紅，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度。pH 7.4 PBS設(shè)置為空白對照。

1.3.2 檢測條件優(yōu)化

采用單因素優(yōu)化試驗分別優(yōu)化檢測探針濃度、靶標(biāo)與適配體結(jié)合時間、H1和H2濃度、HCR反應(yīng)時間、氯化血紅素濃度、氯化血紅素/G-四鏈體反應(yīng)時間的實驗條件。均以蘇丹紅III為待測靶標(biāo)，固定其質(zhì)量濃度為100 ng/mL。

1.3.2.1 檢測探針濃度優(yōu)化

固定適配體與靶標(biāo)結(jié)合時間50 min，發(fā)夾探針H1和H2濃度均為600 nmol/L、HCR反應(yīng)時間2 h，氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L，氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min，設(shè)置檢測探針濃度分別為20、40、80、100、150、200 nmol/L，采用1.3.1節(jié)方法進(jìn)行檢測，考察檢測探針濃度對檢測性能的影響。

1.3.2.2 靶標(biāo)與適配體結(jié)合時間優(yōu)化

采用上述優(yōu)化條件，固定發(fā)夾探針H1和H2濃度均為600 nmol/L、HCR反應(yīng)時間為2 h，氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L，氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min，設(shè)置適配體與靶標(biāo)結(jié)合時間分別為10、20、30、60、100 min，采用1.3.1節(jié)方法進(jìn)行檢測。

1.3.2.3 發(fā)夾探針濃度優(yōu)化

采用上述優(yōu)化條件，固定HCR反應(yīng)時間2 h，氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L，氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min，設(shè)置發(fā)夾探針H1和H2濃度分別為50、100、200、400、600、800 nmol/L，采用1.3.1節(jié)方法進(jìn)行檢測。

1.3.2.4 HCR反應(yīng)時間

采用上述優(yōu)化條件，固定氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L，氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min，設(shè)置HCR反應(yīng)時間分別為30、60、90、120、150 min，采用1.3.1節(jié)方法進(jìn)行檢測。

1.3.2.5 氯化血紅素濃度優(yōu)化

采用上述優(yōu)化條件，固定氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min，設(shè)置氯化血紅素濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 μmol/L，采用1.3.1節(jié)方法進(jìn)行檢測。

1.3.2.6 氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間優(yōu)化

采用上述優(yōu)化條件，設(shè)置氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間分別為10、30、60、90、120 min，采用1.3.1節(jié)方法進(jìn)行檢測。

1.3.3 重金屬離子對氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測的干擾測定

采用1.3.2節(jié)中優(yōu)化的實驗條件，將相同濃度（1 μmol/L）的Hg2+、Ag+、Pb2+、Cd2+、Cu2+分別添加到蘇丹紅III溶液中，按照1.3.1節(jié)方法進(jìn)行檢測，測定重金屬離子對該方法的干擾程度。

1.3.4 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測性能測定

1.3.4.1 靈敏度測定

在優(yōu)化條件下，用pH 7.4 PBS將蘇丹紅III標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋系列梯度質(zhì)量濃度（0、0.1、0.5、1、5、10、50、250 ng/mL），用1.3.1節(jié)方法進(jìn)行檢測，觀察溶液顏色變化，在450 nm波長處測定吸光度。以蘇丹紅III質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性擬合，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)，計算方法的檢測限（limits of detection，LOD）：

式中：σ為空白對照檢測10次的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差；S為斜率。

1.3.4.2 特異性測定

采用1.3.1節(jié)的方法檢測相同質(zhì)量濃度（100 ng/mL）的蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅IV、對位紅、日落黃標(biāo)準(zhǔn)品，同時設(shè)PBS為空白對照。觀察溶液顏色變化，在450 nm波長處測定吸光度。

1.3.4.3 實際樣品測定

參考GB/T 19681—2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法 高效液相色譜法》[21]對樣品進(jìn)行前處理，稱取2 g辣椒醬、辣醬粉、番茄醬樣品（精確到0.001 g），分別添加高、中、低3種水平的蘇丹紅III標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)含量分別為5、50、200 ng/g。然后加入10 mL正己烷，振蕩混勻，超聲提取10 min，以5 000 r/min離心5 min。移取正己烷層，殘渣用正己烷重復(fù)提取1次，合并兩次上清液。氮吹儀濃縮上清液，乙腈定容至1 mL，用PBS稀釋5 倍后采用1.3.1節(jié)的方法進(jìn)行檢測，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。同時采用GB/T 19681—2005[21]對樣品進(jìn)行檢測，并對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測條件優(yōu)化

如圖2A所示，吸光度隨著檢測探針濃度的增加而增加，當(dāng)濃度超過80 nmol/L后，吸光度無顯著變化（P＞0.05），故檢測探針最佳濃度為80 nmol/L。如圖2B所示，吸光度隨著結(jié)合時間的延長而增大，當(dāng)結(jié)合時間大于30 min后，吸光度無顯著變化（P＞0.05），意味著反應(yīng)基本達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，后續(xù)實驗選擇靶標(biāo)與適配體的結(jié)合時間為30 min。如圖2C所示，當(dāng)H1和H2濃度均達(dá)到400 nmol/L后，吸光度無顯著變化（P＞0.05），可能是由于H1和H2濃度過大產(chǎn)生了空間位阻，影響了雜交鏈的進(jìn)一步形成。HCR反應(yīng)時間過短會影響檢測靈敏度，但時間過長則會影響檢測效率，圖2D表明，當(dāng)時間超過60 min后，吸光度無顯著變化（P＞0.05），說明反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，故HCR反應(yīng)時間選擇60 min。由圖2E和F可知，氯化血紅素最佳濃度為0.8 μmol/L，氯化血紅素和G-四鏈體最佳反應(yīng)時間為30 min。

圖2 不同實驗條件對蘇丹紅III檢測的影響Fig. 2 Effects of different experimental conditions on the detection of Sudan III

2.2 重金屬離子對氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測的干擾分析

一些金屬離子可選擇性地與DNA雙鏈中的堿基結(jié)合，形成金屬介導(dǎo)的堿基對。研究證明一些金屬離子能促進(jìn)或阻礙氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶的形成，進(jìn)而影響DNA酶活性[22-27]。從圖3可以看出，金屬離子對溶液的吸光度無顯著影響，主要原因可能與設(shè)計的探針序列及功能不同有關(guān)，基于氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶測定重金屬離子的傳感器，大都依賴于設(shè)計富含特定堿基的功能序列識別重金屬離子來完成檢測[22-26]。比如，利用Ag+通過C-Ag+-C配位鍵促進(jìn)氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶活性以實現(xiàn)Ag+檢測[22]。利用Hg2+與T堿基特異性結(jié)合原理，通過形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)抑制或促進(jìn)該DNA酶活性實現(xiàn)Hg2+的檢測[23-25]。而本實驗所用探針（H1和H2）并不是針對重金屬離子設(shè)計的功能探針，在形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)時，無法形成錯配的雙鏈結(jié)構(gòu)。所以，重金屬離子對DNA酶的活性影響不大。

圖3 重金屬離子對氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器的影響Fig. 3 Effect of heavy metal ions on the colorimetric biosensor based on hemin/G-quadruplex DNAzymes

2.3 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測性能分析

2.3.1 靈敏度分析

如圖4A所示，當(dāng)蘇丹紅III質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL時，肉眼可見明顯的顏色變化，因此，該方法可視化LOD為0.5 ng/mL。由圖4B可知，吸光度隨著蘇丹紅III質(zhì)量濃度的增加而增加，蘇丹紅III在0.5～250 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（R＝0.995），LOD為0.09 ng/mL。由表2可知，與GB/T 19681—2005方法[21]和文獻(xiàn)的蘇丹紅檢測方法相比，本研究建立的方法具有高靈敏度。

圖4 不同蘇丹紅III質(zhì)量濃度下的檢測體系顏色（A）與吸光度（B）變化Fig. 4 Changes in the detection system’s color (A) and absorbance value (B) versus concentrations of Sudan III

表2 蘇丹紅檢測方法比較Table 2 Comparison of reported methods for the detection of Sudan dyes

2.3.2 特異性分析

如圖5所示，當(dāng)檢測體系中含有質(zhì)量濃度為100 ng/mL的蘇丹紅I～I(xiàn)V時，溶液在450 nm波長處的吸光度達(dá)到0.47～0.62，而對位紅和日落黃并未引起反應(yīng)溶液顏色明顯變化，其吸光度與空白樣品差異不顯著（P＞0.05）。表明該適配體對蘇丹紅I～I(xiàn)V具有類選擇性，可能是由于蘇丹紅I～I(xiàn)V結(jié)構(gòu)高度相似，這對檢測一類結(jié)構(gòu)相似的靶標(biāo)時可能更有應(yīng)用意義。然而Wang Ying等[19]的特異性分析結(jié)果顯示，蘇丹紅III適配體與蘇丹紅I、II和IV沒有明顯交叉反應(yīng)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

圖5 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測蘇丹紅特異性評估Fig. 5 Specificity analysis of colorimetric biosensor based on hemin/G-quadruplex DNAzymes for Sudan detection

2.3.3 實際樣品分析

如表3所示，本方法的加標(biāo)回收率為84.3%～101.6%，RSD為4.13%～8.36%。本方法的加標(biāo)回收率與GB/T 19681—2005法相比差異不顯著（P＞0.05），表明本方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表3 氯化血紅素/G四鏈體DNA酶比色生物傳感器法與GB/T 19681—2005高效液相色譜法加標(biāo)回收對比（n ＝3）Table 3 Comparison of spiked recoveries between colorimetric biosensor based on hemin/G-quadruplex DNAzymes and HPLC (n = 3)

3 結(jié) 論

以蘇丹紅III適配體為識別分子，以氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶為信號探針，結(jié)合HCR信號放大策略，構(gòu)建了一種簡單、新穎、高靈敏的比色生物傳感器，用于檢測食品中蘇丹紅。在優(yōu)化條件下，該比色傳感器方法LOD為0.09 ng/mL，加標(biāo)回收率為84.3%～101.6%，RSD為4.13%～8.36%，可特異性識別蘇丹紅I、II、III、IV，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。與GB/T 19681—2005方法相比，本方法樣品前處理簡單、不需要大型儀器；與傳統(tǒng)的免疫方法相比，不需要制備抗體，檢測成本低廉，同時也可實現(xiàn)高通量檢測；可為批量實現(xiàn)食品中蘇丹紅的快速檢測提供一定技術(shù)支撐。