任栩慧 許平翠 鄧雪慧 吳美蘭 王娜妮,#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

3 浙江景岳堂藥業(yè)有限公司 浙江 紹興 312025

知母是百合科植物知母的干燥根莖，其化學(xué)成分種類(lèi)復(fù)雜，最主要的為黃酮類(lèi)和甾體皂苷類(lèi)[1，2]，具有多種藥理作用，如抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、抗炎[5]、抗骨質(zhì)疏松等[6]。目前，知母的炮制飲片主要包括凈知母、清炒知母、麩炒知母、酒知母、醋知母、鹽知母、知母炭等7種規(guī)格[7]。知母的藥性會(huì)隨著炮制的不同而發(fā)生改變。例如，凈知母苦寒滑利，多用于溫病壯熱煩渴[8]；鹽炙可引藥下行，專(zhuān)于入腎，能增強(qiáng)滋陰降火的作用[9]；與鹽炙相反，酒炙則引藥上行[10]，改變藥性[11]；目前對(duì)于知母炮炙前后藥理藥效變化的研究熱點(diǎn)多在滋陰降火方面?，F(xiàn)已有關(guān)于知母炮制前后化學(xué)成分變化的報(bào)道，但是主要集中于鹽炙或麩炒方法，對(duì)以上7種炮制規(guī)格知母飲片化學(xué)成分的系統(tǒng)對(duì)比尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)前期課題組優(yōu)化的炮制工藝對(duì)知母進(jìn)行炮制，比較不同炮制品水溶性浸出物和2種成分含量的差異，研究不同炮制方法的影響，以期對(duì)臨床選用知母炮制品和藥理活性研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器：Agilent 1260 Infinity Ⅱ Prime液相色譜儀（Agilent公司，配備蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器）、KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、ME104E型電子天平（梅特勒公司）、DK-S24型電熱恒熱水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、BPG-9056A精密鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、Smart2PureUV/UF純水儀（THERMO）、具塞錐形瓶、移液槍、移液管、蒸發(fā)皿。

1.2 藥品及試劑：知母藥材購(gòu)于浙江景岳堂藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地為河北（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：中國(guó)藥典2015年版），芒果苷（批號(hào)：151226，純度≥98%）購(gòu)于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，知母皂苷BⅡ（批號(hào)：16041602，純度：99.45%）購(gòu)于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；乙腈溶液（色譜純）、稀乙醇。知母樣品經(jīng)不同炮制方法后性狀見(jiàn)圖1。

圖1 知母樣品經(jīng)不同炮制方法后表觀變化

2 方法與結(jié)果

2.1 知母炮制品的制備：①凈知母：取大小均勻的知母原藥材，將雜質(zhì)去除后放置于滾筒式洗藥機(jī)洗凈，潤(rùn)制一段時(shí)間后晾曬，切薄片，厚度為4mm左右，50℃恒溫干燥。②清炒知母：取大小均勻的知母片，置于熱鍋中，用文火炒至知母呈焦，用器具將其取出后篩去碎屑，晾涼，備用，即得。③麩炒知母：將麩皮均勻撒入熱鍋中，待飄起青煙后，倒入知母片，炒至顏色開(kāi)始泛黃后取出，再篩去麩皮，晾涼，備用，即得。④酒知母：取大小均勻的知母片一定量，加入適量黃酒悶潤(rùn)，待酒液被完全吸盡后，置于炒制容器內(nèi)，用文火加熱至炒干，取出晾涼，備用，即得。⑤醋知母：取一定量知母片，加入適量醋悶透，待醋被吸盡后，放置于自控溫旋蓋電炒藥機(jī)內(nèi)，加熱，炒10min，取出晾涼，即得。⑥鹽知母：取一定量知母片，加一定濃度的食鹽水拌勻，悶透，待鹽水被吸盡后，放置于自控溫旋蓋電炒藥機(jī)內(nèi)加熱，炒10min，取出晾涼，即得。⑦知母炭：將知母生藥放在鐵鍋內(nèi)用火炒黑存性，即得。

2.2 分析方法：分述如下。

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制：精密稱(chēng)取芒果苷和知母皂苷BⅡ，加稀乙醇配置成每1mL含50μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的配制：取知母藥材或其不同炮制品粉末（過(guò)三號(hào)篩）0.1g，精密稱(chēng)定，置25mL具塞錐形瓶中，加稀乙醇25mL，稱(chēng)重，超聲提取（功率40w，頻率100Hz），補(bǔ)足失重。過(guò)0.22μm膜孔濾膜，置于進(jìn)樣瓶進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。

2.2.3 色譜條件：Inertsil ODS-3 C18色譜柱（4.6×250mm，5μm），流動(dòng)相：乙腈（B）-0.2醋酸水（A）溶液，梯度洗脫程序：0～15min，10%～15%B；15～20min，15%～25%B；20～25min，25%～35%B；35～40min，60%～90%B；40～45min，90%～10%B；柱溫30℃，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)258nm，ELSD氣體流速1.6mL/min，漂移管溫度80℃，進(jìn)樣量20μL。

2.3 方法學(xué)考察：分述如下。

2.3.1 線性關(guān)系：精密移取1.0mg/mL的芒果苷和知母皂苷BⅡ?qū)φ掌啡芤哼m量，用流動(dòng)相梯度稀釋?zhuān)?.2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（x），芒果苷或知母皂苷BⅡ峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性方程，詳見(jiàn)表1。

表1 芒果苷和知母皂苷BⅡ的線性方程及線性范圍

2.3.2 精密度：取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算芒果苷和知母皂苷BⅡ的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性：取同一知母樣品，按2.2.2項(xiàng)供試品溶液制備方法平行制備6份，按2.2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算芒果苷和知母皂苷BⅡ的RSD均小于3.0%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性：取同一知母供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24h，按2.2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算芒果苷和知母皂苷BⅡ的RSD均小于3.0%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.4 色譜分析結(jié)果：將芒果苷、知母皂苷BⅡ?qū)φ掌啡芤汉椭覆煌谥茦悠啡芤旱纳V圖進(jìn)行對(duì)比，見(jiàn)圖2。

圖2 知母炮制品液相色譜圖

在蒸發(fā)光散射檢測(cè)器下，知母皂苷BⅡ出峰時(shí)間約為25.0min；在紫外檢測(cè)器下，芒果苷出峰時(shí)間約為17.8min。樣品色譜圖分離度良好，直觀可見(jiàn)不同知母炮制品峰高、峰面積各有差異。

2.5 不同炮制方法測(cè)得芒果苷、知母皂苷BⅡ、浸出物的含量比較：研究從藥材到炮制品，芒果苷、知母皂苷BⅡ、浸出物含量的量值傳遞規(guī)律，分析不同炮制方法對(duì)量值傳遞的影響。7種炮制品與知母藥材相比，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同炮制方法對(duì)知母飲片芒果苷、知母皂苷BII和浸出物的影響

采用HPLC-UV-ELSD方法中的UV檢測(cè)器，可檢測(cè)不同炮制品中芒果苷的含量。知母藥材中的芒果苷含量為0.97%，知母炭中的芒果苷含量最少，為0.35%，而最高的是醋知母，為1.90%，其次是麩炒知母。按芒果苷含量高低排列為：醋知母＞麩炒知母＞凈知母＞酒知母＞鹽知母＞清炒知母＞知母片＞知母炭。采用HPLC-UVELSD方法中的ELSD檢測(cè)器，可檢測(cè)出不同炮制品中知母皂苷BⅡ的含量。知母藥材中的知母皂苷BⅡ?yàn)?.28%，凈知母中知母皂苷BⅡ的含量最高，為3.55%，其次為酒知母，最低的是知母炭?jī)H為2.19%。按知母皂苷BⅡ含量高低排列是：凈知母＞酒知母＞醋知母=鹽知母＞清炒知母=麩炒知母＞知母片＞知母炭。

采用熱浸法，以水作為溶劑分析不同炮制品中浸出物的含量。知母藥材的浸出物為47.61%，炮制后的知母除知母炭和麩炒知母外都有不同程度的增加，浸出物最低的飲片是麩炒知母，比知母藥材少了2.36%，知母炭和麩炒知母的浸出物分別為47.12%和45.25%。浸出物最高的飲片為酒知母，比知母藥材高了11.14%，為58.75%。凈知母為49.21%，清炒知母為49.38%，醋知母為55.92%，鹽知母為50.23%。按浸出物含量高低排列為：酒知母＞醋知母＞鹽知母＞清炒知母＞凈知母＞知母片＞知母炭＞麩炒知母。

3 討論

芒果苷的含量在各炮制品中都有增加，可能有以下三個(gè)原因：①炮制加熱使知母藥材質(zhì)地疏松，加速了芒果苷溶出；②加熱會(huì)引起新芒果苷7位糖苷鍵(Glu-O)斷裂轉(zhuǎn)化為芒果苷，導(dǎo)致芒果苷的含量在炮制品中變化[12]；③鹽炙工藝研究更有利于新芒果苷水解生成芒果苷[13，14]。

知母中含有知母皂苷AⅢ、BⅡ、B等甾體皂苷，有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)炮制后知母皂苷E的含量有所降低，而知母皂苷AⅢ、BⅡ、BⅢ的含量升高。推測(cè)可能由于知母皂苷E分子結(jié)構(gòu)為呋甾烷醇型皂苷型，由于其本身化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在加熱、加鹽的因素下，轉(zhuǎn)化為知母皂苷BⅡ[15]。知母炭的炮制條件相對(duì)比較苛刻，可能造成了知母中多種有效成分的分解，因此芒果苷和知母皂苷BⅡ含量均顯著降低。

中醫(yī)臨床常用的300種飲片中，醋炙品約70余種，各種文獻(xiàn)表明，醋炙可以增效，用來(lái)增加有效成分的溶解度，增加有效成分的含量或溶出量，引藥入肝；還可以減毒，破壞毒性成分，降低毒性成分含量[16]。

酒炙法是中藥炮制的重要方法之一，傳統(tǒng)中藥炮制理論認(rèn)為：藥物酒炙后有升提作用，緩和藥物的寒性，酒炙后藥物中有效成分或輔助成分的溶出量會(huì)增加，各不同成分的溶出比例也會(huì)發(fā)生變化。有研究表明酒炙知母對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用弱于生知母，但不能說(shuō)明酒炙知母的降糖效果弱于生知母，因?yàn)樘悄虿〉陌l(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，我們還需從不同的降糖機(jī)制入手，考察其他降糖指標(biāo)[17]。

綜觀古今知母的炮制技術(shù)，絕大多數(shù)都是以鹽為輔料，采用炒、拌等方法來(lái)炮制知母，其中用的最多的便是鹽炙法，即使目前藥典及全國(guó)大部分地區(qū)炮制知母大多采用鹽炙法，炮制對(duì)知母化學(xué)成分及藥理作用產(chǎn)生的影響至今都沒(méi)有完全開(kāi)發(fā)。因而我們需要在整理歷代炮制沿革的基礎(chǔ)上對(duì)各種炮制方法進(jìn)行系統(tǒng)研究，早日實(shí)現(xiàn)知母炮制的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化及現(xiàn)代化，保證其臨床用藥的安全有效，加強(qiáng)對(duì)知母炮制的現(xiàn)代化研究。