莫達瑜 趙陽春 應(yīng) 翩 沈 雁 趙 蕾#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310005 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

圍絕經(jīng)期綜合征（PMS）是指絕經(jīng)期前后婦女伴隨著卵巢功能逐漸衰退、雌激素水平下降而出現(xiàn)的以內(nèi)分泌失調(diào)和植物神經(jīng)功能紊亂為主，伴有神經(jīng)、心理癥狀的一組癥候群[1]。中醫(yī)各醫(yī)家治療PMS雖用藥不同，但總體治療準則是從肝腎論治[2]。寧更培元湯為浙派裘氏婦科嫡系傳人張萍青教授的驗方，針對PMS肝腎陰虛的重要病機，以“益氣養(yǎng)血、滋補肝腎”為法，能明顯緩解PMS典型癥狀。筆者以圍絕經(jīng)期大鼠為研究對象，觀察裘氏寧更培元湯對PMS模型的子宮卵巢指數(shù)、血清性激素水平、卵巢組織雌激素受體及其關(guān)鍵酶表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物：健康雌性SPF級Wistar大鼠50只，13月齡、體質(zhì)量220～260g，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（浙）2018-0012。大鼠于干燥、通風(fēng)、安靜、室溫（24±2）℃、濕度50%～60%的實驗動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后用于實驗。

1.2 藥物：裘氏寧更培元湯組方：牡丹皮、地骨皮、黑大豆、癟桃干、制首烏、制龜甲、山萸肉、珍珠母、夜交藤、淮小麥、大棗和山藥共12味藥材。上述飲片浸泡蒸餾水后常規(guī)煎煮、過濾、濃縮為3g/mL的灌胃液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑：PVDF膜（Millipore公司，批號：K5JA5013L）；彩色預(yù)染蛋白分子量標準（Fermentas公司，批號：00174777）；雌二醇（E2）、促卵泡刺激素（FSH）和促黃體生成素（LH）定標液（德國羅氏公司，批號分別為：56672603、57173301和53179003）；ERα（cell signaling公司，批號：8644s）；17α-羥化酶（CYP17，Abcam公司，批號：ab125022）；17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-HSD，SANTA公司，批號：SC-376719）；β-Actin（上海聯(lián)科生物，批號：ab008-100）。

1.4 儀器：羅氏Cobas E602化學(xué)發(fā)光儀（德國羅氏公司）；SpectraMax Plus 384型全波長酶標儀（MD公司）；H1650R臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器公司）；Mini-Proten Tetra System電泳系統(tǒng)（Bio-RAD公司）；ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀（Bio-RAD 公司）。

1.5 方法：分述如下。

1.5.1 造模、分組及處理：參照自然衰老法[3]建立圍絕經(jīng)期大鼠模型：選擇動情周期紊亂、動情周期延長的40只初老Wistar大鼠，按體質(zhì)量勻齊原則分為4組：PMS模型組、中藥低、中和高劑量組。另選10只動情周期正常的Wistar大鼠作為正常對照組。按成人-大鼠體表面積換算，中藥低、中、高劑量組大鼠分別以臨床等效劑量的1/2、1和2倍（即0.168g/mL、0.336g/mL、0.672g/mL的生藥2mL）灌胃；正常對照組和PMS模型組均以等體積蒸餾水灌胃；每日1次，連續(xù)28d。

1.5.2 標本采集：末次給藥后24h，最后1次稱重并記錄后采血，收集靜脈血約5mL。后迅速脫頸法處死大鼠，打開大鼠盆腔，分離子宮、卵巢周圍脂肪組織，剖取子宮、卵巢。

1.5.3 評估大鼠子宮卵巢指數(shù)變化：剖取的子宮、卵巢在電子天平上稱取濕重并記錄，計算大鼠子宮、卵巢指數(shù)：①子宮指數(shù)=子宮濕重/大鼠體重×100%；②卵巢指數(shù)=雙側(cè)卵巢濕重/大鼠體重×100%。

1.5.4 化學(xué)發(fā)光法檢測大鼠血清性激素水平變化：眶靜脈血分離獲取血清，根據(jù)試劑盒要求檢測血清E2、FSH和LH的含量。

1.5.5 western blot法檢測卵巢雌激素受體及其關(guān)鍵酶水平變化：提取卵巢組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。各組均取20μg蛋白，加等體積上樣Buffer混合，100℃變性5min，以每孔20μL的上樣體積加入12%的分離膠和4%的濃縮膠中進行SDS-PAGE電泳30min，轉(zhuǎn)入PVDF，封閉1h；ERα、CYP17和17β-HSD一抗均以1∶1000稀釋，4℃雜交過夜；二抗以1∶5000稀釋，37℃反應(yīng)2h，洗膜3次后，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。圖像處理軟件分析條帶灰度值，β-actin為內(nèi)參校正上樣量。

1.5.6 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮卵巢指數(shù)比較：結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠子宮卵巢指數(shù)比較（±s，n=8）

表1 各組大鼠子宮卵巢指數(shù)比較（±s，n=8）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與PMS模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中藥中劑量組比較，**P＜0.01。

卵巢指數(shù)（100%）0.042±0.008 0.022±0.004##0.032±0.003△0.035±0.004△△0.037±0.007△△組別正常對照組PMS模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組子宮指數(shù)（100%）0.292±0.021 0.101±0.012##0.176±0.007△0.194±0.018△△0.226±0.015△△**

2.2 各組大鼠血清性激素水平比較：結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清性激素水平比較（±s，n=8）

表2 各組大鼠血清性激素水平比較（±s，n=8）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與PMS模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中藥中劑量組比較，*P＜0.05。

LH(IU/L)6.40±0.52 8.80±0.46##8.11±0.57 7.59±0.52△△6.90±0.39△△組別正常對照組PMS模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組E2(pmol/L)94.64±12.50 31.80±10.75##47.26± 8.67△62.38±11.14△△78.32±10.03△△*FSH(IU/L)4.36±0.61 6.11±0.57##5.48±0.29△5.11±0.27△△5.00±0.24△△

2.3 各組大鼠卵巢ERα及其關(guān)鍵酶CYP17、17β-HSD水平比較：與正常對照組比較，PMS模型組ERα、CYP17、17β-HSD的表達水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與PMS模型組比較，上述三個蛋白在中藥低劑量組的表達水平略有上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而中藥中、高劑量組ERα、CYP17和17β-HSD的表達水平均較PMS模型組明顯升高，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 各組卵巢ERα及其關(guān)鍵酶CYP17、17β-HSD水平比較

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實，下丘腦腺垂體分泌FSH和LH，通過二者協(xié)調(diào)作用刺激卵巢分泌成熟卵泡、產(chǎn)生E2，從而調(diào)節(jié)卵巢功能盛衰。在PMS的病理生理過程中，E2起到了極為重要的作用，它能夠調(diào)節(jié)性腺、神經(jīng)內(nèi)分泌、骨骼、心血管和其他組織的功能[4]。但是，雌激素需要與其受體相結(jié)合才可激活下游激素受體，從而傳遞給下丘腦-垂體-卵巢軸。卵巢雌激素受體α（Estrogen Receptor，ERα）作為雌激素結(jié)合的靶點[5]，在體內(nèi)的生物學(xué)特性上存在許多的差異，在調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸中占據(jù)重要地位。CYP17和17β-HSD作為編碼雌激素合成代謝關(guān)鍵酶的基因，已被多項研究證實與人體內(nèi)的內(nèi)源性雌激素水平有關(guān)聯(lián)[6]。CYP17、17β-HSD等關(guān)鍵酶均參與卵巢顆粒細胞雌激素的合成、代謝和運輸[7]。雌激素受體基因表達和這些酶的異常活性是導(dǎo)致PMS中圍絕經(jīng)期雌激素水平改變的主要因素。

本次實驗結(jié)果表明寧更培元湯能有效提升PMS大鼠的雌激素合成代謝水平，進而改善PMS癥狀，從分子水平揭示了該方的部分療效機制，為其進一步臨床推廣應(yīng)用提供了客觀依據(jù)。