何 冰，武愛龍，沈一躍，鄭佳明，吳建陽

(1 湛江幼兒師范專科學校，廣東湛江，524037；2 嶺南師范學院基礎(chǔ)教育學院，廣東湛江524037)

香蕉是世界四大水果之一[1]，主要產(chǎn)區(qū)為非洲、拉丁美洲和亞洲，全球117個香蕉生產(chǎn)國家和地區(qū)中，中國香蕉種植面積排名第二，僅次于印度[2-3]。中國香蕉主產(chǎn)區(qū)為臺灣、福建、海南、云南、廣西、廣東等省(區(qū))，其中廣東省產(chǎn)量最大。香蕉是呼吸躍變型果實，果實一般綠硬期采收，后熟食用[4]。

泛素是一種高度保守的蛋白，通過和其他蛋白共價結(jié)合發(fā)揮作用。泛素結(jié)合酶(Ubiquitin-conjugating enzymes，E2s)在DNA修復、核糖體合成、細胞周期調(diào)控等多種真核生物代謝過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。所有E2s蛋白都有UBC保守結(jié)構(gòu)域，里面含有1個半胱氨酸活性位點[7-8]。泛素結(jié)合酶變體蛋白(Ubiquitin-conjugating E2 enzyme variant，UEV)[9]，又被稱為類泛素結(jié)合酶蛋白家族，其結(jié)構(gòu)和序列都與E2s相似，但沒有半胱氨酸催化位點，所以該蛋白沒有結(jié)合泛素的活性，但由于UBC可以彼此相互作用，形成同二聚體或異二聚體[10]，進而影響這些UBC的活性和底物特異性，而UEV與UBC有非常高的同源性，因此UEV可以與某些UBC形成異二聚體，并對這些特定的UBC的泛素化作用進行負性或正性調(diào)控，因此UEV蛋白也可能參與對蛋白泛素化的調(diào)控[11]。

UEV參與激素信號、DNA 損傷和非生物脅迫等多種生物學功能[12]，MMS2是酵母芽細胞中第一個被鑒定的UEV1基因，參與酵母DNA損傷[13]。擬南芥中4個UEV1基因都可以補充酵母mms2缺失突變體，UEV1D 缺失減弱了植株對DNA損傷劑的耐受性[14]。水稻OsUEV1s的表達可以讓酵母mms2突變體不被DNA損傷劑致死[15]。UEV基因與果實成熟的關(guān)系研究在香蕉中未見報道。本研究從香蕉基因組中首次鑒定出VUEV基因家族所有成員，分析其理化性質(zhì)、亞細胞定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序和進化關(guān)系，探析其在香蕉后熟過程的表達模式，以期為研究UEV基因在香蕉后熟過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所香蕉園內(nèi)，采摘七至八成熟香蕉，帶回實驗室分成單果指，用清水沖洗干凈，挑選外觀一致的果實用500 mg/L施保功處理3 min后晾干，待其自然成熟，采摘當天標記為0 d，分別在采后0、1、4、7、17 d等5個時間點取樣備用(見圖1)。

圖1 香蕉采后不同時間果實外觀變化

1.2 擬南芥和香蕉UEV基因序列獲取

先利用TAIR數(shù)據(jù)庫(http：//www.arabidopsis.org/index.jsp)獲得擬南芥所有UEV基因序列，接著通過擬南芥UEV序列在香蕉基因組數(shù)據(jù)庫(https：//banana-genome-hub.southgreen.fr/)中進行BLAST比對，再將獲得的序列放在NCBI中進行BLAST比對，最終獲得香蕉UEV基因序列。

1.3 香蕉UEV基因家族蛋白基本理化性質(zhì)

利用ExPASy在線軟件獲得UEV蛋白的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點、親水指數(shù)和不穩(wěn)定系數(shù)，利用SOPMA在線分析軟件對UEV蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行分析，利用CELLO在線軟件對UEV蛋白亞細胞定位進行分析。

1.4 香蕉UEV家族基因結(jié)構(gòu)、保守基序和進化樹分析

利用MEME在線軟件對UEV蛋白的保守基序進行分析，基序的最大數(shù)目設(shè)置為10。利用TBtools軟件[16]對UEV基因結(jié)構(gòu)進行分析。利用ClustalX進行氨基酸序列比對，利用MEGA 6.0的鄰接法對UEV蛋白家族的進化樹進行構(gòu)建。

1.5 香蕉MaUEV熒光定量表達分析

香蕉總RNA利用植物RNA提取試劑盒提取(華越洋)，cDNA利用TaKaRa公司的M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶合成。實時熒光定量PCR在RoChe Light Cycler 480Ⅱ儀器上進行，利用TaRaKa公司熒光定量PCR試劑盒進行反應，反應體系20 μL，反應程序按說明書進行，每個反應重復3 次。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果查找在采后成熟過程中有表達差異的UEV基因，共計10個，依據(jù)其基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計熒光定量引物，引物序列見表1，以香蕉Actin基因為內(nèi)參，香蕉UEV基因的相對表達量采用2-ΔΔCT方法計算。

表1 香蕉UEV引物

2 結(jié)果與分析

2.1UEV基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

試驗結(jié)果看出，在香蕉基因組中共鑒定UEV基因13個，根據(jù)它們在染色體上的位置分別命名為MaUEV1～MaUEV13，MaUEV基因分布在1、3、4、5、7、9、10、11號染色體上，其中9號染色體上分布的UEV基因數(shù)量最多，為3個，1、3、4號染色體上分布的UEV基因數(shù)量次之，為2個。MaUEV基因開放閱讀框介于471～1 637 bp，編碼氨基酸數(shù)量127 ～495個，分子量14 212.34～56 209.83 Da，13個MaUEV基因的等電點均小于7；8個MaUEV基因為穩(wěn)定蛋白，其不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，5個MaUEV基因為不穩(wěn)定蛋白，其不穩(wěn)定指數(shù)均大于40；13個MaUEV基因的總平均疏水指數(shù)均小于0，為親水性蛋白(見表2)。

表2 香蕉UEV基因家族成員理化性質(zhì)

2.2 UEV蛋白家族二級結(jié)構(gòu)預測及亞細胞定位分析

試驗結(jié)果看出，13個MaUEV蛋白均由無規(guī)則卷曲、擴展鏈結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋組成，但不同基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)所占比例差異較大，β-轉(zhuǎn)角在所有基因占比最低。其中MaUEV1、MaUEV2、MaUEV7、MaUEV13等4個蛋白中無規(guī)則卷曲所占比例最大，擴展鏈結(jié)構(gòu)次之，α-螺旋再次之；MaUEV3、MaUEV4、MaUEV8、MaUEV12等4個蛋白中α-螺旋所占比例最大，無規(guī)則卷曲次之，擴展鏈結(jié)構(gòu)再次之；MaUEV5、MaUEV6、MaUEV9、MaUEV10、MaUEV11等5個蛋白中無規(guī)則卷曲所占比例最大，α-螺旋次之，擴展鏈結(jié)構(gòu)再次之。除MaUEV3蛋白定位在葉綠體、細胞質(zhì)和細胞核外，其他基因編碼蛋白都定位在細胞核(見表3)。

表3 香蕉UEV蛋白家族二級結(jié)構(gòu)及亞細胞定位

2.3UEV基因家族結(jié)構(gòu)、保守基序和進化分析

試驗結(jié)果看出，除了MaUEV4無內(nèi)含子外，其余12個MaUEV基因均由內(nèi)含子和外顯子組成，內(nèi)含子數(shù)量介于1～12之間，外顯子數(shù)量介于1～13之間。其中，MaUEV8基因內(nèi)含子和外顯子數(shù)量最多，有12個內(nèi)含子和13個外顯子(見圖2)。利用MEME軟件對UEV基因保守基序分析發(fā)現(xiàn)，MaUEV8只有1個保守基序，MaUEV1、MaUEV2、MaUEV7、MaUEV13具有3個相同的基序，MaUEV3和MaUEV12具有6個相同的基序，MaUEV5和MaUEV6具有1個相同的基序，MaUEV9和MaUEV11具有4個相同的基序(見圖3)。構(gòu)建了香蕉、擬南芥、水稻UEV的進化樹，香蕉UEV與水稻的親緣關(guān)系更近，且MaUEV1和MaUEV13、MaUEV9和MaUEV11、MaUEV3和MaUEV12聚類在一起，這與它們基因結(jié)構(gòu)和保守基序數(shù)量相同(見圖4)。

圖2 香蕉UEV家族基因結(jié)構(gòu)

圖3 香蕉UEV基因家族保守基序

圖4 香蕉、擬南芥和水稻UEV蛋白系統(tǒng)進化樹

2.4 香蕉后熟過程中UEV基因表達分析

試驗結(jié)果看出，香蕉后熟過程中，UEV基因家族成員表達趨勢差異較大。MaUEV2、MaUEV5、MaUEV7、MaUEV10、MaUEV12等5個基因在采后0～7 d表達差異不大且稍有下調(diào)，但是在采后17 d顯著上調(diào)。MaUEV3在采后0～4 d表達量稍有增加，在采后4～17 d稍有下降。MaUEV6和MaUEV9在后熟過程中逐漸下降，MaUEV6表達量變化不大，采后17 d的表達量下降至最低，僅為采后0 d的63%；而MaUEV9顯著下降，采后17 d的表達量下降至最低，是0 d的32%。MaUEV11在采后0～4 d表達量逐漸下降，采后4～17 d表達量逐漸增加。MaUEV13基因在后熟過程中逐漸增加，采后17 d表達量達到峰值，約為采后0 d表達量的3倍(見圖5和圖6)。

注：不同小寫字母表示差異顯著，p<0.05。圖6同。

圖6 香蕉后熟過程中4個MaUEV基因熒光定量表達比較

3 結(jié)論與討論

UEV基因參與激素信號、DNA損傷和非生物脅迫等多種生物學功能，在番茄、藻類、苔蘚、山楂等植物中都有報道[17]，玉米[18]和可可[19]中有UEV基因6個，擬南芥中有8個[20]。本研究在香蕉中共鑒定UEV基因13個，MaUEV基因編碼區(qū)域471～1 637 bp，編碼氨基酸數(shù)量127～495個，分子量14 212.34～56 209.83 Da，等電點均小于7；8個MaUEV基因編碼蛋白為穩(wěn)定蛋白，5個MaUEV基因編碼蛋白為不穩(wěn)定蛋白；13個MaUEV基因編碼蛋白均為親水性蛋白，其編碼蛋白均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、擴展鏈結(jié)構(gòu)、無規(guī)則卷曲組成；除MaUEV3定位在葉綠體、細胞質(zhì)和細胞核外，其他基因都定位在細胞核。前人對UEV基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，番茄UEV基因外顯子數(shù)量1～5個[12]，可可UEV基因外顯子數(shù)量1～9個[19]，本研究發(fā)現(xiàn)香蕉中MaUEV基因外顯子數(shù)量1～13個。

UEV是一類在結(jié)構(gòu)和功能上都非常保守的蛋白，盡管沒有半胱氨酸催化位點，其結(jié)構(gòu)和序列都與E2s相似，UEV蛋白也可能參與對蛋白泛素化的調(diào)控。在擬南芥中COP10屬于UEV蛋白，該蛋白在植物光形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用[21]。UEV蛋白在香蕉中的作用還未見報道。本研究在香蕉后熟過程中分析了UEV基因家族的表達情況，根據(jù)其表達模式可以分為5種類型。第一類基因在采后0～7 d表達差異不大且稍有下降，采后17 d顯著上調(diào)，包括MaUEV2、MaUEV5、MaUEV7、MaUEV10、MaUEV12等5個基因。第二類基因表達量先增加后下降，但變化幅度不大，MaUEV3屬于這種類型。第三類基因在整個后熟過程中呈下調(diào)表達，MaUEV6和MaUEV9屬于這種類型，但MaUEV6表達量變化不大，MaUEV9顯著下調(diào)。第四類基因表達量先下降后增加，但變化幅度不大，MaUEV11屬于這種類型。第五類基因表達量在整個后熟過程中逐漸增加，并在成熟時顯著上調(diào)，MaUEV13屬于這種類型。鑒于MaUEV9 和MaUEV13在香蕉后熟過程中表達差異顯著且表達趨勢相反，推測不同MaUEV基因在香蕉后熟過程中作用不同。