陳 圓，趙志祥，嚴婉榮，王海洪，吉訓聰

(海南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/海南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標準研究中心/海南省植物病蟲害防控重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部?？谧魑镉泻ι锟茖W觀測實驗站，?？冢?71100)

百香果又名雞蛋果、西番蓮，是一種熱帶水果，營養(yǎng)豐富，具有“飲料之王”的美稱[1]。近年來，隨著百香果種植面積不斷擴大，未經(jīng)檢疫或消毒的苗木大量進入市場，百香果病害發(fā)生越來越多，主要有莖基腐病和病毒病。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，莖基腐病的發(fā)病率為14%，致死率為5%[2]，是一種毀滅性病害。據(jù)研究報道，引起百香果莖基腐病的病原有多種，包括腐皮鐮孢菌Fusariumsolani(Mart) Sacc[2-4]、尖孢鐮刀菌F.oxysporumSchlecht[5]、疫霉菌PhytophthoranicotianaeBreda de Haan[6]、輪紋鐮刀菌F.concentricum[7]，毛色二孢屬(Lasiodiplodia)、黑孢屬(Nigrospora)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、新擬盤多毛孢屬(Neopestalotiopsis)、假擬盤多毛孢屬(Pseudopestalotiopsis)、擬莖點霉屬(Phomopsis)和漆斑菌屬(Myrothecium)等病菌[8]。宋曉兵等[3]結合病原菌形態(tài)學特征、致病性測定及rDNA ITS序列分析，鑒定廣東省西番蓮莖基腐病的病原菌為腐皮鐮孢菌F.solani。鄭加協(xié)等[5]研究認為西番蓮莖基腐病的病原為尖孢鐮刀菌F.oxysporum。詹儒林等[6]從海南省瓊海市西番蓮上分離出莖基腐病原物，鑒定為疫霉菌P.nicotianae。然而，引起海南西番蓮莖基腐病的病原是否有其他種真菌，或多個種真菌復合侵染，目前鮮見文獻報道。

百香果莖基腐病的藥劑防治研究發(fā)現(xiàn)，65%代森鋅和80%多菌靈田間防效較好，藥后90 d防治效果分別可達70.83%和62.5%[9]。室內(nèi)毒力測定發(fā)現(xiàn)，丙環(huán)唑[10]，45%咪鮮胺水乳劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和43%戊唑醇懸浮劑[11]，咯菌腈和異菌脲[12]，以及甲基托布津和撲海因?qū)︾牭毒z生長或孢子萌發(fā)都有一定的抑制效果[13]。為了尋找更多對百香果莖基腐病有效的防治藥劑，以便生產(chǎn)中輪換用藥，減少抗藥性的發(fā)生，本研究對海南省澄邁縣百香果莖基腐病病原菌進行鑒定，并測定6種藥劑對病原菌的室內(nèi)毒力，旨在為百香果莖基腐病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從海南省澄邁縣永發(fā)百香果基地收集病樣，參考方中達等[14]的方法分離病菌備用。藥劑包括250 g/L丙環(huán)唑乳油，陜西恒潤化學工業(yè)有限公司產(chǎn)；250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油，浙江禾本科技有限公司產(chǎn)；450 g/L咪鮮胺水乳劑，湖南萬家豐科技有限公司產(chǎn)；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，江蘇龍燈化學有限公司產(chǎn)；500 g/L嘧菌酯懸浮劑，江蘇瑞邦農(nóng)藥廠有限公司產(chǎn)；30%噁霉靈水劑，四川潤爾科技有限公司產(chǎn)。培養(yǎng)基包括PDA，馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.8～7.0；PCA，馬鈴薯20 g，胡蘿卜20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 采用組織分離法，將莖基部病健交界處剪成小塊，70%酒精浸泡10 s，1%升汞浸泡1 min后，置于PDA平板中培養(yǎng)純化，并命名baiLD，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谥虏×y定和鑒定試驗。

1.2.2 形態(tài)鑒定 用接種針挑取菌絲到1 000倍顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)。

1.2.3 致病性測定 純化后的病原菌鏡檢到分生孢子后，用無菌水沖洗分生孢子，制成1×107個/mL孢子懸浮液澆灌百香果苗，每株50 mL，以澆灌清水為對照，每重復3株，重復3次，接種后30 d觀察其發(fā)病癥狀是否與病樣癥狀一致。

1.2.4 分子鑒定 將純化病菌baiLD寄送北京六合華大基因科技有限公司進行ITS區(qū)測序分析和分子鑒定，測序得到544 bp的ITS序列，將其在NCBI中進行Blast比對，下載相似性較高的ITS序列，以膠孢炭疽菌F210235 (登錄號：KX197394)為外源參照序列，采用MEG X[7]軟件鄰近距離法構建系統(tǒng)進化樹，分析系統(tǒng)進化發(fā)育關系。

1.2.5 藥劑配制 藥劑配制參考陳圓等[16]的方法。經(jīng)預試驗測試，將供試藥劑濃度設計為：250 g/L丙環(huán)唑乳油25、31.25、62.5、125、250 mg/L，250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油25、31.25、62.5、125、250 mg/L，450 g/L咪鮮胺水乳劑9、45、90、450、500 mg/L，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑87.5、175、350、700、1 400 mg/L，500 g/L嘧菌酯懸浮劑62.5、125、250、500、1 000 mg/L，30%噁霉靈水劑37.5、75、150、300、600 mg/L。

1.2.6 藥劑毒力測定 菌絲生長速率法[15]：將煮沸的PDA分裝到三角錐瓶中，每瓶49 mL，高壓滅菌后，分別加入各濃度藥液1 mL，再分別倒入直徑9 cm培養(yǎng)皿中，每皿約16 mL，制成含藥培養(yǎng)基，每種藥劑5個濃度處理，每個處理重復3次，以加等量無菌水的PDA平板為對照。用直徑0.5 cm打孔器在病原菌菌落邊緣取適量菌餅，菌面朝下接入含藥和對照平板中央，放入28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算供試藥劑對病原菌菌絲的相對抑制率。相對抑制率(%)=(對照菌落平均增長直徑-藥劑處理菌落平均增長直徑)/對照菌落平均增長直徑×100。

孢子萌發(fā)法[16]：將1×107個/mL孢子懸浮液各取1 mL放入無菌培養(yǎng)皿中，倒入溫度50 ℃左右滅菌PDA制成分生孢子平板，然后用滅菌的直徑0.5 cm濾紙片從低濃度到高濃度蘸取供試藥劑藥液，以蘸取無菌水的濾紙片為對照，置于分生孢子平板中，每皿1片，每個處理重復3次，7 d后用十字交叉法測量各處理的抑菌圈直徑，計算相對抑制率。相對抑制率(%)=處理抑菌圈直徑/培養(yǎng)皿直徑×100。

2 結果與分析

2.1 病菌形態(tài)

分離獲得的病菌屬真菌界半知菌類，菌絲透明，具分隔，在側(cè)生的孢子梗上著生分生孢子。大型分生孢子鐮刀形，略彎，兩端稍尖，具隔膜2～5個，多為3個，大小(22.6～37.4) μm×(2.5～4.2) μm，足胞明顯(見圖1)。

圖1 分離獲得的百香果莖基腐病病菌PDA培養(yǎng)和分生孢子形態(tài)

2.2 病菌致病性測定

試驗發(fā)現(xiàn)，接種病菌的9株百香果苗有7株發(fā)病，發(fā)病率約為78%，其中2株未發(fā)病可能由于百香果苗品種差異引起；對照未發(fā)病。發(fā)病株枯萎，莖基部變褐壞死，與病樣癥狀一致，符合柯赫氏法則，重新組織分離純化后得到同樣病原菌，命名為baiLD。

2.3 分子鑒定

將病菌baiLD ITS序列在NCBI中BLAST比對，得到相似性較高的多條ITS序列。與腐皮鐮刀菌FusariumsolaniSY1(登錄號：MT605584)、FD1(登錄號：MN015032)、W5-3(登錄號：MK764995)、BLH-W1(登錄號：MG836251)、MR29(登錄號：MW509863)的ITS序列相似性為100%；與尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporumisolate FOM-12(登錄號：MN272279)和尖孢鐮刀菌辣椒?；虵usariumoxysporumf. sp.ciceris(登錄號：KU097320)ITS序列相似性為84.6%；與層生鐮刀菌Fusariumproliferatum菌株RS_79(登錄號：MK332493)和Fusariumproliferatum菌株CanR-8(登錄號：JF817300) 序列相似性為83.27%。從系統(tǒng)進化樹可以看出，菌株baiLD與鐮刀菌屬多條序列聚在1個大的分支上，結合形態(tài)學特征，確定菌株baiLD為腐皮鐮刀菌Fusariumsolani(見圖2)。

圖2 百香果莖基腐病病菌baiLD基于ITS基因系統(tǒng)進化樹

2.4 室內(nèi)毒力測定

試驗結果看出，250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油的EC50最小，為0.337 2 mg/L，其次是450 g/L咪鮮胺水乳劑，其EC50為0.474 9 mg/L，再次是70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，其EC50為0.7 172 mg/L；而450 g/L咪鮮胺水乳劑的EC90為1.210 2 mg/L，遠遠低于其他藥劑的EC90值。結合回歸曲線來看，斜率越大，病菌對該藥劑的敏感性差異越小[17]，因此，450 g/L咪鮮胺水乳劑對百香果腐皮鐮刀菌的毒力最強(見表1和圖3)。

表1 6種藥劑對百香果腐皮鐮刀菌Fusarium solani菌絲生長的毒力比較

咪鮮胺水乳劑9 mg/L對分生孢子的抑制效果最好，抑菌圈直徑最大，為6.23 cm，相對抑制率為74.78%；其4.5 mg/L的抑制效果次之，相對抑制率為61.44%；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑1 400 mg/L的抑菌圈直徑較大，為4.8 cm，相對抑制率為58.89%。250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油處理濃度中，250 mg/L的相對抑制率最大，為33.67%；而丙環(huán)唑乳油250 g/L處理的相對抑制率最高，30%噁霉靈水劑37.5～600 mg/L對病菌分生孢子無抑制作用。試驗發(fā)現(xiàn)450 g/L咪鮮胺水乳劑處理的病菌分生孢子抑菌圈界線清晰，藥劑持效期較長(見表2和圖3)。

圖3 3種藥劑對百香果腐皮鐮刀菌菌絲和分生孢子生長(右下)的抑制作用

表2 6種藥劑對百香果腐皮鐮刀菌Fusarium solani分生孢子的抑制作用比較

3 結論與討論

百香果種植周期短，收益快，海南省各(市)縣百香果種植面積逐年增加，百香果產(chǎn)業(yè)在海南省脫貧攻堅和鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮著重要作用。莖基腐病是海南省百香果生產(chǎn)的主要病害，成為制約海南省百香果產(chǎn)業(yè)進一步擴大的關鍵因素。本研究對海南省澄邁縣百香果莖基腐病樣病原菌進行了分離純化，結合田間癥狀、形態(tài)特征觀察、致病性測定、ITS序列和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為腐皮鐮刀菌Fusariumsolani。這與林泗海等[2]的研究報道一致，而與詹儒林等[6]報道的海南省瓊海市西番蓮莖基腐病病原菌不同，說明海南省百香果莖基腐病的病原菌不唯一，有可能是多種病原菌復合侵染所致。室內(nèi)毒力測定中，百香果腐皮鐮刀菌對450 g/L咪鮮胺水乳劑和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑較敏感，尤其是450 g/L咪鮮胺水乳劑，其對百香果腐皮鐮刀菌絲和分生孢子都有較強的抑制作用，可進一步用于大田試驗。供試藥劑EC50僅作為百香果鐮刀菌的室內(nèi)毒力參考，不能直接應用于田間，供試6種藥劑在田間防治效果有待進一步研究。