呂若亞，李 云，鄭永欽，鄧曉玲，鄭 正

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)柑桔黃龍病研究室，廣州，510642)

柑桔黃龍病是我國(guó)華南柑桔產(chǎn)區(qū)最嚴(yán)重的病害，可為害幾乎所有的商業(yè)栽培品種，且目前暫無(wú)有效的抗耐品種可供生產(chǎn)應(yīng)用[1]。廣東潮州、潮汕等地的果園均發(fā)現(xiàn)有黃龍病[2-4]。柑桔染病后，出現(xiàn)葉片斑駁黃化、“紅鼻子果”或青果等癥狀，植株壽命縮短，果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降[1，4]。雖然黃龍病是系統(tǒng)侵染性病害，但黃龍病菌在染病柑桔植株中分布不均勻，且因柑桔品種和患病程度不同而有所差異[5-10]。有研究表明，貢柑病株主葉脈中黃龍病菌(“CandidatusLiberibacter asiaticus”，CLas)的含量最高[11]。但亦有研究顯示，沙糖桔和貢柑等多種柑桔的果實(shí)中CLas呈富集狀態(tài)，且同一果實(shí)不同部位中CLas的含量存在顯著差異[9-10]。

年桔(Citrushaniana‘Nianju’)在我國(guó)栽培歷史悠久，是廣東地區(qū)的名特優(yōu)水果。廣東省惠州市龍門縣是我國(guó)年桔的重要產(chǎn)地和主產(chǎn)區(qū)之一[12]。近年來(lái)，柑桔黃龍病在龍門年桔產(chǎn)區(qū)流行發(fā)生，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[12-13]。本研究采用定量Real-time PCR技術(shù)對(duì)染病年桔枝條及果實(shí)中CLas的分布進(jìn)行系統(tǒng)分析，為探究CLas在年桔植株中的轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 染病材料采集2021年12月在廣東省惠州市新天地果場(chǎng)，選取10株感染黃龍病(表現(xiàn)葉片斑駁黃化或“紅鼻子果”)的年桔(8年生)，從每株樹(shù)采集一個(gè)帶果小枝組進(jìn)行檢測(cè)。分為當(dāng)年生葉、當(dāng)年生枝、果蒂、桔絡(luò)、果實(shí)中心柱、2年生及以上枝等6個(gè)部分(圖1)。

注：1：當(dāng)年生葉；2：當(dāng)年生枝；3：果蒂；4：果實(shí)中心柱；5：桔絡(luò)；6：2年生及以上枝。

從田間采集的每株病樹(shù)的病果中各選取一個(gè)果徑較大、癥狀較明顯的果實(shí)用于桔絡(luò)的采集。每個(gè)果實(shí)用滅菌鑷子挑取一條較長(zhǎng)的桔絡(luò)(≥4.5 cm)，從上(果蒂部)至下(果頂部)將每條桔絡(luò)切成長(zhǎng)度為1.5 cm的若干段，切至最后一段桔絡(luò)時(shí)，若其長(zhǎng)度<1 cm則與上一段合并，若1 cm<長(zhǎng)度<1.5 cm則自成一段。其中，從果蒂端起長(zhǎng)1.5 cm的片段記為前端片段，此后每1.5 cm長(zhǎng)的片段依次記為中端片段、中后端片段和后端片段。

1.2 DNA提取使用OMEGABIO-TE公司的植物DNA提取試劑盒HP Plant DNA Kit(2485-02)提取植物總DNA，用Qubit 4.0核酸定量?jī)x(Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行檢測(cè)，并在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 定量Real-time PCR檢測(cè)采用Bao等[14]方法進(jìn)行CLas定量Real-time PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系(20 μL)包括引物CLas-4G和HLBr(10 μmol/L)各0.4 μL，HLBp探針(0.5 μmol/L)0.2 μL，PerfectStart?II Probe qPCR SuperMix (TransGen Biotech Co.，Beijing)10 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min→[(95 ℃ 10 s→58 ℃ 30 s)，40個(gè)循環(huán)]。Ct值>32表示該樣品為黃龍病陰性，Ct值≤32表示該樣品為黃龍病陽(yáng)性。

使用含有引物CLas-4G/HLBr擴(kuò)增片段的pEASY-T1(TransGen Biotech Co.，Beijing)重組質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。初始的質(zhì)粒濃度使用Qubit 4.0核酸定量?jī)x(Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算拷貝數(shù)。質(zhì)粒拷貝數(shù)=(阿伏伽德羅常數(shù)×質(zhì)粒濃度)/(重組質(zhì)粒堿基對(duì)長(zhǎng)度×1×109×650)，阿伏伽德羅常數(shù)為6.022 × 1023，濃度單位為ng/μL。通過(guò)Real-time PCR得出的標(biāo)準(zhǔn)化方程(y= -3.706x+43.82，R2=0.995)，對(duì)每個(gè)樣品自動(dòng)進(jìn)行拷貝數(shù)的換算。同一枝條不同部位中的 CLas 濃度以每 ng DNA 含有的CLas拷貝數(shù)來(lái)表示。同一桔絡(luò)不同片段中CLas的含量總數(shù)=每μL DNA中CLas的拷貝數(shù)×總提取的DNA體積(本研究提取的桔絡(luò)組織DNA均定容為60 μL)。

1.4 數(shù)據(jù)分析用SPSS 18.0軟件中的單因素方差分析，比較CLas含量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CLas在不同部位的分布試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果看出，果實(shí)部位的組織(包括果蒂、中心柱和桔絡(luò))均能檢測(cè)到CLas，韌皮部有80%能檢測(cè)到CLas，當(dāng)年生葉僅40%能檢測(cè)到CLas；CLas在桔絡(luò)中的豐度顯著(p<0.05)高于其他部位，其他部位組織中的CLas豐度無(wú)顯著(p>0.05)差異(表1)。說(shuō)明，CLas在同一枝組上呈不均勻分布。

表1 感染黃龍病年桔帶果實(shí)枝組不同部位黃龍病菌的定量分析結(jié)果

2.2 CLas在桔絡(luò)中的分布通過(guò)對(duì)同一桔絡(luò)每1.5 cm片段中的CLas含量進(jìn)行定量比較分析，發(fā)現(xiàn)CLas在同一桔絡(luò)中分布不均勻。中端片段的CLas含量最高，顯著(p<0.05)高于前端片段和后端片段，前端片段和后端片段差異不顯著(見(jiàn)圖2)。

注：A：每段桔絡(luò)中的CLas數(shù)量，方框表示每1.5 cm桔絡(luò)片段。B：柱形圖表示桔絡(luò)片段中黃龍病菌數(shù)量的平均值，數(shù)柱上不同小寫(xiě)字母表示經(jīng)鄧肯氏新復(fù)極差法比較差異顯著(p<0.05)。

3 討論

年桔作為廣東省優(yōu)勢(shì)柑桔品種，近年來(lái)受黃龍病影響嚴(yán)重，但有關(guān)年桔黃龍病的癥狀描述與病原相關(guān)研究較少。筆者觀察發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生典型“紅鼻子果”癥狀的年桔枝條上葉片常易脫落，僅部分葉片表現(xiàn)為輕微斑駁、黃化，多數(shù)枝條上的葉片無(wú)明顯癥狀。同時(shí)，相比于健康果實(shí)，感染黃龍病的年桔果實(shí)除呈“紅鼻子果”癥狀外，還表現(xiàn)出畸形、小果及種子敗育。本研究通過(guò)定量分析發(fā)現(xiàn)，CLas在染病年桔枝條(組)中的分布不均勻，且以果實(shí)桔絡(luò)中的含量最高。這與染病貢柑、沙糖桔等多個(gè)品種枝條中的CLas分布規(guī)律相似[9-10，15]。早期研究發(fā)現(xiàn)，CLas可通過(guò)篩孔隨營(yíng)養(yǎng)流的方向從“源”器官(如成熟葉片等)移動(dòng)到“庫(kù)”器官(如果實(shí)等)[5，16]。本研究采集年桔枝條(組)的時(shí)間為果實(shí)轉(zhuǎn)色中期(12月)，果實(shí)積累了從葉片等源器官輸送的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和CLas。桔絡(luò)作為果實(shí)中輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的維管束組織[17]，亦可為CLas的增殖提供大量營(yíng)養(yǎng)，這進(jìn)一步解釋了桔絡(luò)含有較高CLas豐度的原因。本研究的結(jié)果還顯示，同一年桔果實(shí)的桔絡(luò)，以中端片段的CLas含量最高，前端片段和后端片段差異不顯著。前期研究發(fā)現(xiàn)，感染黃龍病的尤力克檸檬、溫州蜜柑和葡萄柚果實(shí)，其桔絡(luò)中端或后端的CLas含量要高于前端[15]。這可能與桔絡(luò)自身的結(jié)構(gòu)，以及病株中淀粉沉積和維管束堵塞，影響了CLas在桔絡(luò)中的移動(dòng)和分布有關(guān)。