王晴晴，諶 曦，萬 磊，范海霞，劉天陽，李 明，劉 磊，葛 瑤，范文杰，費陳晨，周 倩

（1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕科，安徽 合肥 230031）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatiod arthritis，RA）是一種以滑膜關節(jié)侵蝕為主要病理基礎的慢性疾病，其中巨噬細胞極化幾乎貫穿RA 發(fā)展及轉歸的全過程，通過抑制或消除促炎巨噬細胞的發(fā)育來重建巨噬細胞平衡將是治療RA 的有效方法［1］。TGF-β1/Smads 通路已被證明與RA 患者的滑膜增生相關，并被認為是RA 治療的一個重要靶點［2］。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種可與靶基因結合的非編碼的小RNA，在調控巨噬細胞發(fā)育、增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用［3］。RA 患者的血液及滑膜中的miR145-5p 表達異常，可對RA 患者產(chǎn)生不可逆的關節(jié)損害［4］?；罨幕ぞ奘杉毎陬愶L濕性關節(jié)炎中產(chǎn)生促進慢性炎癥的異常調節(jié)條件中發(fā)揮著重要作用［5］。相關研究證實miR145-5p可能通過靶基因的表達來調控TGF-β1/Smads 通路，對滑膜的炎癥程度造成影響［6，7］。本研究通過體外實驗培養(yǎng)滑膜巨噬細胞，分析其中miR145-5p 表達水平的差異對TGF-β1/Smads 通路巨噬細胞極化的影響，為RA 的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人AB 血清購自上海素爾生物科技有限公司；酶標儀型號RT-6000 購自雷杜公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；電熱恒溫箱型號DNP-9052BS-Ⅲ購自上海三發(fā)；人白細胞介素6（IL-6）型 號 JYM0140Hu＆、人 sCD163 型 號JYM2022Hu＆均購自武漢基因美科技有限公司；離心機型號JW3021HR 安徽嘉文公司；PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（反轉錄試劑盒）購自賽默飛世爾科技公司；引物合成序列購自Sangon Biotech 公司；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（熒光染料）試劑盒購自Roche 公司；熒光定量PCR 儀型號PIKOREAL 96 購自Thermo Scientific公司；低速迷你離心機型號TD5ATD5A 購自湖南赫西儀器裝備有限公司；Western 一抗二抗去除液購自Beyotime 公司；轉染相關miR145-5p 購自Ambion 公 司；Smad3 蛋 白 購 自abcam 公 司；Smad7 蛋 白購 自Bioworld 公 司；TGF-β1 購 自abcam 公 司；GAPDH 購自Zsbio 公司。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細胞與滑膜成纖維細胞培養(yǎng) 取健康成人AB 血清，用Ficoll 密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC），用洗液（含2% FBS 的PBS）洗滌，懸浮細胞并計數(shù)，取對數(shù)生長期的人單核細胞（THP-1）以接種于孔板中，加入佛波酯，培養(yǎng)48 h即巨噬細胞，在IFN-γRPMI1640 完全培養(yǎng)基2 mL中24 h 后即可誘導為M1 型巨噬細胞。通過transwell 共培養(yǎng)小室將RA 滑膜成纖維細胞與M1 型巨噬細胞共培養(yǎng)。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、分組 滑膜巨噬細胞在DMEM完全基中，進行滑膜巨噬細胞共培養(yǎng)，將共培養(yǎng)細胞分為4 組：RA 組（空白組）、TGF-β1 組（模型組）、TGF-β1+miR145-5p mimics（miR145-5p過表達組）、TGF-β1+miRNA-145-5p mimics-NC（miR145-5p 陰性對照組）。

1.2.3 細胞轉染 共培養(yǎng)細胞接種于6 孔板中，LPS 預刺激24 h 后PBS 清洗2 次?？瞻捉M不做任何處理，模型組、過表達組、陰性對照組培養(yǎng)基中加入TGF-β1 處理48 h 誘導（終質量濃度為10 ng/mL）。過表達組和陰性對照組在10 ng/mL 的TGF-β1 處理誘導48 h 后，采用Lipofect-mineTM2000 轉染試劑說明書進行轉染。將miR145-5p mimics 和miRNA-145-5p mimics-NC 轉染至共培養(yǎng)細胞，轉染后培養(yǎng)6 h，更換含10%AB 血清的低糖DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細胞。

1.2.4 ELISA 法檢測滑膜巨噬細胞表達 轉染培養(yǎng)24 h 后取細胞培養(yǎng)上清1000g離心20 min，取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）IL-6，CD163的濃度，用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度（OD 值）。

1.2.5 qRT-PCR 檢 測miR145-5p 與TGF-β1/Samd通路表達 取各組細胞加入Trizol 試劑，提取總RNA，A250/A270 的比值在19～201 用于反轉錄，參照參考文獻利用PCR 試劑盒進行擴增［8］。miR145-5p 以U6 為內參，使用Relative Quantification Study，計 算 方 法 為2-△△Ct。計 算miR145-5p、TGF-β1mRNA 和Smad3mRNA、Smad7mRNA 的相對表達水平。實驗用各引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.6 Westernblot 檢測Smad 蛋白表達 收取細胞樣本（約1×105個細胞）或組織樣本（約0.1 g 左右），加入RIPA 細胞裂解液600 μL（內含0.6 mmol/L PMSF）進行裂解。12 000 r/min 離心15 min。參照參考文獻方法［9］，分別進行SDS-PAGE 電泳、轉膜液、封閉、一抗二抗稀釋（一抗稀釋比例1∶1 000、二抗稀釋比例1∶20 000）、室溫孵育。加入洗滌液（PBST）洗膜后，顯色來檢測蛋白。

1.2.7 Transwell 細胞遷移實驗 Transwell 小室培養(yǎng)24 h 后（37 ℃），拭去微孔膜上未穿過小室膜的細胞；室溫條件下用4% 多聚甲醛溶液處理細胞20 min，后染色15 min，在光學顯微鏡隨意觀察3 個視野穿過Transwell 小室膜的細胞數(shù)。

1.2.8 CCK8 實驗檢測細胞生長情況 轉染48 h后，胰酶消化對數(shù)期細胞分別接種于96 孔板中，每孔100 μL 細胞懸液，并設置只加培養(yǎng)液不接種細胞的空白對照組和模型組，每組設3 個復孔。在孵育培 養(yǎng)48 h 后（37 ℃，5%CO2），每 孔 加 入10 μL CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定在460 nm 處的吸光度。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS26.0 數(shù)據(jù)分析軟件及GraphPadPrism 7 繪圖軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料用（±s）表示，相關性分析采用Spearman 分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。組內兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組間數(shù)據(jù)的比較采用ANOVA，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1 誘導對滑膜巨噬細胞細胞表達水平的影響及miR145-5p 過表達對滑膜巨噬細胞炎癥因子表達的影響

實驗結果顯示，與空白組相比，TGF-β1 組滑膜MI 型巨噬細胞IL-6 顯著升高（P＜0.01），M2 型巨噬 細 胞 分 子CD163 顯 著 降 低（P＜0.05），提 示TGF-β1 誘導刺激可加劇炎癥反應。與模型組和miR145-5p 過表達陰性對照組相比，miR145-5p mimics 組滑膜巨噬細胞抑炎分子CD163 水平均顯著升高（P＜0.01），致炎因子IL-6 顯著降低（P＜0.05），提示miR145-5p 過表達可抑制致炎因子表達，促使M1 型巨噬細胞向M2 型巨噬細胞極化。見表2。

表2 TGF-β1 對滑膜巨噬細胞細胞中IL-6和CD163 表達的影響（n=6，±s）Tab 2 Effects of TGF-β1 on the expression of IL-6 and CD163 in synovial macrophages (n=6，±s）

表2 TGF-β1 對滑膜巨噬細胞細胞中IL-6和CD163 表達的影響（n=6，±s）Tab 2 Effects of TGF-β1 on the expression of IL-6 and CD163 in synovial macrophages (n=6，±s）

注：與空白組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組、過表達陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 。

Groups RA 組TGF-β1 組IL-6（ng/mL）16.42±1.31 109.15±17.56▲▲CD163（pg/mL）8 387.08±1 223.47 1 342.53±231.01▲TGF-β1+miR145-5p mimics 組TGF-β1+miR145-5p mimics-NC 組54.71±5.23*4 205.62±402.77▲▲**106.31±16.38 8 081.49±1 766.91 56.201＜0.05 F P 78.496＜0.001

2.2 miR145-5p 過 表 達 與TGF-β1/Smads 通 路 基因表達關系

PCR 檢測結果顯示，與模型組和miR145-5p 過表達陰性對照組相比，miR145-5p-mimics 組 能明顯上調共培養(yǎng)細胞中miR145-5p 的表達水平，抑制共培養(yǎng)細胞中TGF-β1mRNA 的表達水平，Smad3 mRNA 顯 著 降 低，Smad7 mRNA 顯 著 升 高（P＜0.01），差 異 具 有 統(tǒng) 計 學 意 義，見 表3。 提 示miR145-5p 過表達可通過抑制TGF-β1、Smad3 的表達，促進Smad7 的表達進而調控TGF-β1/Smads通路。

表3 miR145-5p 過表達對TGF-β1 誘導的Smad 蛋白基因的的影響（n=6，±s）Tab 3 Effects of miR145-5P overexpression on TGF-β 1-induced Smad protein gene（n=6，±s）

表3 miR145-5p 過表達對TGF-β1 誘導的Smad 蛋白基因的的影響（n=6，±s）Tab 3 Effects of miR145-5P overexpression on TGF-β 1-induced Smad protein gene（n=6，±s）

注：與模型組、miR145-5p 過表達陰性對照組相比，▲▲P＜0.01，**P＜0.01 。

Groups RA 組TGF-β1 組TGF-β1+miR145-5p mimics 組TGF-β1+miR145-5p mimics-NC 組miR145-5p 1.02±0.60 0.61±0.80 4.20±0.61▲▲**1.09±0.97 51.920＜0.001 FP Smad3 1.03±0.49 2.43±1.45 1.79±0.39▲▲**2.32±0.14 50.505＜0.001 Smad7 1.00±0.23 0.49±0.46 0.75±0.51▲▲**0.53±0.72 127.288＜0.001 TGF-β1 0.99±1.06 3.07±0.26 2.20±0.74▲▲**3.00±0.21 34.371＜0.001

2.3 miR145-5p 過表達對滑膜巨噬細胞相關蛋白的影響

Western blot 實驗結果顯示，4 組的標志蛋白條帶表達水平比較差異顯著，見圖1。miR145-5p 過表達組Smad7 蛋白顯著高于模型組和miR145-5p 過表達陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表4。提示miR145-5p mimics 在滑膜巨噬細胞中可抑制TGF-β1、Smad3 蛋白的表達，增加Smad7 蛋白的表達。

表4 滑膜巨噬細胞中TGF-β1/Smads 通路蛋白表達情況（n=6，±s）Tab 4 Expression of TGF-β1/Smads pathway proteins in synovial macrophages（n=6，±s）

表4 滑膜巨噬細胞中TGF-β1/Smads 通路蛋白表達情況（n=6，±s）Tab 4 Expression of TGF-β1/Smads pathway proteins in synovial macrophages（n=6，±s）

注：與模型組、miR145-5p 過表達陰性對照組相比，▲▲P＜0.01，**P＜0.01 。

TGF-β1 0.32±0.02 0.67±0.10 0.32±0.95▲▲**0.55±0.11 29.75＜0.001 Groups RA 組TGF-β1 組TGF-β1+miR145-5p mimics 組TGF-β1+miR145-5p mimics-NC 組FP Smad3 0.17±0.09 0.63±0.39 0.20±0.50▲▲**0.58±0.45 154.77＜0.001 Smad7 0.86±0.11 0.18±0.98 0.60±0.52▲▲**0.48±0.29 40.31＜0.001

圖1 各組滑膜巨噬細胞TGF-β1/Smads 信號通路相關蛋白表達情況Fig 1 Expression of TGF-β1/Smads signaling pathway related proteins in synovial macrophages of each group

2.4 miR145-5p 過表達對RA 滑膜巨噬細胞遷移的影響

CCK-8 檢測細胞的遷移能力，transweill 小室顯微鏡下觀察，遷移實驗可見miR145-5p 過表達組的穿膜細胞明顯少于RA 組、模型組和過表達陰性對照組（P＜0.01），見圖2、3。transwell 小室結果表明miR145-5p 過表達明顯減少巨噬細胞侵襲，改善炎癥反應。

圖2 顯微鏡視野下穿膜細胞圖片（×100）Fig 2 Picture of transmembrane cells under microscope（×100）

2.5 miR145-5p 及M1、M2 型 巨 噬 細 胞 標 志 物 與Smads 蛋白表達的相關性分析

Spearman 相關性分析得出，miR145-5p 與Smad3 呈負相關（P＜0.01）、與Smad7 呈正相關（P＜0.01）；M1 型巨噬細胞IL-6 與Smad3 呈正相關（P＜0.01）、與Smad7 呈正相關（P＜0.05），M2 型巨噬細胞分子CD163 與Smad3、Smad7 的相關性同IL-6相反。相關性分析結果表明miR145-5p 可通過抑制Smad3 表達調節(jié)巨噬細胞極化，見表5。

表5 miR145-5p 及巨噬細胞標志物及與Smads 蛋白表達的相關性分析Tab 5 Correlation analysis of miR145-5P and macrophage markers and Smads protein expression

圖3 顯微鏡視野下穿膜細胞數(shù)目Fig 3 Number of transmembrane cells in microscopic field

3 討論

RA 是臨床常見的、進行性發(fā)展的免疫性疾病。越來越多的證據(jù)表明，巨噬細胞極化在RA 疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮舉足輕重的作用［10］。巨噬細胞分為兩個亞群，M1 型巨噬細胞極化后分泌大量促炎性細胞因子、趨化因子等激活成纖維細胞和破骨細胞，引發(fā)一系列炎癥反應，造成關節(jié)軟骨破壞，M2型巨噬細胞表面表達拮抗致炎分子促進組織修復和減輕炎癥反應［11，12］。相關研究發(fā)現(xiàn)［13，14］，在RA 患者和小鼠模型血液和滑膜組織中，巨噬細胞與M1和M2 標記物不平衡存在于細胞的表面，滑膜中M1/M2 比值增加，促進了破骨細胞的形成，并增強免疫應答。因此干預巨噬細胞M1 型向M2 型轉變，使M1/M2 恢復動態(tài)平衡狀態(tài)，有利于促進RA 滑膜炎癥的修復。

轉化生長因子-β（TGF-β）為多效能生長因子，可刺激細胞外基質的分泌與沉積，在誘導細胞凋亡、骨的形成、調節(jié)血細胞生成及免疫應答等風濕免疫疾病方面起著重要的調節(jié)作用。Sun 等［15］發(fā)現(xiàn)TGF-β1 在RA 患者滑膜巨噬細胞的高表達具有特異性，TGF-β1 在滑膜巨噬細胞的高表達可促進RA患者中M1 型致炎因子表達，從而促進其發(fā)生炎癥反，導致RA 患者病情的復發(fā)和發(fā)展。Zhu 等［16］研究證實TGF-β1 在RA 患者的成纖維細胞樣滑膜細胞（FLSs）和滑膜液中表達較高，TGF -β1 增強RA 的遷移和侵襲。本次實驗，采用TGF-β1 誘導刺激滑膜巨噬細胞，以未經(jīng)TGF-β1 誘導刺激的滑膜巨噬細胞作為對照，ELISA 法檢測結果顯示，模型組M1型巨噬細胞IL-6 分泌水平升高，M2 型巨噬細胞分子CD163 分泌水平降低，說明TGF-β1 刺激可加劇了滑膜巨噬細胞炎癥反應，這也與之前的相關研究結果相符。

TGF-β1 通過募集炎性因子、細胞增殖等形式作用于巨噬細胞及免疫細胞等，使下游Smads 蛋白家族活化，TGF-β1/Smads 通路已被證明是改善RA滑膜增生的一個重要靶點［17］。SMAD 蛋白是TGFβ 細胞內信號傳導重要下游通路，經(jīng)TGF-β 受體-Ⅰ磷酸化（TβRI）后，與受體調節(jié)型蛋白SMAD3 形成異構體復合物，磷酸化并激活下游的Smad3 誘導向間充質上質轉化，促進RA 病理。Smad3 基因多態(tài)性可能導致TGF/Smad 信號通路的干擾，而該信號通路通過多重機制影響T 細胞的反應和基因表達［18］，這可能導致抑制反式生長因子（TGF）-β 介誘導Treg 細胞，以及誘導Th1 和Th17 的發(fā)育。Smad7 是抑制型蛋白而，Smad7 能引起TβRI 降解，從而阻斷Smad3 磷酸化，抑制TGF-β1 傳導，阻止炎癥對關節(jié)持續(xù)造成損傷，延緩RA 疾病進展。Smad7 缺失可能刺激Th 細胞分化和自身抗體的產(chǎn)生，從而促進自身免疫性關節(jié)炎進展，增強NF-κB激活、Th1/Th17 分化和滑膜炎癥［19］。因此，降低Smad3 蛋白表達、增加Smad7 蛋白表達可能是延緩RA 關節(jié)滑膜炎癥的關鍵步驟。

miRNA 可通過與靶基因的互補配對，在轉錄后調節(jié)基因表達進而調控調控下游Smad 蛋白的表達，在RA 發(fā)展機制中發(fā)揮重要作用。miR145-5p 作為miRNA 家族成員之一，近年來研究miR145-5p 表達對RA 的影響愈加深入。明建松等［20］成功建立膠原誘導的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)miR145-5p 抑制了CIA 小鼠 的 關 節(jié) 炎 癥。 Qiu 等［21］通 過 慢 病 毒 介 導 的miR145 過表達分離和敲除重組病毒，發(fā)現(xiàn)miR145增強了TGF-β/Smad 通路，導致星狀細胞的激活。本研究PCR 結果顯示miR145-5p 過表達組相比其他三組而言，miR145-5p mRNA 表達明顯升高，Smad3mRNA 表 達 明 顯 降 低，Smad7mRNA 表 達 明顯升高。ELISA 結果顯示miR145-5p 過表達組抑制M2 型巨噬細胞向M1 型巨噬細胞極化，降低降低M1 型致炎因子表達，增加M2 型抑炎因子表達；transwell 小室結果顯示miR145-5p 過表達明顯減少巨噬細胞侵襲。以上證據(jù)都表明miR145-5p 過表達能調節(jié)巨噬細胞極化平衡。

Paradowska 等［22］基 于ROC 分 析，認 為Smad3可能是類風濕性關節(jié)炎臨床實驗和診斷的重要生物標志物。Yu 等［23］利用雙熒光素酶報告基因分析，Smad3、TGF-β1 炎癥通路的關鍵元素是miR145 的靶 點。Yu 等［24］利 用 在 線 預 測 法 證 實Smad3 是miR145 與3‘-UTR 結 合 的 直 接 靶 基 因，過 表 達miR145 顯著抑制了Smad3mRNA 和蛋白的表達，部分地抑制破骨細胞分化。此次實驗通過WB 對RA 患 者TGF-β1/Smads 通 路 相 關 蛋 白 表 達 水 平 進行分析，結果發(fā)現(xiàn)miR145-5p 過表達組Smad3 降低，Smad7 升 高，M1 型 致 炎 因 子 表 達 下 降，M2 型 抑 炎因子表達升高。同時相關性分析顯示miR145-5p 與Smad3 呈負相關，M1、M2 型巨噬細胞極化標志物與Smad3、Smad7 相關性也和PCR、WB 結果相佐證。

綜上所述，本研究得到以下結論：miR145-5p 過表達可能通過負反饋調控Smad3 蛋白，抑制TGF-β 1/Smads 通路炎癥因子的表達，抑制M2 型巨噬細胞向M1 型轉變，從而維持巨噬細胞極化動態(tài)平衡，可能是RA 的臨床實驗和治療新的靶點。

作者貢獻度說明：

王晴晴：進行細胞試驗、記錄分析數(shù)據(jù)、撰寫論文；諶曦：設計試驗，并對論文提出指導意見；萬磊、范海霞、劉天陽、李明、劉磊、葛瑤：參與實驗內容及收集數(shù)據(jù)；范文杰、費陳晨、周倩：標本采集。

所有作者聲明無利益沖突。