趙 鋆，施凱佳，伍彩霞，鄒 園，吳林栩，陳 旭，申志華，郭峻莉，揭 偉

（1. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院海南省熱帶心血管病研究重點實驗室，海南 ?？?571199；2. 廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東 湛江 524023；3.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南 海口 571199）

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是指不能用高血壓性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及其他已知病因的心臟病變來解釋的糖尿病并發(fā)的心肌疾?。?，2］，其發(fā)病機制復(fù)雜迄今尚未闡明。因此，尋找合適的生物標志物為DCM 的預(yù)防及治療具有極其重要的意義。近年來發(fā)展的轉(zhuǎn)錄組學(xué)［3］、蛋白組學(xué)［4］、代謝組學(xué)［5］、修飾組學(xué)［6］等研究都為此提供潛在的方案。

RhoE，也稱Rnd3，為Rho 家庭GTPase 蛋白質(zhì)超家族成員之一。RhoE 功能多樣，與細胞增殖、周期、凋亡、遷移及分化等生物學(xué)功能有關(guān)［7］。文獻報道，RhoE 表達異常與較多的心血管疾病有關(guān)［8-10］。前期基于CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了RhoE 基因穩(wěn)定敲除的H9C2 心肌細胞系，通過芯片篩查差異表達基因并富集RhoE 有關(guān)的信號途徑，發(fā)現(xiàn)RhoE 參與調(diào)控膽固醇生物合成途徑、oncostatin-M 信號、干擾素信號及TGF-β1 信號等，凸顯了RhoE 在心臟疾病中的重要角色［11］。迄今，有關(guān)RhoE 與DCM 相關(guān)研究未見報道。

4D 蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種高通量差異表達蛋白質(zhì)篩選方法，近年來受到較多的關(guān)注［12，13］。本研究擬采用4D 非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，檢測RhoE表達改變在糖尿病大鼠心臟組織中蛋白質(zhì)表達譜，表征其心臟組織中調(diào)控的差異表達蛋白質(zhì)，結(jié)合生物信息學(xué)手段來挖掘在差異表達蛋白質(zhì)涉及的功能、分布及參與的相關(guān)信號通路，為解析RhoE 在DCM 中的角色提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑：鏈脲佐菌素（YEASEN，中國），二硫蘇糖醇、三氟乙酸、三氯甲烷、尿素、四甲基乙二胺、Seppro?Rat Spin Columns（Sigma-Aldrich，美 國），乙腈、甲醇、TMT 標記試劑、蛋白標志物（Thermo-Fisher Scientific，美國），PAGE 銀染試劑盒、DNA提取酚試劑（北京Solarbio），Pierce Top 12 Abundant Protein Depletion Spin Columns、硝酸纖維過濾膜、聚偏氟乙烯（Bio-Rad Laboratories，美國）。

主要儀器：NanoElute、高分辨質(zhì)譜儀Bruker timsTOF Pro、超聲儀（ThermoFisher Scientific，美國），電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽（Bio-Rad，美國）。

1.2 實驗動物及分組

成年RhoE 基因全身敲除的雜合子Sprague Dawley（SD）大鼠（RhoE+/-，雄性，體重200～250 g），野生型SD 大鼠（雄性，6 周齡，體重200～250 g）由江蘇賽業(yè)生物科技有限公司提供，飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心病進行繁育和基因型鑒定［14］。采用高脂飼料配合一次性鏈脲佐菌素（70 mg/kg）聯(lián)合構(gòu)建糖尿病大鼠模型，給予鏈脲佐菌素注射2周后，連續(xù)3 次空腹血糖值≥16.7 mmol/L，取各組心臟組織用于蛋白組學(xué)研究。分組如下：正常對照大鼠（WT_NG），即WT 大鼠予以腹腔注射等量檸檬酸鈉鹽水；糖尿病大鼠（WT_HG），即WT 大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)成1 型糖尿病；RhoE 敲除對照大鼠（KO_NG），即RhoE+/-腹腔注射等量檸檬酸鈉 鹽 水；RhoE 敲 除 糖 尿 病 大 鼠（KO_HG），即RhoE+/-腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)成1 型糖尿病。動物均飼養(yǎng)于SPF 級環(huán)境，糖尿病組予以高脂飲食和常規(guī)飲水，對照組予以常規(guī)飲食和飲水。所有實驗操作均符合廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理要求（倫理 編 號：GDY2016003）。 每 組 大 鼠 均 為3 只（n=3）。

1.3 蛋白提取與酶解

參考文獻所述方法進行［15，16］。研缽用液氮預(yù)冷后置入適量心肌組織樣品，加入液氮后將組織塊完全研磨成粉末狀。每組樣品加入4 倍粉末體積的裂解緩沖液（含1%蛋白酶抑制劑，50 mmol/L 煙酰胺3 μmol/L 去乙酰化酶抑制劑，8 mol/L 尿素），行超聲裂解。離心（4 ℃，12 000g，10 min）后將上清液轉(zhuǎn)移到另一無菌離心管，使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取等量各樣品蛋白，用裂解液調(diào)整各組體積至一致。輕柔地加入20%三氯乙酸，渦旋后充分混勻，4 ℃沉淀2 h 后離心，用冷丙酮洗滌沉淀3 次。將沉淀置于超凈臺晾干，加入200 mmol/L 的四乙基溴化銨后用超聲打散，按蛋白酶∶蛋白=1∶50 的比例加入胰酶，過夜酶解。加入二硫蘇糖醇調(diào)節(jié)終濃度為5 mmol/L，56 ℃反應(yīng)30 min，最后加入碘乙酰胺，調(diào)節(jié)終濃度至11 mmol/L，各樣品避光孵育15 min 后備用。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析和數(shù)據(jù)分析

利用杭州景杰公司的技術(shù)平臺完成有關(guān)色譜-質(zhì)譜分析，實驗步驟參考相關(guān)報道［15-17］。將含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液混合，配制成流動相A；含0.1%甲酸和100%乙腈溶液混合，配制成流動相B。用液相色譜流動相A 相溶解各樣本的肽段，Nano Elute 超高效液相系統(tǒng)分離。設(shè)置液相梯度為0～70 min，6%～24% B；70～84 min，24%～32%B；84～87 min，32%～80% B；87～90 min，80% B，維持流速為450 nL/min。超高效液相系統(tǒng)分離肽段后加入Capillary 離子源中電離，隨后timsTOF Pro 質(zhì)譜分析電離后的肽段，設(shè)置離子源電壓為1.7 kV，使用timsTOF Pro 質(zhì)譜檢測和分析肽段母離子及其二級碎片。設(shè)置二級質(zhì)譜掃描區(qū)間為100～1 700。設(shè)置數(shù)據(jù)采集模式為平行累積串行碎裂（PASEF）模式。使用Maxquant（v1.6.15.0）對二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行檢索，搜索到Rattus_norvegicus_10116_PR_20201214.fasta 共2 9940 條序列。添加反庫后計算隨機匹配造成的假陽性率（FDR），調(diào)整蛋白質(zhì)和多肽的錯誤發(fā)現(xiàn)率為1%。在搜庫完成后，需要進行一系列質(zhì)控，保證結(jié)果質(zhì)量符合標準。將差異表達量變化（FC）＞1.5 同時P＜0.05 設(shè)置為表達顯著上調(diào)，F(xiàn)C＜1.5 且P＜0.05 設(shè)置為表達顯著下調(diào)。

1.5 生物信息學(xué)分析

對各比較組中差異表達蛋白質(zhì)分別進行GO 分類和KEGG 通路富集分析，通過Fisher 精確檢驗，評價差異表達蛋白質(zhì)富集的功能分類和通路的顯著水平。應(yīng)用分層聚類方法繪制聚類熱圖。將不同比較組中差異表達蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號或蛋白序列比對STRING（v.11.0）蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫，按照confidence score ＞0.7 提取得到差異蛋白互作關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)鑒定與解析

各組大鼠心臟酶解后的蛋白經(jīng)BCA 定量分析后符合質(zhì)譜分析要求。通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析及數(shù)據(jù)庫檢索，共得到二級質(zhì)譜譜圖總數(shù)2 067 933個，與理論二級譜圖匹配的譜圖數(shù)308 807 個，肽段總數(shù)29 739 個，唯一肽段總數(shù)26 946 個，鑒定蛋白質(zhì)總數(shù)3 597 個，定量蛋白數(shù)2 931 個。總體鑒定到肽段長度主要分布7～20 個氨基酸，大部分蛋白對應(yīng)兩個以上肽段，大部分蛋白的覆蓋度在20%以下，蛋白分子量主要分布10 ～120 kD。所有樣本兩兩之間計算Person 相關(guān)系數(shù)而繪制的熱圖。相應(yīng)肽段、蛋白質(zhì)分布情況及樣本之間的相關(guān)性見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)鑒定與解析Fig 1 Protein identification and analysis

2.2 RhoE 敲除前后心臟組織差異蛋白篩選

以FC＞1.5、P＜0.05 作為顯著上調(diào)的變化閾值，F(xiàn)C＜1.5、P＜0.05 為明顯下調(diào)的變化標準，發(fā)現(xiàn)與WT_NG 組相比，WT_HG 組上調(diào)差異表達蛋白198 個，下調(diào)331 個（圖2A）；KO_NG 組上調(diào)差異表達蛋白26 個，下調(diào)45 個（圖2B）。與KO_NG 相比，KO_HG 上調(diào)蛋白173 個，下調(diào)255 個（圖2C）。與WT_HG 相比，KO_HG 顯著上調(diào)差異表達蛋白質(zhì)19 個，明顯下調(diào)差異表達蛋白質(zhì)28 個（圖2D）。相應(yīng)表達最明顯的前10 個蛋白質(zhì)見表1。

表1 排名前10 的差異表達蛋白質(zhì)列表Tab 1 Top ten differentially expressed proteins

圖2 RhoE 敲除前后心臟組織的差異表達蛋白火山圖Fig 2 Volcano plot of differentially expressed proteins in cardiac tissue before and after RhoE knockout

2.3 RhoE 敲除前后心臟組織差異蛋白亞細胞定位注釋

WT_NG 組相比，KO_NG 組心臟組織中上調(diào)蛋白主要位于線粒體、細胞外基質(zhì)、細胞核，下調(diào)蛋白主要分布于細胞質(zhì)、細胞外基質(zhì)、細胞核；WT_HG 組心臟組織中上調(diào)蛋白主要位于細胞質(zhì)、線粒體、細胞外基質(zhì)，下調(diào)蛋白主要分布于細胞質(zhì)、細胞核、細胞外基質(zhì)。與WT_HG 組相比，KO_HG組的心臟組織中上調(diào)蛋白主要位于細胞外基質(zhì)、細胞質(zhì)、線粒體，下調(diào)蛋白主要分布于細胞質(zhì)、細胞核、細胞外基質(zhì)。與KO_NG 組相比，KO_HG 組心臟組織中上調(diào)蛋白主要位于細胞質(zhì)、細胞外基質(zhì)、線粒體，下調(diào)蛋白主要分布于細胞質(zhì)、線粒體、細胞核。各組間比較差異蛋白亞細胞定位注釋分類圖見圖3。

圖3 RhoE 敲除前后心臟組織差異蛋白亞細胞定位注釋Fig 3 Annotation of subcellular localization of differential proteins in cardiac tissues before and after RhoE knockout

2.4 差異表達蛋白GO 注釋

將篩選的差異蛋白從細胞組成，分子功能和生物過程3 個層面進行GO 注釋，結(jié)果顯示，與WT_NG 相比，WT_HG 組的心臟組織中上調(diào)蛋白主要分布于過氧化物酶體（peroxisome），下調(diào)蛋白主要分布于核糖體亞單位（ribosomal subunit）；上調(diào)蛋白的分子功能主要集中于共因子結(jié)合（cofactor binding），下調(diào)蛋白的分子功能主要集中于核糖體的結(jié)構(gòu)成分（structural constituent of ribosome）；上調(diào)蛋白主要參與細胞脂質(zhì)代謝生物過程（peroxisome organization），下調(diào)蛋白主要參與肽段生物合成 過 程（peptide biosynthetic process）（圖4A、B）。與WT_NG 相比，KO_NG 組的心臟組織中上調(diào)蛋白主要分布于免疫球蛋白復(fù)合體（immunoglobulin complex），下調(diào)蛋白主要分布于細胞外區(qū)域（extracellular region）；上調(diào)蛋白的分子功能主要集中于免疫球蛋白受體結(jié)合（immunoglobulin receptor binding），下調(diào)蛋白的分子功能主要集中于細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（extracellular matrix structure constituent）；上調(diào)蛋白主要參與免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng)生物過程（immunoglobulin mediated immune response），下調(diào)蛋白主要參與氨基聚糖生物合成過程（aminoglycan biosynthetic process）（圖4C、D）。與KO_NG 相比，KO_HG 組的心臟組織中上調(diào)蛋白主要分布于過氧化物酶基質(zhì)（peroxisomal matrix），下調(diào)蛋白主要分布于核糖體亞單位（ribosomal subunit）；上調(diào)蛋白的分子功能主要集中于共因子結(jié)合（cofactor binding），下調(diào)蛋白的分子功能主要集中于核糖體結(jié)構(gòu)成分（structural constituent of ribsome）；上調(diào)蛋白主要參與過氧化物酶組成生物過程（peroxisome organization），下調(diào)蛋白主要參與肽段生物合成過程（peptide biosynthetic process）（圖4E、F）。與WT_HG 相比，KO_HG 組的心臟組織中上調(diào)蛋白主要分布于細胞外空間（extracellular region），下調(diào)蛋白主要分布于胞質(zhì)大核糖體亞基（cytosolic large ribosomal subunit）；上調(diào)蛋白的分子功能主要集中于血小板衍生生長因子結(jié)合（plateletderived growth factor binding），下調(diào)蛋白的分子功能主要集中于核糖體的結(jié)構(gòu)組成部分（structural constituent of ribosome）；上調(diào)蛋白主要參與血壓調(diào)節(jié)生物過程（regulation of blood pressure），下調(diào)蛋白主要參與中性脂質(zhì)分解生物過程（neutral lipid catabolic process）（圖4G、H）。

圖4 差異表達蛋白GO 注釋Fig 4 GO annotation of differentially expressed proteins

2.5 差異表達蛋白KEGG 通路富集分析

將差異表達蛋白與KEGG 數(shù)據(jù)庫比對后進行差異信號分析發(fā)現(xiàn)，與WT_NG 組相比，WT_HG 組的心臟組織中上調(diào)的信號通路主要為過氧化物酶體（rno04146 peroxisome）、細胞色素P450 對外源生物代謝的影響（rno00980 metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）、花生四烯酸代謝（rno00590 arachidonic acid metabolism）等（圖5A）；下調(diào)的信號通路主要有核糖體（rno03010 ribosome）、冠狀病毒病- COVID-19（rno05171 coronavirus disease COVID-19）、蛋白質(zhì)消化吸收（rno04974 protein digestion and absorption）等（圖5B）。與WT_NG 組相比，KO_NG 組的心臟組織中上調(diào)的信號通路為rno04621 nod 樣受體信號通路（rno04621 NOD-like receptor signaling pathway）（圖5C）；下調(diào)的信號通路主要為蛋白質(zhì)消化吸收（rno04974 protein digestion and absorption）、血管平滑肌收縮（rono04270 vascular smooth muscle contraction）、松弛素信號通路（rno04926 relaxin signal pathway）（圖5D）等。與KO_NG 相比，KO_HG 組的心臟組織中上調(diào)的信號通路主要為萜類主鏈生物合成（rno00900 terpenoid backbone biosynthesis）、花生四烯酸代謝（rno00590 arachidonic acid metabolism）、過氧物酶體（peroxisome）等（圖5E），下調(diào)的信號通路主要為核糖體（ribosome）、金黃色葡萄球菌感染（staphylococcus aureus infection）、冠狀病毒病- COVID-19（rno05171 coronavirus disease COVID-19）（ 圖 5F）。 與WT_HG 組相比，KO_HG 組的心臟組織中差異表達蛋白參與的上調(diào)信號通路主要為蛋白質(zhì)消化吸收（rno04974 protein digestion and absorption），細胞外基質(zhì)受體相互作用（rno04512 ECM receptor interaction），糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號（rno04933 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complication），下調(diào)信號通路主要為維生素消化吸收（rno04977 Vitamin digestion and absorption），脂肪消化吸收（fat digestion and absorption），膽固醇代謝（cholesterol metabolism）（圖5G）。

2.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將KO_HG vs WT_HG 中顯著差異表達的蛋白數(shù)據(jù)庫編號或蛋白序列與STRING 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫（V.11.0）對比分析，發(fā)現(xiàn)KO_HG 組與WT_HG 組相比的心臟組織上調(diào)蛋白中Col 1α1、Col 1α2 相互作用的蛋白較多，下調(diào)蛋白中參與核糖體 通 路 的 相 關(guān) 蛋 白（Rps8、Rpl7、Rpl18、Rpl23、Rpl31）在網(wǎng)絡(luò)中的相互作用蛋白較多（圖6）。

圖6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig 6 Analysis of protein interaction network

3 討論

DCM 發(fā)病機制復(fù)雜。為了解RhoE 在DCM 中的作用，本研究利用RhoE 基因編輯模式動物復(fù)制了糖尿病模型，并利用當(dāng)前最新的4D 蛋白組學(xué)進行研究，以期為從全局角度剖析RhoE 與DCM 的關(guān)系。

以往利用RhoE 基因編輯細胞和動物模型揭示了許多RhoE 的在心血管系統(tǒng)疾病的新功能［8-11］，本研究首先委托蘇州賽業(yè)公司基于CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)構(gòu)建RhoE 基因敲除雜合子SD 大鼠，進一步繁育和鑒定獲得了實驗所需的實驗動物，再應(yīng)用經(jīng)典的腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)成急性1 型糖尿病，該模型的成功復(fù)制為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。隨后分離各組大鼠心臟，采用傳統(tǒng)的酶解法獲得了滿足蛋白組學(xué)所需的蛋白裂解物。通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分離到總的二級質(zhì)譜譜圖總數(shù)2 067 933 個，肽段總數(shù)29 739 個，定蛋白質(zhì)總數(shù)3 597個，可定量蛋白數(shù)2 931 個。通過嚴格的質(zhì)控，本組中肽段長度、蛋白覆蓋度、蛋白分子量均符合質(zhì)控要求。相關(guān)性分析表明組內(nèi)樣本Person 相關(guān)系數(shù)大于0.99，組間樣本Person 相關(guān)系數(shù)為0.95～0.97，提示本研究所用動物組內(nèi)差異很小重復(fù)性好，但組間存在顯著性區(qū)別，提示送檢樣本符合實驗要求。

在鑒定的3 597 個蛋白中，發(fā)現(xiàn)與WT_NG 組相比，WT_HG 組上調(diào)差異表達蛋白198 個，下調(diào)331 個，代表性的蛋白質(zhì)有Cat、Ftl1、Ighm、Acot2、Pdk4、Myh6、Tuba8、Coq5、Itih2、Serpinh1 等；KO_NG 組上調(diào)差異表達蛋白26 個，下調(diào)45 個，代表性蛋白質(zhì)包括Nit2、Gstz1、Ighm、Igg-2a、S100a8、Myl4、Tagln、Myh11、Mybphl、Myl7 等；與KO_NG相比，KO-HG 上調(diào)蛋白173 個，下調(diào)255 個，代表性蛋 白 質(zhì) 包 括Cat、Maoa、Ftl1、Pdk4、Myl4、A1i3、Fgg、Myh6、A1m、Rps9 等；與WT_HG 相 比，KO_HG 明顯上調(diào)差異表達蛋白質(zhì)19 個，明顯下調(diào)差異表達蛋白質(zhì)28 個，代表性蛋白質(zhì)包括Postn、Cacna2d2、 Ndufaf1、 Col1a1、 Col1a2、 Ighm、Lgals3bp、Plin2、Abhd16a 和Apoa4 等。亞細胞結(jié)構(gòu)定位分析顯示，非糖尿病狀態(tài)下，RhoE 基因敲除前后蛋白分布改變最明顯的是細胞骨架（cytoskeleton）、過氧化物酶體（peroxisome）和細胞核（nucleus）；早期的研究提示RhoE 有調(diào)節(jié)細胞骨架的功能［7］，本研究結(jié)果也提示RhoE 敲除后顯著改變了細胞骨架蛋白的表達。此外，RhoE 敲除前后過氧化物酶體的改變也提示，其與RhoE 與氧化應(yīng)激有關(guān)，這與早期的一篇報道是一致的［18］。核蛋白分布的改變提示RhoE 參與了基因表達調(diào)控。有趣的是，糖尿病態(tài)下改變最顯著的分布是質(zhì)膜（plasma membrane）和胞外區(qū)域（extracellular）。研究顯示RhoE 表達下調(diào)促進糖尿病大鼠分泌膠原蛋白Col1a1 和Col1a2，這與胞外區(qū)域的分布改變密切相關(guān)。

差異表達蛋白GO 注釋分析提示RhoE 敲除后的糖尿病大鼠主要的細胞外空間成分、相關(guān)血小板衍生生長因子結(jié)合功能、血壓上調(diào)的生物過程均明顯上調(diào)，而有關(guān)胞質(zhì)大核糖亞基成分、核糖體結(jié)構(gòu)組成功能以及中性脂質(zhì)的分解的生物過程明顯下調(diào)。這與先前報道的RhoE 與心血管相關(guān)研究是一致的［10］。通過KEGG 分析，本研究發(fā)現(xiàn)KO_NG 組與WT_NG 組相比的心臟組織中差異表達蛋白參與的信號通路主要為松弛素信號通路、黏著斑與PI3K-Akt 信號通路等。而KO_HG 組與WT_HG組相比心臟組織中差異表達蛋白參與的信號通路主要為核糖體、冠狀病毒病- COVID-19 與脂肪消化吸收等。上述均提示RhoE 可能通過這些信號通路參與DCM 的病理生理過程。其中PI3K-Akt 信號通路在DCM 中至關(guān)重要，抑制PI3K/Akt 通路的自噬來改善胰島素抵抗［19］，上調(diào)microRNA-203 可以通過PI3K/Akt 信號通路的失活靶向PIK3CA，從而 為DCM 治 療 提 供 可 能［20］。另 外，H2 和H3 松 弛素抑制高糖誘導(dǎo)的新生大鼠心室肌細胞凋亡［21］，內(nèi)皮細胞中高表達的核糖體蛋白（RPS4Y1）可能通過調(diào)節(jié)p38 MAPK 信號通路導(dǎo)致高糖誘導(dǎo)的功能障礙［22］。此外，脂質(zhì)代謝紊亂在DCM 的發(fā)展中也起非常關(guān)鍵的作用，糾正脂質(zhì)代謝紊亂可減輕糖尿病小鼠的心功能不全［23］。而RhoE 的缺失都會進一步導(dǎo)致上述信號通路的激活改變，從而對DCM 的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。這為后期的進一步挖掘DCM 發(fā)病的分子機制提供了可能的方向。另一方面，最新研究表明住院的SARS-CoV-2 感染的2 型糖尿病患者會出現(xiàn)急性心血管綜合征，而出現(xiàn)的急性心臟損傷相關(guān)的潛在機制仍不明確［24］。在本研究中，RhoE 缺乏的糖尿病大鼠的心臟組織中有關(guān)冠狀病毒病-COVID-19 通路被富集，這似乎為COVID-19感染糖尿病患者出現(xiàn)急性心臟損傷的相關(guān)機制研究提供新思路。

在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析中，發(fā)現(xiàn)KO_HG 組與WT_HG 組相比的心臟組織上調(diào)蛋白中Col 1α1 和Col 1α2 相互作用的蛋白較多，下調(diào)蛋白中，參與核糖體通路的相關(guān)蛋白，在網(wǎng)絡(luò)中的相互作用的蛋白較多，同樣在KO_NG 組與WT_NG 組相比的心臟組織中，得到了互作的蛋白（未發(fā)表資料）。這些信息為闡明DCM 的發(fā)病機制提供更直觀的實驗依據(jù)。

本研究存在一定局限性。首先，本實驗研究對象為RhoE 全身敲除的大鼠，并非心臟特異性敲除，因此可能對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。其次，此樣本為大鼠心臟并非人類，所得結(jié)論應(yīng)用人體研究尚需進一步驗證。最后，富集到的相關(guān)蛋白及KEGG 信號還在驗證中。

總之，本研究應(yīng)用最新的4D-LQF 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，首次揭示了RhoE 表達缺失后在糖尿病心臟組織中蛋白質(zhì)表達譜的變化特征，初步解析了差異表達蛋白質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)功能，富集了差異表達蛋白質(zhì)參與的主要信號通路，研究結(jié)果從宏觀角度上為臨床上DCM 的診斷和治療提供了一定的實驗參考。

作者貢獻度說明：

揭偉，郭峻莉：論文設(shè)計；伍彩霞，鄒園：動物實驗及樣本準備；趙鋆，施凱佳，吳林栩，陳旭：數(shù)據(jù)統(tǒng)計、圖表制作和文獻檢索；趙鋆，施凱佳，申志華，郭峻莉，揭偉：文稿撰寫、基金獲取。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。