姜金池，楊晶晶，杜濤，鄧榮，高晶東，王梓怡，崔潔，米利，楊文革，周彬，胡永紅*

（1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816；3.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211816；4.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 無錫 214151）

低聚糖是指2個～10個糖苷鍵聚合而成、分子量介于單糖和多糖之間的糖類化合物[1]。功能性低聚糖不僅具有糖類的一般性質(zhì)，還具有特殊的生理活性，如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抑菌等功能[2]，有些功能性低聚糖還具有促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌增殖、調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群豐度等功能[3]。

大量的研究結(jié)果表明，低聚糖大多來源于植物。裴志勇等[4]從地黃中提取地黃低聚糖（rehmannia glutinosa oligosaccharides，RGOs）與脂肪組織來源的干細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合，探究其對小型豬急性心肌梗死的影響，結(jié)果表明RGOs能夠改善小型豬的心功能，促進(jìn)小型豬心肌梗死的治療。周靜[5]從黨參中提取高抗氧化活性的低聚糖，并通過衰老大鼠模型對其抗衰作用及機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明黨參低聚糖能夠顯著提高血清中的過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSC-Px）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性。綜上所述，不同的植物含有各自特定的低聚糖組分，并且不同來源低聚糖的生理活性也有顯著差異。

由于功能性低聚糖具有低甜度、高溶解性的特點(diǎn)，因此常被作為甜味劑添加至乳制品、烘焙食品、功能飲料中。此外，還有文獻(xiàn)報道功能性低聚糖具有抗菌特性和抗氧化活性，因此可作為防腐劑、飼料和食用涂料的重要原料之一[6]。

本文以褐藻寡糖和果膠寡糖為例，從兩種寡糖的分子結(jié)構(gòu)、生物活性以及生物制造方法，匯總這兩種寡糖的研究進(jìn)展，并對其未來的發(fā)展方向進(jìn)行展望。

1 褐藻寡糖

褐藻寡糖（aliginate oligosaccharide，AOS）是由褐藻膠降解得來的低聚糖，聚合度通常為2～25。褐藻寡糖作為一種典型的海洋寡糖，因其具有多種生物活性，近些年已成為功能性低聚糖的一大研究熱點(diǎn)[7]。

1.1 褐藻寡糖的生物活性

目前的研究表明，褐藻寡糖可通過抗炎、抑菌、抗氧化等方式，達(dá)到促進(jìn)植物生長、防治病蟲害的功效。因此，需要對褐藻寡糖的生物活性進(jìn)行系統(tǒng)研究匯總。

1.1.1 抗氧化活性

近年來，多項研究證實(shí)褐藻寡糖作為一種有效的自由基清除劑，可以通過降低機(jī)體脂質(zhì)過氧化物的含量達(dá)到抗氧化的目的[8]。

包華芳等[9]利用酶解制備得到的褐藻寡糖來研究其抗氧化活性，結(jié)果表明褐藻寡糖的抗氧化活性與還原糖的含量密切相關(guān)；張明杰等[10]通過高效酶法制備了低分子量褐藻寡糖，評價其抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低分子量褐藻寡糖比高分子量褐藻寡糖具有更高的自由基清除活性；Yang等[11]研究了褐藻寡糖對草魚肝臟脂肪代謝的改善能力及抗氧化活性，結(jié)果表明褐藻寡糖可以通過提高肝臟的抗氧化能力，進(jìn)而減少脂肪積累和肝臟細(xì)胞的凋亡。

1.1.2 抗腫瘤活性

近年來，多項研究報道褐藻寡糖具有一定的抗腫瘤活性，因此明確褐藻寡糖和腫瘤分子的機(jī)制和結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系是十分有必要的。

Chen等[12]研究了聚合度為2～5的褐藻寡糖對抗骨肉瘤的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)聚合度為5的褐藻寡糖顯著抑制了骨肉瘤細(xì)胞的生長，血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性明顯提高，而血清中的白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的水平明顯降低，說明褐藻寡糖的抗腫瘤活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

1.1.3 抗炎活性

炎癥是機(jī)體抵抗病原體入侵的重要防御機(jī)制，多項研究發(fā)現(xiàn)褐藻寡糖還具有抗炎活性，可以激活機(jī)體的先天免疫細(xì)胞。Wang等[13]通過斷奶仔豬腸炎模型研究褐藻寡糖的抗炎效果，結(jié)果表明褐藻寡糖可通過抑制NOD1/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎功效。史旭陽[14]通過氧化降解法得到褐藻膠寡糖，并且通過細(xì)胞炎癥模型發(fā)現(xiàn)褐藻寡糖能通過抑制細(xì)胞因子、一氧化氮以及環(huán)氧合酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，發(fā)揮抗炎活性的功效。

1.1.4 抑菌活性

多項研究的結(jié)果表明褐藻寡糖具有抑菌活性。An等[15]通過褐藻酸裂解酶制備了聚合度為6～8的褐藻寡糖，結(jié)果表明褐藻寡糖對銅綠假單胞菌的生長具有抑制作用。竇勇等[16]主要研究聚合度為10以下的寡糖對7種常見細(xì)菌和真菌的抑菌作用，結(jié)果證明褐藻寡糖可以顯著抑制細(xì)菌和真菌的生長繁殖。吳國鋒等[17]通過過氧化氫法制備褐藻膠寡糖，并研究不同條件制備的寡糖對啤酒污染菌的抑制作用，結(jié)果表明褐藻膠寡糖可有效抑制啤酒污染菌的生長。

1.2 褐藻寡糖的生物制造

褐藻寡糖的制備方法主要有物理法、化學(xué)法及生物法。物理法是利用微波、超聲或輻射法對褐藻膠進(jìn)行降解，但該方法往往只能得到聚合度不一的褐藻寡糖混合物，導(dǎo)致降解物活性較差?；瘜W(xué)法主要包括酸降解法、有機(jī)合成法等，但存在產(chǎn)物聚合度不均、化學(xué)殘留的問題。生物法主要包括酶促降解法、酶促合成法、產(chǎn)酶微生物發(fā)酵法等，能夠保護(hù)反應(yīng)底物的活性基團(tuán)，產(chǎn)生的褐藻寡糖聚合度可控、分子量小、安全，因此可以有效避免物理法、化學(xué)法的不足。

1.2.1 褐藻裂解酶的種類

褐藻膠裂解酶有多種分類方式[18]。根據(jù)作用方式分為內(nèi)切酶和外切酶；根據(jù)分子質(zhì)量分為20 kDa～35 kDa的褐藻膠裂解酶、40 kDa的褐藻膠裂解酶、60 kDa的褐藻膠裂解酶；根據(jù)序列相似性分為Poly-M特異性裂解酶、Poly-G特異性裂解酶、雙功能裂解酶。根據(jù)底物特異性，可以分為1，4-β-D-聚甘露糖醛酸裂酶和1，4-α-L-聚古羅糖醛酸裂解酶。

1.2.2 褐藻裂解酶的改造研究

1.2.2.1 高產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的篩選

微生物是褐藻膠裂解酶的重要來源之一，因此首先需要篩選出高產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株。孟青等[19]從海泥樣品中篩選得到一株高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株，該菌株所產(chǎn)的褐藻膠裂解酶主要降解褐藻膠內(nèi)古羅糖醛酸片段，且產(chǎn)物聚合度較單一；劉海超[20]使用透明圈法篩選出1株高酶活的褐藻膠降解菌株——弧菌屬，通過優(yōu)化發(fā)酵條件等方式將其酶活提高了38.5%；趙婉琳等[21]篩選到1株能降解褐藻膠的?？曝愄厥暇?，經(jīng)優(yōu)化后酶活提高至68.5 U/mL。

1.2.2.2 基因工程改造

采用基因工程技術(shù)對基因進(jìn)行分子修飾及異源表達(dá)可以有效提高酶活力和產(chǎn)酶量，因此用基因工程技術(shù)構(gòu)建裂解酶高產(chǎn)菌株也成為一個重要手段。李世昂[22]通過克隆溶藻弧菌內(nèi)產(chǎn)褐藻膠裂解酶的基因構(gòu)建出體外表達(dá)的重組菌株，再對其進(jìn)行異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)。Rahman等[23]從海螺消化道克隆表達(dá)了PL-14家族的海藻酸裂解酶LbAly28，并發(fā)現(xiàn)重組酶對海藻酸鈉和聚鎂嵌段底物都有很強(qiáng)的活性。陳琳等[24]通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)獲得羊鮑腸道中弧菌的褐藻膠裂解酶基因val1，在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，研究結(jié)果表明val1基因是PL7家族中一種具有較強(qiáng)耐冷性的褐藻膠裂解酶。

2 果膠寡糖

果膠寡糖是由果膠通過果膠酶降解得到的產(chǎn)物，具有抗氧化、改善腸道健康、抗腫瘤等多種活性。

2.1 果膠寡糖的作用

2.1.1 抗氧化活性

果膠寡糖的抗氧化活性主要是通過清除DPPH自由基、羥自由基來保護(hù)血管和抑制血清中丙二醛的合成。丁鵬等[25]通過酶法制備了黑莓果膠寡糖，結(jié)果表明黑莓果膠寡糖對自由基有很好的清除作用。Li等[26]從山楂果膠中提取了聚合度為5的山楂果膠寡糖，結(jié)果表明這種山楂果膠寡糖具有顯著的抗氧化活性。

近年來果膠寡糖的抗氧化活性也被應(yīng)用于食品保鮮研究。陶璐等[27]探究了不同濃度的山楂果膠寡糖對香菇的保鮮效果，結(jié)果表明果膠寡糖能夠顯著減少香菇在儲藏過程中維生素C、還原糖和總酚含量的損失。

2.1.2 腸道改善活性

果膠寡糖由半乳糖醛酸和中性糖組成，多項研究表明果膠寡糖可以通過改變腸道菌群進(jìn)而改善腸道健康。

Hu等[28]探究柑橘果膠寡糖對膽固醇代謝和腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明果膠寡糖能夠顯著降低小鼠血清總膽固醇（total cholesterol，TC），顯著增加小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量，并且低密度膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的含量明顯比對照組降低。由于果膠寡糖的種類較多，不同果膠酶降解的產(chǎn)物在甲基化程度、甲酯化程度、聚合度以及結(jié)構(gòu)組成上均有很大的差異，不同類型的果膠寡糖對雙歧桿菌的增殖作用也存在差異。

2.1.3 抗腫瘤活性

大量研究表明，果膠寡糖可能通過兩種途徑來抑制腫瘤的生長，一是改變細(xì)胞膜的通透性，二是增加半乳糖凝集素-3的分泌。Mallikarjuna等[29]從燕子根果膠多糖中提取出燕子根果膠寡糖，該種果膠寡糖通過減少半乳糖凝集素-3的凝集和抑制下游控制凋亡的關(guān)鍵蛋白survivin的mRNA表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的生長。Kapoor等[30]從酸生番茄果膠中提取出果膠寡糖并研究其抗癌作用，結(jié)果表明酸生番茄果膠寡糖可通過抑制半乳糖-3的活性，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的生長；Olano-Martin等[31]發(fā)現(xiàn)果膠寡糖可加速結(jié)腸癌細(xì)胞HT29萎縮和死亡進(jìn)而抑制腫瘤的形成。

2.2 果膠寡糖的生物制造

果膠寡糖主要是通過酶法制造獲取，主要途徑有兩種：酶合成法和酶降解法。

酶合成法主要通過選擇特定的酶作為催化劑，將半乳糖醛酸糖單元以α-1，4-糖苷鍵連接，最終形成果膠寡糖。由于酶合成法所需的糖苷酶價格較高，制備過程繁瑣、產(chǎn)率低，因此該方法不適用工業(yè)上大批量的生產(chǎn)。

酶降解法主要利用果膠酶的作用將果膠降解為果膠寡糖。該方法具有反應(yīng)條件溫和、寡糖分離純化的工藝較簡單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。

2.2.1 果膠酶的種類

降解果膠的果膠酶主要分類見表1。

表1 果膠酶的種類Table 1 Pectinase species

2.2.2 果膠酶的改造研究

目前果膠酶的改造主要有3種方法，高產(chǎn)果膠酶菌株的篩選、誘變育種、基因工程。

2.2.2.1 高產(chǎn)果膠酶的菌株

研究表明果膠酶主要來源于細(xì)菌、真菌及放線菌。楊逸飛等[32]從來源于海南的土壤樣品中篩選出一株枯草芽孢桿菌，所產(chǎn)的果膠酶具有較好的耐堿性和熱穩(wěn)定性。尹樂斌等[33]從湖南省武岡市臍橙果園土樣中分離得一株尖孢鐮刀菌BM201，所產(chǎn)果膠酶酶活高達(dá)421 U/L。張耀廣等[34]從18份復(fù)烤煙草中分離出38株可降解果膠的細(xì)菌和9株可降解果膠的真菌，結(jié)果表明其中有5株細(xì)菌具有較強(qiáng)的果膠降解能力。

2.2.2.2 誘變育種

誘變育種具有操作簡單、成本低的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛用于果膠酶的改造。Hadj-Taieb等[35]使用亞硝酸誘變青霉菌后得到一株突變型菌株CT1，該株菌的酶活顯著高于其他野生菌株。葛新宇[36]使用脈沖強(qiáng)光誘變黑曲霉，顯著提高果膠酶的酶活并改變菌株產(chǎn)酶的性質(zhì)。黃丹梅等[37]通過對黑曲霉進(jìn)行紫外光照誘變，得到了高產(chǎn)果膠酶的黑曲霉菌株。此外，氮離子注入誘變技術(shù)也是目前的研究熱點(diǎn)之一。陳麗娟等[38]對產(chǎn)復(fù)合酶黑曲霉菌注入氮離子能量，進(jìn)行誘變處理后得到變異菌株，結(jié)果表明該變異菌株的果膠酶、纖維素酶和酸性蛋白酶的酶活力顯著提高。誘變種類及優(yōu)缺點(diǎn)見表2。

表2 誘變種類及優(yōu)缺點(diǎn)Table 2 Types and relative merits of mutagenesis

2.2.2.3 基因工程技術(shù)

基因工程技術(shù)可以在分子水平上改變產(chǎn)物酶學(xué)性質(zhì)。韓萌萌等[39]從黑曲霉中克隆出果膠甲酯酶基因pmeA，構(gòu)建出能分泌表達(dá)果膠甲酯酶的純合重組菌株TH-2，再敲除TH-2中能分泌α-淀粉酶的asaA基因，最后得到溫度和pH值作用范圍均較寬的高產(chǎn)果膠甲酯酶的黑曲霉工程菌。陳恩發(fā)等[40]通過PCR技術(shù)克隆果膠鹽裂解酶基因，構(gòu)建出原核表達(dá)載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)魔芋軟腐中的兩個致病基因pelD和pelE經(jīng)誘導(dǎo)后酶活均明顯升高。

綜上所述，基因工程技術(shù)克服了傳統(tǒng)育種的盲目性，不僅能提高菌株的產(chǎn)酶能力，還能改變酶的性質(zhì)。

3 展望

功能性低聚糖的研究一直是近年來的熱點(diǎn)，其多種功能活性在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等方面都具有廣闊的應(yīng)用前景。褐藻寡糖作為典型海洋寡糖，對其功能活性的深入研究可以為開發(fā)其他功能性海洋寡糖有良好的借鑒作用。目前的研究結(jié)果表明，生物法是褐藻寡糖和果膠寡糖相對高效、安全、成本較低的制備方法。

就目前的技術(shù)手段、研究熱點(diǎn)而言，突破功能性低聚糖高效制備的關(guān)鍵性難題仍需在以下幾點(diǎn)做好攻關(guān)：一是融合跨學(xué)科的科學(xué)方法。結(jié)合人工智能技術(shù)，深入挖掘多種方法研究功能性低聚糖的作用，并開發(fā)優(yōu)化低聚糖制備的新方法、新設(shè)備；二是繼續(xù)加強(qiáng)基礎(chǔ)研究的力度。利用多組學(xué)技術(shù)手段探明菌株產(chǎn)酶的分子機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)，設(shè)計新思路構(gòu)建高效產(chǎn)酶菌株的篩選模型和方法，最終實(shí)現(xiàn)低聚糖研究的重要突破。