李欣，李雪菲，侯文博，馮俊

非動脈炎性前部缺血性視神經(jīng)病變(nonanteritic anterior ischemic optic neuropathy，NAION)是由于睫狀后短動脈循環(huán)障礙，造成視盤的篩板前區(qū)及篩板區(qū)供血不足引起的視神經(jīng)疾病。其主要癥狀特點是視力突然減退、視乳頭水腫、與生理盲點相連的象限性視野缺損。NAION 的發(fā)病人群以45 歲以上者為主，其發(fā)病突然，對視功能造成不同程度的損害，是危害中老年人視功能的重要原因之一[1]。目前仍缺乏有效改善NAION 的視功能的治療方法[2]。本課題組前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)歸元剔絡養(yǎng)血方能有效改善NAION 患者視力、視野，以及患者視神經(jīng)血液供應[3-4]，但其具體機制不明確。血管內(nèi)皮生長因子(vasculaur endothelial growth factor，VEGF)在缺血缺氧情況下表達顯著，廣泛參與缺血性腦卒中、心肌缺血及年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿性視網(wǎng)膜病變等多種疾病，在減輕氧化應激損傷、促進血管新生、抑制細胞凋亡、保護神經(jīng)等方面發(fā)揮重要作用[5-7]。VEGF 在NAION 中的作用尚不明確。本研究擬探討NAION 大鼠VEGF 表達情況，及歸元剔絡養(yǎng)血方對VEGF 的調(diào)控作用，探討其治療NAION的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇健康的Spargue-Dawley (SD) 雄性大鼠72 只，體重160～180 g，SPF 級別[購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2016-0006]。由中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：12 h/12 h 交替光暗，溫度25℃，濕度55%左右，自由飲食、飲水，動物房環(huán)境保持安靜、通風良好。所有實驗操作遵循《北京市實驗動物管理條例》，并按實驗動物3R 原則給予人道關(guān)懷。實驗前在散瞳條件下檢查SD 大鼠雙眼前節(jié)和眼底，排除屈光間質(zhì)和眼底異常的大鼠。

1.2 藥品、試劑與儀器

歸元剔絡養(yǎng)血方水煎劑(組成：當歸、土鱉蟲、黃芪、川芎、桃仁、紅花、茯苓、甘草，由中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院藥劑科煎制），煎制濃縮到2 g/mL；4%水合氯醛溶液(國藥集團，H37022673)；復方托吡卡胺滴眼液(日本參天制藥有限公司，MP2234）；鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天制藥有限公司，B2121)；氧氟沙星眼膏(日本參天制藥有限公司，TRN3138)；孟加拉玫瑰紅(美國Sigma 公司，632-69-9)；熒光素鈉注射液(廣州白云山明興制藥有限公司，10V13)；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，C-101)；VEGF免疫組化試劑盒(中國邁新，KIT-9710)；大鼠VEGF酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，138361135)。

氪激光機(美國Lumenis 公司，532nm 激光器)；眼底血管造影機(日本Topcon 公司，TRC.50DX)；石蠟切片機(德國Leica 公司，RM2235)；石蠟切片攤片機(德國Leica 公司，HI1210)；石蠟切片烘片機(德國Leica公司，HI1220)；全自動脫水機(德國Leica公司，ASO300S)；光學顯微鏡(德國Leica 公司，DM2500)；90 D 前置鏡(美國Ocular 公司)；全自動多功能酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，THERMO Multiskan MK3]；電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特公司，DH4000A)；微型震蕩器(江蘇其林貝爾公司)。

1.3 動物模型的建立、分組及給藥

SD 雄性大鼠24 只，右眼為實驗眼，采用光動力方法[8]制備NAION 大鼠模型：復方托吡卡胺滴眼液點眼散瞳；4%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉；大鼠尾靜脈注入孟加拉紅后，立即將大鼠置于激光機前，瞄準光對準視盤進行照射(激光參數(shù):波長532 nm，能量75 mW，光斑直徑500 μm，照射時間18 s)。注入孟加拉紅與激光照射結(jié)束的時間控制在1 min 以內(nèi)。隨機分為模型組和中藥組，每組各12只。造模第2 d 每組隨機抽取4 只大鼠行右眼眼底彩色照相及眼底熒光造影檢查，存在視盤水腫，視盤早期低熒光、晚期熒光素滲漏者標志造模成功，未成模者剔除。中藥組每日予30 g/kg 歸元剔絡養(yǎng)血方3 mL灌胃；模型組大鼠每日給予同體積蒸餾水灌胃1次。取正常未干預SD 雄性大鼠12 只為正常組，常規(guī)飼養(yǎng)作為對照。給藥第10 d 處死大鼠，進行實驗指標測定。

1.4 視網(wǎng)膜、視神經(jīng)組織病理學改變

給藥后第10 d每組頸椎脫臼法隨機處死4只大鼠，快速摘取眼球，保留約2 mm 長視神經(jīng)；去除眼前節(jié)和玻璃體，視網(wǎng)膜視神經(jīng)組織固定24 h，梯度酒精脫水、二甲苯透明后浸蠟包埋；作過視神經(jīng)的矢狀面連續(xù)切片，厚度4 μm切片；切片常規(guī)脫蠟、水化后行HE 染色，光學顯微鏡觀察視神經(jīng)、視網(wǎng)膜各層病理改變，并照相記錄。

1.5 免疫組織化學法測定大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達

隨機選取給藥第10 d 各組大鼠石蠟切片3 張，常規(guī)脫蠟，水化，抗原修復，血清封閉；一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育，二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）顯色5～10 min，蘇木精復染后脫水、透明、封片，光鏡下觀察組織VEGF 的表達。應用Image-Pro Plus 6.0軟件測量平均光密度值。

1.6 ELISA 法檢測大鼠玻璃體和外周血VEGF 的表達

給藥第10 d，各組隨機選取8 只大鼠，腹腔注射4%水合氯醛(1 mL/100 g)，待全身肌肉松弛，呼吸平穩(wěn)；迅速摘出右側(cè)眼球。打開腹腔，于腹主動脈抽取全血約1 mL。0.9%氯化鈉注射液漂洗眼球表面血液成分；去除大鼠角膜、晶狀體，取出玻璃體，置于無菌EP 管中；加0.9%氯化鈉注射液，手工勻漿，制備10%勻漿液；低溫低速離心，2,500轉(zhuǎn)/min，時間10～15 min，取上清液制備成玻璃體組織勻漿，酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法測定玻璃體內(nèi)VEGF 含量。將外周血靜置，離心，2,500 轉(zhuǎn)/min，時間10 min；吸取上清液300 μL 至EP管。應用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法測定血清VEGF含量。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計學軟件進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 眼底形態(tài)學改變

造模第2 d，眼底彩色照相（圖1）顯示NAION 大鼠視盤邊界模糊；視網(wǎng)膜熒光血管造影顯示視盤脈絡膜充盈不良，視盤血管異常熒光素滲漏（圖2），與NAION臨床表現(xiàn)一致。

圖1 NAION模型大鼠眼底形態(tài)學改變。

圖2 大鼠視網(wǎng)膜熒光血管造影

2.2 大鼠視網(wǎng)膜組織病理學改變

HE 染色顯示正常大鼠視網(wǎng)膜外核層（outer nuclear layer，ONL）、內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGCs）、視神經(jīng)纖維層（retinal nerve fiber layer，RNFL）各層組織結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，RGCs 排列有序、致密，RNFL 平鋪于RGCs 表面；10 d 時，模型組RNFL 水腫、RGCs 丟失 明顯；中藥 組RNFL 水腫，RGCs少量丟失（圖3）。

圖3 3組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學改變（HE染色，×200）

2.3 大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達

正常組大鼠淺層視網(wǎng)膜血管有少量VEGF 表達。模型組、中藥組淺層視網(wǎng)膜血管、視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）層可見VEGF表達（圖4）。

圖4 3組大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達（免疫組織化學染色，×200）

組間視網(wǎng)膜VEGF 平均光密度差異存在統(tǒng)計學意義（F=19.851，P=0.004）；模型組視網(wǎng)膜VEGF 平均光密度（0.17±0.02）較正常組（0.07±0.02）升高（t=6.299，P=0.001）；中藥組視網(wǎng)膜VEGF 平均光密度（0.13±0.01）高于正常組（t=3.646，P=0.015），低于模型組（t=-2.966，P=0.031），均有統(tǒng)計學意義。

2.4 ELISA 法檢測大鼠玻璃體和外周血VEGF 的表達

組間血清VEGF 濃度存在統(tǒng)計學差異（F=5.440，P=0.018）；模型組血清VEGF濃度較正常組升高（t=2.803，P=0.014）；中藥組血清VEGF 濃度較模型組降低（t=-2.787，P=0.015），差異均有統(tǒng)計學意義。中藥組與正常組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而3 組間玻璃體VEGF 濃度比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組大鼠玻璃體、外周血VEGF濃度比較（，pg/mL，n=8）

表1 各組大鼠玻璃體、外周血VEGF濃度比較（，pg/mL，n=8）

注：*與正常組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05；VEGF血管內(nèi)皮生長因子

3 討論

VEGF 作為內(nèi)皮細胞的特異因子廣泛作用于腫瘤、缺血性疾病及炎性病變等。VEGF 家族包括VEGF A-F、胎盤生長因子（placenta growth factor，PlGF）和內(nèi)分泌源性血管內(nèi)皮生長因子（endocrine gland-derived vascular endothelial growth factor，EGVEGF）[9]。VEGF受體包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。VEGF 的作用主要有：（1）促血管生成。VEGF 不僅參與胚胎時期的血管發(fā)育。在腫瘤、炎癥、缺血、缺氧狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞、巨噬細胞、RPE 細胞、視網(wǎng)膜Müller 細胞、膠質(zhì)細胞等分泌VEGF-A。VEGF-A 是最強的促血管生成因子。VEGF-A 與VEGFR-1相互作用，通過激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/ protein kinase B，PI3K/Akt)、絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK)等途徑，促進血管內(nèi)皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、造血干細胞等趨化和遷移。VEGF-A 與VEGFR-2 結(jié)合，通過多種通路，參與內(nèi)皮細胞的增殖；通過激活PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導通路，抑制內(nèi)皮細胞凋亡。通過以上一系列步驟，VEGF 促進了血管形成相關(guān)細胞的增殖和遷移，誘導了病理性血管的形成。在疾病中，病理性血管生成可以增加血流灌注，改善血氧供應[10]。但同時由于其結(jié)構(gòu)不完善，存在引發(fā)出血、水腫，或促進腫瘤生長等問題。（2）增加血管通透性。VEGF-A、VEGF-E 與VEGFR-2 結(jié)合，作用于某些整合素，破壞細胞之間的連接，誘導內(nèi)皮細胞形成窗孔，增加血管通透性；或通過激活Akt 激酶，促進內(nèi)皮細胞生成一氧化氮（nitric oxide，NO），進而擴張血管，增加血管通透性。血管通透性的增加為細胞遷移、血管生成創(chuàng)造條件，但同時導致血漿大分子外滲［11］，加重組織水腫、炎癥反應加重。VEGF增加毛細血管通透性的作用是組胺的5 萬倍。（3）保護神經(jīng)元，①抑制神經(jīng)元凋亡，VEGF-A、VEGF-B 可以拮抗RGCs 凋亡[12]。VEGFR-2R/PI3K/Akt是抑制神經(jīng)元凋亡的重要信號轉(zhuǎn)導通路[13]；②促進神經(jīng)元再生，VEGF 可以直接促進神經(jīng)干細胞的增生，或者促進膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化為新生神經(jīng)元[14-16]。（4）促進淋巴管的生長。VEGF-C、VEGF-D 有促進淋巴管生長的功能。

綜上分析，VEGF 具有促血管生成、增加血管通透性、保護神經(jīng)、促進淋巴管生長的重要作用。眼部視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞、RPE 細胞、Müller 細胞、星形膠質(zhì)細胞、RGCs 都可以分泌VEGF[17]。在年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變及視網(wǎng)膜靜脈阻塞等眼病中VEGF 均扮演重要角色，通過誘導血管新生和增加血-視網(wǎng)膜屏障通透性[18-19]，導致視網(wǎng)膜出血、水腫的發(fā)生，使病變加重或反復。

目前關(guān)于NAION 中VEGF 的研究尚未深入。有文獻[20]報道VEGF 為影響NAION 患者的獨立危險因素，與病變呈正相關(guān)。對于NAION 的抗VEGF治療目前存在分歧[21]，有研究[22]表明玻璃體腔注射康柏西普可有效降低玻璃體內(nèi)VEGF-A 水平，顯著提高NAION 患者的視力和視野，有效改善臨床療效。亦有實驗[23]表明玻璃體腔注射抗VEGF 藥物對于NAION 沒有明顯的治療作用。多次抗VEGF 治療甚至成為患缺血性視神經(jīng)病變的危險因素[24]。

本次研究觀察了NAION 大鼠視網(wǎng)膜、玻璃體、外周血中VEGF 表達的變化，及中藥復方歸元剔絡養(yǎng)血方對其調(diào)節(jié)作用。根據(jù)文獻[25-27]報道，在NAION、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、腦缺血等病變的大鼠模型中，造模后約2 周組織VEGF 表達有差異性變化。本次研究考慮中藥的起效時間，以10 d 為觀察點進行取樣檢測。研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠視網(wǎng)膜VEGF 表達及外周血VEGF 濃度明顯高于正常組，證明在NAION 早期存在VEGF 的高表達，這與SUN 等[25]、RANGELA 等[28]的研究一致。中藥組視網(wǎng)膜VEGF表達及外周血VEGF 濃度均較模型組降低，說明歸元剔絡養(yǎng)血方有抑制VEGF 過度表達的作用。結(jié)合視網(wǎng)膜組織病理表現(xiàn)，中藥組RNFL水腫及RGCs丟失較模型組減輕，說明歸元剔絡養(yǎng)血方可能通過抑制VEGF 過度表達，減輕其增加血管通透性的作用，進而減輕水腫和炎癥反應，對視神經(jīng)、視網(wǎng)膜組織起到保護作用，抑制了RGCs 的凋亡。本次實驗中，模型組玻璃體VEGF 濃度較正常組有增高的趨勢，但無統(tǒng)計學意義；中藥組玻璃體VEGF 濃度較模型組有降低的趨勢，亦無統(tǒng)計學意義，可能與觀察時間短，或者歸元剔絡養(yǎng)血方主要在血液中發(fā)揮作用有關(guān)。后續(xù)將在此基礎上，研究早期NAION 中，歸元剔絡養(yǎng)血方抑制VEGF 過度表達的機制；觀察VEGF 在NAION 病變過程中的動態(tài)表達，以及歸元剔絡養(yǎng)血方對它的調(diào)控作用，系統(tǒng)分析歸元剔絡養(yǎng)血方對VEGF的調(diào)控作用，及治療NAION的機制。