梁明明，馮冰

視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞損傷與多種視網膜病變相關疾病的發(fā)生發(fā)展有關，糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy,DR）是其中之一，也是老年人致盲的重要原因[1]。氧化應激可引起RPE 細胞損傷，抗氧化應激為DR 的治療策略提供了新思路[2-3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，許多微小核糖核酸（microRNA，miRNA）表達水平的變化可能與DR 的發(fā)生進展有關。例如，微小核糖核酸-326（microRNA-326，miR-326）在小鼠視網膜中表達上調，影響了視網膜神經發(fā)育[5]。還有研究[6]報道，在脂多糖刺激的小鼠肺和巨噬細胞中的miR-326 表達下調，而miR-326 過表達可以通過下調Toll 樣受體抑制脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥和氧化應激，減輕急性肺損傷；miR-326/程序性細胞死亡因子4（programmed cell death factor 4，PDCD4）/核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）通路改善脂多糖誘導的MRC-5 細胞損傷[7]。然而miR-326能否對RPE 細胞損傷產生影響尚未見報道。生物學軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-326 與環(huán)狀RNA 泛素特異性肽酶36（circular RNA ubiquitin-specific peptidase 36，circ-USP36）有結合位點。環(huán)狀RNA 具有環(huán)狀共價閉合結構，可參與疾病發(fā)展，如氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）暴露誘導人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中circ-USP36 上調，降低circ-USP36 可減輕ox-LDL 誘導的HUVEC 損傷[8]。然而circ-USP36 對RPE 細胞損傷的影響及機制也尚未清楚。本研究使用高糖誘導RPE 細胞損傷，探索circ-USP36對RPE細胞損傷的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RPE 細胞ARPE-19（上海澳音生物科技有限公司），杜氏改良依格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基（美國Sigma 公司，D0697）；實時熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司，4472908），凋亡檢測試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司，JK8284），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）活性酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，A001-3-2、A003-1-2），雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，KFS303）。

酶標儀、實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo 公司，StepOneTM），流式細胞儀（美國Bio-Rad 公司，F(xiàn)ACSCanto II）。

1.2 細胞處理與分組

根據ARPE-19細胞處理方法的不同，將細胞分為8 個組。（1）用含5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19 細胞24 h，設為對照組（control group，CG）；（2）用含30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19 細胞24 h，設為高糖（high glucose，HG）組；（3）將circ_USP36 干擾表達載體（si-circ_USP36）及陰性對照（negative control，NC）分別轉染至ARPE-19 細胞6 h，然后用30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，設為sicirc_USP36 組、si-NC 組；（4）將miR-326 模擬物及NC 分別轉染至ARPE-19 細胞6 h，然后用30.0 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，設為miR-326 組、miR-NC 組；（5）將circ_USP36 干擾表達載體分別與miR-326 抑制劑（anti-miR-326）及NC 共轉染至ARPE-19 細胞6 h，然后用30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，設為sicirc_USP36+anti-miR-326 組、si-circ_USP36+antimiR-NC組。

1.3 RT-qPCR 檢測circ_USP36 和miR-326 的表達水平

提取各組ARPE-19 細胞的總RNA，合成cDNA后，嚴格按照試劑盒說明書的方法操作，進行RTqPCR 檢測，相對表達量用2-△△Ct法計算，引物信息如表所示（表1）。

表1 引物信息

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集各組細胞，漂洗2 次，加入500 μL 的結合緩沖液重懸，然后加入10 μL 的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI），混勻、避光孵育10 min；上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 ELISA檢測SOD活性和MDA含量

細胞培養(yǎng)48 h 后收集各組細胞，嚴格按照試劑盒說明書操作方法，使用ELISA 法檢測SOD 活性和MDA含量。

1.6 雙熒光素酶報告實驗

通過在線數據庫Starbase 預測顯示circ_USP36與miR-326 存在結合位點。將circ_USP36 的野生型熒光素酶載體（WT-circ_USP36）和突變型熒光素酶載體（MUT-circ_USP36）分別與miR-NC 和miR-326 共轉染至ARPE-19 細胞中，嚴格按照試劑盒說明書操作方法，在雙熒光素酶檢測系統(tǒng)對熒光素酶活性進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，本研究相關數據均為計量資料，且符合正態(tài)分布，采用均數±標準差（）表示，方差分析（ANOVA）進行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗，當P＜0.05時，認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 下調circ_USP36 對高糖作用的ARPE-19 細胞凋亡、氧化應激的影響

4 組間ARPE-19 細胞的circ_USP36、miR-326、細胞凋亡率、SOD 活性、MDA 含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Fcirc_USP36=701.534，F(xiàn)miR-326=392.706，F(xiàn)凋亡率=212.635，F(xiàn)SOD=138.379，F(xiàn)MDA=237.624，均P=0.000）。

兩兩比較，（1）circ_USP36：與CG 組比較，HG 組的circ_USP36 表達升高（t=53.199，P=0.000）；與HG組和si-NC 組比較，si-circ_USP36 組circ_USP36 表達降低（tHG=29.919，tsi-NC=22.849，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學意義。（2）miR-326：與CG 組比較，HG 組miR-326 表達水平降低（t=65.818，P=0.000）；與HG組和si-NC 組比較，si-circ_USP36 組miR-326 表達水平升高（tsi-NC=14.241，tsi-circ_USP36=13.967，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學意義。（3）細胞凋亡率：與CG 組比較，HG 組細胞凋亡率升高（t=21.092，P=0.000）；與HG 組和si-NC 組比較，si-circ_USP36 組細胞凋亡率降低（tsi-NC=14.550，tsi-circ_USP36=13.725，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學意義。（4）SOD 活性：與CG組 比 較，HG 組的SOD 活性降低（t=15.362，P=0.000）；與HG 組和si-NC 組比較，si-circ_USP36 組SOD 活性升高（tsi-NC=12.571，tsi-circ_USP36=12.133，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學意義。（5）MDA 含量：與CG組比較，HG 組MDA 含量升高（t=22.867，P=0.000）；與HG 組和si-NC 組比較，si-circ_USP36 組MDA 含量降低（tsi-NC=14.174，tsi-circ_USP36=14.878，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學意義（圖1、表2）。

表2 下調circ_USP36對高糖誘導ARPE-19細胞凋亡、氧化應激的影響（，n=3）

表2 下調circ_USP36對高糖誘導ARPE-19細胞凋亡、氧化應激的影響（，n=3）

注：*與CG組相比，P＜0.05；#與HG組相比，P＜0.05；&與si-NC組相比，P＜0.05；CG 對照組；HG 高糖組；si-NC 干擾表達載體陰性對照組；si-circ_USP36 circ_USP36干擾表達載體組；circ-USP36 環(huán)狀RNA泛素特異性肽酶36；miR-326 微小核糖核酸-326

圖1 下調circ_USP36對高糖誘導ARPE-19細胞凋亡的影響

2.2 circ_USP36和miR-326靶向關系驗證

Starbase 數據庫預測顯示circ_USP36 和miR-326有互補序列（圖2）。與miR-NC+WT-circ_USP36組（0.41±0.04）比較，miR-326+WT-circ_USP36 組（0.99±0.08）的熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.232，P=0.000）；miR-NC+MUT-circ_USP36組（1.00±0.06）和 miR-326+MUT-circ_USP36 組（0.96±0.08）的熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 circ_USP36和miR-326的互補序列

2.3 miR-326 對高糖作用的ARPE-19 凋亡和氧化應激的影響

與miR-NC 組相 比，miR-326 組的miR-326 表達升高（t=41.254，P=0.000），ARPE-19 細胞凋亡率降低（t=17.547，P=0.000），SOD活性升高（t=8.413，P=0.001），MDA 含量降低（t=15.209，P=0.000），差異均有統(tǒng)計學意義（圖3、表3）。

表3 miR-326對高糖誘導ARPE-19凋亡和氧化應激的影響（，n=3）

表3 miR-326對高糖誘導ARPE-19凋亡和氧化應激的影響（，n=3）

注：miR-NC 過表達載體陰性對照組；miR-326 miR-326 過表達載體組；miR-326 微小核糖核酸-326；SOD 超氧化物歧化酶；MDA丙二醛

圖3 miR-326抑制高糖誘導的ARPE-19凋亡

2.4 抑制miR-326 對下調circ_USP36 處理的高糖作用的ARPE-19凋亡、氧化應激的影響

與si-circ_USP36+anti-miR-NC 組 相比，sicirc_USP36+anti-miR-326組的miR-326表達降低（t=33.486，P=0.000），ARPE-19 細胞凋亡率升高（t=9.096，P=0.001），SOD 活性降低（t=9.145，P=0.001），MDA 含量升高（t=12.360，P=0.000），差異均有統(tǒng)計學意義（圖4、表4）。

表4 抑制miR-326對下調circ_USP36處理的高糖作用的ARPE-19凋亡和氧化應激的影響（，n=3）

表4 抑制miR-326對下調circ_USP36處理的高糖作用的ARPE-19凋亡和氧化應激的影響（，n=3）

注：si-circ_USP36+anti-miR-NC circ_USP36 干擾表達載體+抑制劑陰性對照組；si-circ_USP36+anti-miR-326 circ_USP36 干擾表達載體+miR-326抑制劑組；circ-USP36 環(huán)狀RNA泛素特異性肽酶36；miR-326 微小核糖核酸-326

圖4 抑制miR-326對下調circ_USP36處理的高糖作用的ARPE-19凋亡的影響

3 討論

DR 是由糖尿病引起的眼部常見的并發(fā)癥，嚴重威脅患者視力，其發(fā)病機制復雜，高血糖是公認的主要危險因素[9]。RPE 細胞的氧化應激和細胞凋亡造成的損傷與糖尿病視網膜病變的發(fā)生發(fā)展密切相關[10-11]。研究RPE 細胞損傷機制，可為靶向精準治療DR 開辟新希望。因此，本實驗使用高葡萄糖誘導RPE 細胞建立損傷模型。結果顯示，高糖誘導的ARPE-19細胞的細胞凋亡率升高，SOD 活性降低，MDA 表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義。SOD 是重要的抗氧化酶之一，其活性高低及脂質過氧化產物MDA 含量的多少是衡量抗氧化狀態(tài)的重要指標[12]，本研究結果說明高糖可誘導RPE 細胞氧化損傷。

有研究[13-14]表明，許多miRNA 參與調控細胞氧化應激及細胞損傷過程，是DR 的潛在靶點。據報道[15]，miR-326 通過抑制Krüpple 樣因子7（Krüpplelike factor 7，KLK7）介導的絲裂原活化蛋白激酶信號通路抑制帕金森病中的細胞凋亡并促進多巴胺能神經元的增殖；miR-326-5p 上調可增強細胞活力、抑制神經細胞凋亡和氧化應激，并減輕線粒體損傷[16]。本實驗結果顯示，高糖誘導的ARPE-19 細胞中miR-326 表達水平降低，提示miR-326 可能與高糖誘導的ARPE-19 細胞損傷有關。進一步過表達miR-326 后，發(fā)現(xiàn)ARPE-19 的細胞凋亡率降低，SOD 活性升高，MDA 表達降低，說明過表達miR-326 可降低高糖誘導的ARPE-19 細胞的氧化應激和凋亡。

有研究[17]報道敲除circ_USP36 通過調節(jié)miR-182-5p/Krüpple 樣 因 子5（Krüpple-like factor5，KLF5）軸減輕ox-LDL 介導的人血管平滑肌細胞（human vascular smooth muscle cells，HUVSMC）損傷。沉默circ_USP36 通過miR-942-5p/組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 9，HDAC9）軸抑制了ox-LDL 處理的HUVEC 的細胞凋亡、氧化應激和炎癥[18]。本實驗結果顯示，高糖誘導的ARPE-19 細胞中circ_USP36 表達水平升高；下調circ_USP36 后，ARPE-19 細胞凋亡率降低，SOD 活性升高，MDA 表達降低，表明下調circ_USP36 可減輕高糖誘導的ARPE-19 細胞的氧化應激和凋亡。且本實驗還發(fā)現(xiàn)circ_USP36 靶向調控miR-326；而抑制miR-326可逆轉下調circ_USP36 對ARPE-19 細胞損傷的作用。

綜上所述，下調circ_USP36 可通過靶向調控miR-326 減緩高糖誘導的RPE 細胞凋亡和氧化損傷。研究中關于circ_USP36 可通過調控miR-326進而調控下游mRNA 表達的機制研究，還需要后續(xù)進行深入探討。