朱 瑜， 郭森林， 高 婷， 王 輅， 李端華， 李進(jìn)軍， 葛 燕， 趙 晨

(成都大學(xué) 藥學(xué)院 四川抗菌素工業(yè)研究所， 成都 610106)

非特異性核酸酶(non-specific nuclease)是一類可非特異性降解單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀和超螺旋等幾乎所有形式的核酸酶[1]，被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。在分子生物學(xué)研究中非特異性核酸酶可用于核酸結(jié)構(gòu)測(cè)定和DNA修復(fù)，DNA、RNA的復(fù)制與重組，抗病毒試劑的應(yīng)用等；醫(yī)藥方面，可用于疾病的診斷和治療，如腫瘤、纖維性囊腫、紅斑性狼瘡、兒童急性氣喘等；工業(yè)上主要應(yīng)用于生物制品中外源核酸的去除[2]，減少過敏反應(yīng)，提高產(chǎn)品安全性。

來源于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的非特異性核酸酶(non-specific nuclease fromYersiniaenterocoliticasubsp.Palearctica,Nucyep)熱穩(wěn)定性好[3]，80 ℃水浴2 h仍有60%左右的殘余酶活，優(yōu)異的熱穩(wěn)定性增加了其應(yīng)用的廣泛性。目前，重組Nucyep多使用大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。Boissinot[3]、Fang[4]等在大腸桿菌中成功表達(dá)重組Nucyep，但條件優(yōu)化后仍產(chǎn)量較低；本實(shí)驗(yàn)室前期研究[5]對(duì)Nucyep基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化并克隆至E.coli，表達(dá)量有明顯提高，但與絕大多數(shù)外源基因類似，Nucyep基因在E.coli系統(tǒng)中易形成包涵體[6]，復(fù)性步驟復(fù)雜，且存在復(fù)性收率低、蛋白活性差等問題，為下游純化及進(jìn)一步應(yīng)用帶來限制。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)作為公認(rèn)的安全菌株(generally recognized as safe，GRAS)，具有蛋白分泌能力強(qiáng)、易于高密度發(fā)酵、遺傳背景清晰等優(yōu)勢(shì)，是異源蛋白分泌表達(dá)的理想宿主[7]。信號(hào)肽(signal peptide,SP)作為一種重要的蛋白分泌調(diào)控元件，是一段存在于前體蛋白N-端的短肽鏈，其功能在于引導(dǎo)和調(diào)節(jié)前體蛋白的折疊，在蛋白轉(zhuǎn)移和分泌過程中發(fā)揮極其重要的作用[8]。B.subtilis缺乏外膜結(jié)構(gòu)，分泌蛋白會(huì)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外培養(yǎng)基中，保證分泌蛋白的正確定位和轉(zhuǎn)移則由信號(hào)肽來完成[9]。鑒于Nucyep在E.coli表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)后提取復(fù)雜的問題，本研究擬采用B.subtilis表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行Nucyep的分泌表達(dá)，以期達(dá)到簡(jiǎn)化下游處理的目的。通過無縫克隆方法將來源于B.subtilis基因組的信號(hào)肽DNA混合物隨機(jī)構(gòu)建至Nucyep基因的5′端得到重組表達(dá)載體，對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行篩選得到分泌水平最高的菌株。然后對(duì)該工程菌進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，探究重組菌的表達(dá)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響，確定最適培養(yǎng)條件，為該酶的基礎(chǔ)研究及未來應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及材料

硫酸卡那霉素、氨芐青霉素鈉購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和XhoI購(gòu)自Thermo fisher公司；Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit等試劑盒購(gòu)自BioTek公司；限制性核酸內(nèi)切酶MluI和Eco52 I、DNA Ligation Kit、B.subtilisSecretory Protein Expression System試劑盒購(gòu)自Takara公司；DNA Marker Ⅳ購(gòu)自天根生化科技有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司；葡萄糖及其他無機(jī)鹽等均購(gòu)自成都科龍化工有限公司；Millipore超濾離心管(10 ku)購(gòu)自Merck公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

1×LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、氯化鈉10；3×LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨30、酵母提取物15、氯化鈉30；2×YT培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨16、酵母提取物10、氯化鈉5(pH 7.0)；2×LM培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20、酵母提取物10、氯化鈉10、一水合麥芽糖75、七水合硫酸鎂2。

1.1.3 菌株及質(zhì)粒

本研究所用菌株和質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買和保存，詳見表1。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒

1.2 方法

1.2.1 載體pBE-S-nucyep構(gòu)建及驗(yàn)證

分別擴(kuò)增提取實(shí)驗(yàn)室前期已成功構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET24a-nucyep[5]及pBE-S，使用NdeI和XhoI雙酶切，1%瓊脂糖驗(yàn)證正確后，按Gel Extraction Kit說明書操作，膠回收得到目的片段nucyep及線性載體pBE-S。按DNA Ligation Kit說明書操作，將二者于16 ℃連接過夜獲得pBE-S-nucyep。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化及感受態(tài)制備方法見文獻(xiàn)[10])，抗性篩選陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證并委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司(下稱“北京擎科”)測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒及菌種-20 ℃保存。

1.2.2 分泌表達(dá)載體pBE-S-nucyep-SPs的構(gòu)建

以MluI和Eco52 I雙酶切質(zhì)粒pBE-S-nucyep得到線性化的pBE-S-nucyep，然后使用In-Fusion?HD Cloning Enzyme(無縫克隆酶)將線性化pBE-S-nucyep與帶有15 bp重疊末端的B.subtilis信號(hào)肽DNA混合物(Takara公司B.subtilisSecretory Protein Expression System試劑盒提供)于50 ℃下溫育15 min進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliStellar感受態(tài)細(xì)胞，涂布帶抗性的LB瓊脂平板培養(yǎng)過夜，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將E.coli轉(zhuǎn)化子分別擴(kuò)增提取質(zhì)粒DNA，委托北京擎科進(jìn)行測(cè)序，與試劑盒提供的信號(hào)肽DNA序列進(jìn)行比對(duì)，將序列正確的質(zhì)粒pBE-S-nucyep-SPs(SPs代表不同的信號(hào)肽DNA)及菌種分別于-20 ℃保存。

1.2.3 高分泌水平工程菌的構(gòu)建及篩選

為防止含有相同信號(hào)肽的克隆被重復(fù)篩選，將上述含有不同信號(hào)肽DNA序列的載體pBE-S-nucyep-SPs分別轉(zhuǎn)化B.subtilisRIK1285，得到帶有不同信號(hào)肽DNA的重組工程菌B.subtilisRIK1285/pBE-S-nucyep-SPs。將上述各株重組工程菌分別接種LB培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min過夜培養(yǎng)。再將過夜種子液以體積分?jǐn)?shù)5%接種量接種，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min，收集培養(yǎng)上清液作為粗酶液直接用于活性檢測(cè)，由此獲得Nucyep分泌活性最高的重組工程菌。

1.2.4 重組Nucyep的分泌表達(dá)條件初步優(yōu)化

將篩選得到的分泌表達(dá)水平最高的菌株作為出發(fā)菌株，過夜種子液以體積分?jǐn)?shù)5%接種量接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)表達(dá)至48 h并以此為對(duì)照進(jìn)行條件優(yōu)化。首先對(duì)不同培養(yǎng)基條件下Nucyep的分泌表達(dá)水平進(jìn)行考察，選擇1×LB、3×LB、2×LM、2×YT等4種不同培養(yǎng)基，取發(fā)酵上清液進(jìn)行活性檢測(cè)，選取最優(yōu)分泌表達(dá)培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上，對(duì)重組工程菌的不同培養(yǎng)條件進(jìn)行探討，包括培養(yǎng)總時(shí)長(zhǎng)(24、36、48、60 和72 h)，培養(yǎng)溫度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃)，培養(yǎng)基初始pH值(6.1、6.9、7.5、8.0)，轉(zhuǎn)速(120、140、160、180、200、220 r/min)。以B.subtilisRIK1285作為陰性對(duì)照菌株。

運(yùn)用Excel軟件數(shù)據(jù)分析模塊單因素方差分析[11]對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同時(shí)對(duì)4種因素不同水平間對(duì)Nucyep分泌表達(dá)的影響結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)判斷其差異程度，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.2.5 粗酶液的濃縮及SDS-PAGE分析

培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min，收集上清液即粗酶液，用Millipore超濾離心管50 mL/10 ku超濾濃縮并做脫鹽處理。取40 μL上述濃縮上清液，加入5×上樣緩沖液10 μL進(jìn)行煮沸制樣。以實(shí)驗(yàn)室前期純化酶Nucyep為陽(yáng)性對(duì)照品，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色并脫色，對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.6 重組Nucyep的活性測(cè)定

采用比光密度法對(duì)重組Nucyep進(jìn)行活性檢測(cè)。反應(yīng)體系為36 μL 0.1 μg/μL鮭魚精子DNA底物溶液(20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，pH 7.23)，加入2 μL發(fā)酵上清液混合均勻，即開啟反應(yīng)。反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間4 min，加入反應(yīng)終止液并立即冰浴以終止酶反應(yīng)[12]。取10 μL反應(yīng)混合物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用Biorad公司Quantity One(Ver.4.6.6)軟件分析各條帶，記錄光密度值。在上述條件下，酶活單位定義為在37 ℃，pH 7.23的條件下，38 μL的體系中以濃度為0.1 μg/μL的核酸為底物，每分鐘使核酸的比光密度值減少1%的酶量定義為1個(gè)活性單位(Unit)。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體pBE-S-nucyep的構(gòu)建及驗(yàn)證

如圖1所示，目的基因nucyep長(zhǎng)度為792 bp，對(duì)重組載體pBE-S-nucyep雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析可見800 bp左右出現(xiàn)目的條帶，大小與預(yù)期一致，表明pBE-S-nucyep成功構(gòu)建。

M：Marker IV；1：未酶切質(zhì)粒pBE-S-nucyep；2：Nde I單酶切質(zhì)粒pBE-S-nucyep；3：Nde I，Xho I雙酶切質(zhì)粒pBE-S-nucyep。圖1 重組載體pBE-S-nucyep雙酶切驗(yàn)證結(jié)果Figure 1 The double digestion results of plasmid pBE-S-nucyep

2.2 高分泌水平工程菌的構(gòu)建及篩選

將線性化pBE-S-nucyep與信號(hào)肽DNA混合物進(jìn)行無縫克隆，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliStellar感受態(tài)細(xì)胞并涂布于LB抗性平板，獲得53個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。擴(kuò)增提取所有陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA并測(cè)序(包括基因5′端信號(hào)肽序列及nucyep基因序列)，經(jīng)比對(duì)后共得到43個(gè)正確質(zhì)粒。將上述帶不同信號(hào)肽的質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)化B.subtilisRIK1285，挑取陽(yáng)性克隆并進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá)，對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行Nucyep活性檢測(cè)。含有不同信號(hào)肽重組菌的活性測(cè)定結(jié)果如圖2所示，這表明大部分信號(hào)肽都能促進(jìn)重組酶的分泌表達(dá)，且不同信號(hào)肽對(duì)Nucyep分泌表達(dá)的促進(jìn)作用差異明顯。其中，攜帶有信號(hào)肽YoaW的轉(zhuǎn)化子活性最高，光密度下降值達(dá)到44.4%。分別對(duì)促進(jìn)分泌表達(dá)作用最高的4種信號(hào)肽及最低的2種信號(hào)肽序列進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。其中，攜帶信號(hào)肽YoaW、AprE、XynA、Pbp的4個(gè)轉(zhuǎn)化子重組Nucyep的分泌表達(dá)活性最高，光密度下降值均達(dá)到40%以上，而少數(shù)如攜帶信號(hào)肽citH、yjiA轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵上清液中幾乎未檢測(cè)到重組Nucyep的分泌表達(dá)活性(光密度下降值<1%)，再次說明不同信號(hào)肽對(duì)Nucyep的分泌效率差異明顯。

圖2 43株陽(yáng)性克隆的活性檢測(cè)Figure 2 Activity assay of 43 positive clones

表2 高Nucyep活性克隆的信號(hào)肽序列

2.3 重組工程菌分泌表達(dá)條件初步優(yōu)化

2.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)Nucyep分泌表達(dá)水平的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基在微生物的生長(zhǎng)過程中普遍發(fā)揮著重要作用，而其各成分添加量則對(duì)微生物合成蛋白質(zhì)及產(chǎn)酶有重要影響。通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝可以充分利用菌株潛力，提高發(fā)酵的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。選取上述分泌水平最高的菌株B.subtilisRIK1285/pBE-S-nucyep-YoaW作為起始菌株進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化。將重組菌在1×LB、3×LB、2×LM、2×YT等4種不同培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)48 h后離心取上清液進(jìn)行Nucyep酶活測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。3×LB培養(yǎng)基對(duì)重組Nucyep的分泌表達(dá)效果最好，酶活達(dá)到(4.10±0.03) U/μL，約為1×LB培養(yǎng)基中的10倍，且顯著高于2×LM、2×YT培養(yǎng)基，說明高含量的碳氮源對(duì)重組Nucyep的合成與釋放具有顯著的促進(jìn)作用，故選取3×LB為最適培養(yǎng)基，并將其應(yīng)用于后續(xù)培養(yǎng)條件研究。

數(shù)值為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 不同培養(yǎng)基對(duì)重組Nucyep酶活的影響Figure 3 Effects of culture media on recombinant Nucyep activity

2.3.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Nucyep酶活的影響

對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)下的Nucyep活性檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間從24 h至48 h時(shí)，B.subtilisRIK1285產(chǎn)酶呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，酶活由(2.66±0.33) U/μL升高至(4.42±0.43) U/μL，達(dá)到最高，這與Irfan等[13]的研究中重組酶的最佳培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)一致，最高點(diǎn)均出現(xiàn)在48 h。當(dāng)持續(xù)發(fā)酵至58 h和72 h時(shí)，粗酶液中Nucyep酶活力分別下降至(1.84±0.22) U/μL和(2.95±0.55) U/μL。這可能是由于B.subtilisRIK1285存在分泌至胞外的多種蛋白酶對(duì)重組Nucyep具有一定降解作用，導(dǎo)致該階段活性下降。對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間下Nucyep酶活測(cè)定結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，得到P<0.01，表明不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響差異極顯著。綜上，選擇48 h為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

數(shù)值為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間下重組Nucyep酶活Figure 4 Effects of incubation time on recombinant Nucyep activity

2.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)重組Nucyep酶活的影響

溫度主要從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特性、菌體代謝產(chǎn)物合成、微生物代謝調(diào)節(jié)機(jī)制、發(fā)酵液的理化性質(zhì)等方面影響產(chǎn)物的合成，因此在發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度。B.subtilis最佳生長(zhǎng)溫度為25 ℃～37 ℃[14]，且已有不少報(bào)道[15-17]對(duì)B.subtilis表達(dá)異源蛋白進(jìn)行了研究，其中常用的培養(yǎng)溫度范圍為30 ℃～37 ℃。研究探討培養(yǎng)溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃和37 ℃時(shí)重組Nucyep的胞外活性。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)溫度由25 ℃升高至30 ℃時(shí)，酶活呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且在30 ℃時(shí)重組Nucyep活性最高，達(dá)到(6.71±0.23) U/μL。當(dāng)培養(yǎng)溫度上升至35 ℃及37 ℃時(shí)，酶活水平分別出現(xiàn)不同程度的降低，為(2.57±0.70) U/μL和(4.42±0.43) U/μL。對(duì)不同溫度下的酶活水平進(jìn)行單因素方差分析，得到P<0.01，表明差異極顯著，說明溫度對(duì)Nucyep的分泌活性具有較大影響。因此，選擇30 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。

數(shù)值為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5 不同培養(yǎng)溫度對(duì)重組Nucyep酶活的影響Figure 5 Effects of incubation temperature on recombinant Nucyep activity

2.3.4 轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值對(duì)重組Nucyep酶活的影響

研究還探討了轉(zhuǎn)速對(duì)重組Nucyep酶活的影響。結(jié)果如圖6所示，在低轉(zhuǎn)速120和140 r/min時(shí)，培養(yǎng)上清液中Nucyep酶活性偏低，而將轉(zhuǎn)速繼續(xù)提高，酶活出現(xiàn)較大幅度提升，最高值出現(xiàn)于160 r/min處，酶活達(dá)到(6.04±0.44) U/μL。通過對(duì)數(shù)據(jù)的單因素方差分析，得到P=0.001 548<0.05，差異顯著。然而通過對(duì)160～220 r/min幾組不同轉(zhuǎn)速下的Nucyep酶活數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速在160、180和200 r/min時(shí)，3組數(shù)據(jù)組間差異不顯著，而180、200和220 r/min的各組間差異也不顯著，這說明在160～220 r/min轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)速對(duì)Nucyep的分泌表達(dá)影響并不明顯。故研究最終仍選擇以不改變初始條件下的220 r/min為后續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

數(shù)值為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6 不同轉(zhuǎn)速對(duì)重組Nucyep酶活的影響Figure 6 Effects of rotation speed on recombinant Nucyep activity

微生物生長(zhǎng)及生物合成都有其最適合的pH值范圍，不同芽孢桿菌在生理模式上的差異也導(dǎo)致其產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件差別很大。研究表明，枯草芽孢桿菌在pH值為6.5至7.5的條件下生長(zhǎng)良好[18]。研究將分別調(diào)整培養(yǎng)基初始pH值至6.1～8.0，最終獲得Nucyep的分泌活性結(jié)果如圖7所示，對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果P=0.020 929<0.05，差異顯著，說明培養(yǎng)基不同初始pH值對(duì)Nucyep的分泌表達(dá)具有一定影響。然而通過對(duì)培養(yǎng)基初始pH值下Nucyep酶活的數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，結(jié)果表明培養(yǎng)基初始pH值6.1、6.9、7.5的組間差異均不顯著，酶活均處于4～5 U/μL，這說明培養(yǎng)基初始pH值在6.1～7.5重組Nucyep的分泌活性并未受到很大影響，而當(dāng)初始pH值調(diào)整為8.0時(shí)，酶活下降為(3.74±0.43) U/μL，說明重組Nucyep在偏堿性條件下分泌表達(dá)受到抑制。Wang等[19]的研究也表明有時(shí)在培養(yǎng)過程中不對(duì)pH值加以調(diào)控反而更利于芽孢桿菌的產(chǎn)酶，結(jié)合本研究所得結(jié)果，同時(shí)考慮到簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，故最終選擇以培養(yǎng)基自然pH條件(約為6.8～6.9)為最適培養(yǎng)基初始pH值。

數(shù)值為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 不同初始pH值對(duì)重組Nucyep酶活的影響Figure 7 Effects of pH on recombinant Nucyep activity

綜上，重組工程菌培養(yǎng)優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為3×LB培養(yǎng)基，體積分?jǐn)?shù)5%接種量，30 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

2.4 發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)上述各個(gè)因素的優(yōu)化結(jié)果，對(duì)該培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證，培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)粗酶液進(jìn)行活性測(cè)定，結(jié)果如圖8所示，優(yōu)化后Nucyep酶活性具有顯著提高，達(dá)到(8.27±0.41) U/μL，較優(yōu)化前提高約20倍。用10 ku的超濾管對(duì)粗酶液進(jìn)行濃縮約20倍并進(jìn)行脫鹽處理，然后進(jìn)行酶活測(cè)定，反應(yīng)混合物凝膠電泳結(jié)果如圖9所示，核酸底物幾乎被完全降解。超濾濃縮液SDS-PAGE分析見圖10，在30 ku左右出現(xiàn)目的條帶，與理論值相符[5]。結(jié)果均表明，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下重組Nucyep的胞外分泌表達(dá)水平有明顯提高，且活性良好。

數(shù)值為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8 培養(yǎng)條件優(yōu)化前后的酶活測(cè)定Figure 8 Nucyep activity assay before and after optimization

3 討論

不同信號(hào)肽對(duì)目的蛋白的分泌效率差異明顯，雖然目前還未發(fā)現(xiàn)目的蛋白與其自身最優(yōu)信號(hào)肽之間存在一定特性與規(guī)律，但通過對(duì)宿主菌信號(hào)肽篩選仍是一種有效提高目的蛋白分泌表達(dá)的方法。Zhang等[20]建立了信號(hào)肽篩選系統(tǒng)，篩選木聚糖酶在B.subtilis中的最適信號(hào)肽，通過對(duì)Sec途徑的114種信號(hào)肽和Tac途徑的24種信號(hào)肽進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)Sec途徑比Tac途徑信號(hào)肽更利于木聚糖酶的表達(dá)，其中信號(hào)肽PhoB為最佳信號(hào)肽。Yao等[21]通過高通量篩選系統(tǒng)對(duì)B.subtilis信號(hào)肽進(jìn)行篩選，最終獲得3種對(duì)α-淀粉酶分泌效率提高的信號(hào)肽，分泌能力YojL>RpmG>AspB，信號(hào)肽YojL使重組酶活提高了3.5倍。

1：NC為陰性對(duì)照；2～4：優(yōu)化前；5～7：優(yōu)化后；8～10：超濾外液。圖9 活性測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的電泳結(jié)果Figure 9 Electrophoresis results of reaction mixture

M: Marker；C: 對(duì)照品；1: 濃縮液。圖10 濃縮液SDS-PAGEFigure 10 The SDS-PAGE analysis of concentrated supernatant

研究通過無縫克隆法將B.subtilis信號(hào)肽DNA混合物構(gòu)建入Nucyep表達(dá)載體，最終獲得含有43種不同信號(hào)肽的陽(yáng)性克隆。通過對(duì)43株重組工程菌的篩選得到具有高分泌活性的4株，分別含有信號(hào)肽YoaW、AprE、XynA、Pbp，對(duì)這4株高活性工程菌的信號(hào)肽序列及其他信號(hào)肽的序列比對(duì)分析，可發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)與其促分泌性能相關(guān)：信號(hào)肽N端帶正電荷氨基酸數(shù)量為2或3，H端結(jié)構(gòu)域的非極性氨基酸越多，對(duì)重組Nucyep的分泌表達(dá)有促進(jìn)作用，這與B.subtilis信號(hào)肽相關(guān)研究[22-24]結(jié)論一致，但具體原因仍待進(jìn)一步研究。因此應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)信號(hào)肽的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用，充分了解每種途徑中各信號(hào)肽的分泌機(jī)制及相互作用及其影響因素，為未來枯草芽孢桿菌的高效工業(yè)應(yīng)用提供條件。

研究通過構(gòu)建并篩選B.subtilis信號(hào)肽重組工程菌，實(shí)現(xiàn)了Nucyep的胞外分泌表達(dá)，并通過對(duì)培養(yǎng)條件的初步優(yōu)化進(jìn)一步提高了Nucyep的胞外分泌活性。優(yōu)化后，重組Nucyep分泌活性雖然較初始條件有顯著提高，但通過SDS-PAGE不難發(fā)現(xiàn)，其蛋白表達(dá)水平仍然偏低。這可能因?yàn)镹ucyep幾乎能降解一切形式的核酸，對(duì)機(jī)體來說屬于毒性蛋白，且在B.subtilis中直接以具有活性的形式分泌表達(dá)，機(jī)體出于自我保護(hù)而限制了其表達(dá)水平，同時(shí)也可能是B.subtilis系統(tǒng)分泌蛋白酶較多而導(dǎo)致胞外分泌蛋白表達(dá)量低。蛋白酶基因缺陷菌株B.subtilisWB800、WB600等[25]的開發(fā)與應(yīng)用可將胞外蛋白酶活性降至野生型活性的0.32%，從而提高外源基因的表達(dá)，因此后續(xù)可嘗試敲除蛋白酶的B.subtilis菌株作為表達(dá)宿主。鑒于目前還未有利用枯草芽孢桿菌系統(tǒng)重組表達(dá)非特異性核酸酶的研究，無法對(duì)Nucyep在B.subtilis系統(tǒng)中的表達(dá)水平進(jìn)行比較。但通過與實(shí)驗(yàn)室前期在E.coli中表達(dá)Nucyep的研究相比較[5]，B.subtilisRIK1285培養(yǎng)上清液在濃縮約20倍的情況下，才能達(dá)到與E.coli胞內(nèi)表達(dá)大致相當(dāng)?shù)乃?SDS-PAGE)。此外，由于Nucyep為毒性蛋白，在E.coli中以包涵體形式而非可溶形式表達(dá)，這也一定程度上有利其表達(dá)水平的提高，而研究旨在利用枯草芽孢桿菌系統(tǒng)良好的分泌性能及通過信號(hào)肽篩選以實(shí)現(xiàn)Nucyep的高活性分泌表達(dá)。通過培養(yǎng)條件優(yōu)化，結(jié)果表明雖然單因素實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果表現(xiàn)直觀，但存在一定弊端，如多因素考察時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)多、成本高，且會(huì)割斷因素之間的相互影響等。因此，將研究單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果作為基礎(chǔ)條件，后期可選擇統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化法，如Plackett-Burman設(shè)計(jì)法[26]、響應(yīng)面方法[4]等對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以獲得更高的表達(dá)水平。

4 結(jié)論

研究首次將Nucyep的基因構(gòu)建進(jìn)B.subtilis表達(dá)系統(tǒng)，篩選信號(hào)肽得到工程菌B.subtilisRIK1285/pBE-S-nucyep-YoaW，實(shí)現(xiàn)Nucyep的高活性分泌表達(dá)。經(jīng)表達(dá)條件優(yōu)化，該工程菌在3×LB培養(yǎng)基中以體積分?jǐn)?shù)5%接種量，30 ℃，搖床220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，重組Nucyep酶活達(dá)到(8.27±0.41) U/μL，較優(yōu)化前提高20倍，為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。