曹慶超， 盧鈺婷， 金銀哲， 林劍星， 陶 俊， 金英善,4

(1. 揚(yáng)州大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 揚(yáng)州 225009； 2. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院， 上海 201306；3. 揚(yáng)州大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院， 揚(yáng)州 225009； 4. 江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 揚(yáng)州 225009)

芍藥(PaeonialactifloraPall.)，屬毛茛科芍藥屬多年生草本植物，具有豐富的利用價(jià)值。芍藥根作為傳統(tǒng)中草藥，富含萜類、多酚類和揮發(fā)油等化合物[1-2]，具有鎮(zhèn)痙、鎮(zhèn)痛、通經(jīng)、利尿等功效。芍藥花、種子、果肉中富含多酚類物質(zhì)具有較高的抗氧化[3-4]、抗炎活性[3]。芍藥籽餅粕含有15種單萜類物質(zhì)[5]，籽油富含多種不飽和脂肪酸，是一種潛在、可開(kāi)發(fā)利用的新型食用植物油[6]，而芍藥果莢在芍藥籽油加工過(guò)程中作為廢棄物被丟棄，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。

微生物發(fā)酵技術(shù)在活性成分提取和轉(zhuǎn)化植物活性物質(zhì)方面效率更高，具有很大發(fā)展?jié)摿7]。植物組織的微生物發(fā)酵已被用于提高中草藥中生物活性化合物的提取效率或產(chǎn)生新的化合物[8]。已有多種微生物投入實(shí)際生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)室研究中，如枯草芽孢桿菌[9]、青霉菌和曲霉[10]、耶氏酵母[11]等。杭芍是我國(guó)傳統(tǒng)藥用芍藥品種又是油用芍藥，其結(jié)實(shí)率高，果莢資源豐富。研究以油用芍藥杭芍果莢為試驗(yàn)材料，用3種酵母發(fā)酵后，比較酵母發(fā)酵前后生物活性及活性成分變化，為油用芍藥資源的開(kāi)發(fā)利用和芍藥產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

杭芍果莢采自揚(yáng)州大學(xué)文匯路校區(qū)芍藥園。釀酒酵母原始菌株S288C(Saccharomycescerevisiae，SC)、BY4741釀酒酵母(BY4741Saccharomycescerevisiae，BS)和扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera，SF)保存于揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品及相關(guān)試劑：沒(méi)食子酸(國(guó)藥試劑，Lot：20180509)；蘆丁(源葉生物，Lot：H24N9Z75966)；乙酰膽堿酯酶(源葉生物，Lot：J24A10P95592)；加蘭他敏(源葉生物，Lot：Y28S6Y17770)；碘代硫代乙酰膽堿(源葉生物，Lot：H21M9F61841)。

1.2 方法

1.2.1 酵母發(fā)酵產(chǎn)物的制備

芍藥果莢酵母發(fā)酵參考李冰等[12]的方法。精確稱取3份芍藥果莢粉末5 g，加入100 mL蒸餾水混勻，高壓滅菌后，在無(wú)菌條件下分別接種釀酒酵母、BY4741型釀酒酵母、扣囊復(fù)膜酵母菌液20 mL，充分混勻后，于25 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)48 h。所得發(fā)酵液經(jīng)離心抽濾，減壓濃縮并凍干成粉末狀，即得芍藥果莢扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵產(chǎn)物(SF-F)、釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物(SC-F)、BY4741型釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物(BS-F)。未發(fā)酵產(chǎn)物(unfermented，N-F)即不接種菌液，經(jīng)相同條件得到。

1.2.2 總酚、總黃酮含量測(cè)定

總酚含量測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法進(jìn)行，并稍作修改[13]。利用10～50 μg/mL沒(méi)食子酸(gallic acid，GA)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.011 5x+0.008 2，R2=0.998 3)，總酚含量以每克芍藥果莢中含有毫克沒(méi)食子酸當(dāng)量表示(mg GA/g DW)?？傸S酮含量測(cè)定采用AlCl3法[14]。以毫克蘆丁(rutin，RT)當(dāng)量表示每克果莢總黃酮含量(mg RT/g DW)，蘆丁(5～50 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.012 9x-0.002 1，R2=0.999 8。

1.2.3 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除活性測(cè)定參照李冰等[12]的方法，并稍作修改?？箟难?Vc)作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 總抗氧化活性

采用黃佳雙等[15]方法進(jìn)行，稍加改進(jìn)。利用每毫克Vc當(dāng)量來(lái)表示每克芍藥果莢的總抗氧化活性(mg Vc/g DW)。

1.2.5 總還原能力

總還原能力活性測(cè)定參照Z(yǔ)hao等[16]的方法，利用Vc當(dāng)量(mg Vc/g DW)表示芍藥果莢的總還原能力。

1.2.6 蛋白質(zhì)氧化損傷保護(hù)作用

參照曹慶超等[17]的方法進(jìn)行。陽(yáng)性對(duì)照為沒(méi)食子酸(GA)。用凝膠成像儀對(duì)電泳條帶進(jìn)行觀察拍照，并利用Image J進(jìn)行灰度區(qū)分析。

1.2.7 乙酰膽堿酯酶抑制活性

采用改進(jìn)后的Ellman 法對(duì)芍藥果莢發(fā)酵前后產(chǎn)物的乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制活性進(jìn)行測(cè)定[18-19]。加蘭他敏(GT)作為陽(yáng)性對(duì)照。乙酰膽堿酯酶抑制率計(jì)算公式如下：

式中：OD空白為磷酸鹽緩沖液代替待測(cè)化合物的吸光度值；OD空白對(duì)照為磷酸鹽緩沖液代替待測(cè)化合物、蒸餾水代替乙酰膽堿酯酶吸光度值；OD樣品為待測(cè)化合物吸光度值；OD樣品對(duì)照為蒸餾水代替乙酰膽堿酯酶吸光度值。

1.2.8 活性成分分析

(1)分級(jí)萃取及其抗氧化活性測(cè)定。利用分級(jí)萃取技術(shù)依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)芍藥果莢發(fā)酵前后產(chǎn)物進(jìn)行萃取，充分富集有效活性物質(zhì)。每種溶劑重復(fù)萃取3～4次，合并同種萃取層，揮干后分別進(jìn)行總抗氧化活性、總還原能力測(cè)定。

(2)LC-MS成分分析。參照王智慧[20]的LC-MS檢測(cè)方法，并對(duì)其條件進(jìn)行一些修改。

色譜條件：采用Agilent 1200高效液相色譜儀，色譜柱(4.6 mm×150 mm，C18，5 μm，Agilent，America)，溫度為25 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，流速為1 mL/min。檢測(cè)條件：全波長(zhǎng)掃描(200～600 nm)。流動(dòng)相為0.1%乙酸水溶液(A)和乙腈(B)。乙酸乙酯萃取層梯度洗脫程序：0～50 min， 8%B～31%B；50～55 min，31%B～100%B；55～60 min，100%B；60～63 min，100%B～8%B。正丁醇萃取層梯度洗脫程序：0～20 min，5%B～20%B；20～30 min，20%B～35%B；30～50 min，35%B～95%B；50～60 min，95%B，60～63 min，95%B～5%B。

質(zhì)譜條件：ESI離子源霧化壓力為15 psi，氮?dú)饬髁繛?0 L/min，溫度為250 ℃，掃描范圍m/z為100～1 500 Amu。在陽(yáng)離子模式下，電離電壓為4 000 V，破片電壓為250 V；在陰離子模式下，電離電壓為3 500 V，破片電壓為175 V。

1.2.9 分子對(duì)接模擬

基于芍藥果莢LC-MS的分析數(shù)據(jù)，進(jìn)一步利用分子對(duì)接模擬篩選和預(yù)測(cè)N-F、SF-F的潛在生理活性。分子對(duì)接采用的酶均來(lái)自RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)，抗氧化酶包括過(guò)氧化氫酶(PDB ID：4BLC)、谷胱甘肽合成酶(PDB ID：2HGS)，抗衰老靶標(biāo)蛋白酶來(lái)自RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)的SIRT 1(PDB ID：5BTR)和酪氨酸酶(PDB ID：6EI4)。配體小分子物質(zhì)均來(lái)自pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用軟件Chem3D 20.0進(jìn)行MM2分子力學(xué)優(yōu)化構(gòu)象。運(yùn)行AutodockTools 1.5.6軟件，配體小分子物質(zhì)，需要進(jìn)行加氫、加電荷、檢測(cè)配體的root、并搜尋與定義可旋轉(zhuǎn)鍵；從RCSB下載得到的蛋白三維結(jié)構(gòu)，作為對(duì)接所用蛋白，通過(guò)添加氫原子、計(jì)算Gasteiger電荷、合并非極性氫，將其保存為受體。運(yùn)用Autodock vina 1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接，比較所有配體小分子的對(duì)接親和力(kJ/mol)大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、作圖，SPSS 25進(jìn)行顯著性分析。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。采用單因素方差分析(ANOVA)確定實(shí)驗(yàn)組之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚及總黃酮含量

芍藥果莢酵母發(fā)酵前后的總酚含量和總黃酮含量如表1所示，3種酵母發(fā)酵均能改變芍藥果莢的總酚和總黃酮含量。芍藥果莢經(jīng)扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵后(SF-F)的總酚含量(338.29±0.99) mg GA/g DW顯著(P<0.05)高于發(fā)酵前(N-F)的(273.94±3.86) mg GA/g DW，提高了23.49%。芍藥果莢發(fā)酵后總黃酮含量最高的是SC-F(74.79±1.16) mg RT/g DW，比發(fā)酵前(64.02±0.39) mg RT / g DW提高16.82%。

2.2 抗氧化活性

通過(guò)DPPH自由基清除活性、總抗氧化活性和總還原能力，明確芍藥果莢酵母發(fā)酵前后產(chǎn)物體外抗氧化活性的變化。DPPH自由基清除活性如圖1(a)所示，當(dāng)濃度為50 μg/mL時(shí)，SF-F和SC-F的DPPH自由基清除活性均顯著高于發(fā)酵前，其中SF-F的清除率最高。芍藥果莢酵母發(fā)酵對(duì)總抗氧化活性結(jié)果[圖1(b)]顯示，扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵后活性顯著高于發(fā)酵前，提高18.54%?？勰覐?fù)膜酵母和釀酒酵母發(fā)酵均能顯著提高總還原能力[圖1(c)]，其中SF-F的總還原能力最高，比發(fā)酵前提高31.89%。說(shuō)明3種酵母的發(fā)酵均能提高芍藥果莢抗氧化活性，其中扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵效果最佳。

表1 芍藥果莢N-F、SF-F、SC-F及BS-F的總酚、總黃酮含量

(a)DPPH自由基清除活性；(b)總抗氧化活性；(c)總還原能力。N-F(unfermented)為未發(fā)酵產(chǎn)物；SF-F(Saccharomycopsis fibuligera fermentation product)為扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵產(chǎn)物；SC-F(Saccharomyces cerevisiae fermentation product)為釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物；BS-F(BY4741 Saccharomyces cerevisiae fermentation product)為BY4741型釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物。* 表示發(fā)酵后產(chǎn)物與N-F相比，具有顯著性差異(P<0.05)。圖1 芍藥果莢酵母發(fā)酵前后產(chǎn)物的抗氧化活性Figure 1 Antioxidant activities of P. lactiflora Pall. pods beforeand after fermentation products

2.3 蛋白質(zhì)氧化損傷保護(hù)作用

在體內(nèi)活性氧自由基的過(guò)度積累會(huì)引起蛋白質(zhì)的氧化損傷，導(dǎo)致心腦血管疾病等老年病的發(fā)生[21]。通過(guò)Vc/H2O2/Fe3+體系建立體外蛋白質(zhì)氧化損傷模型，對(duì)芍藥果莢酵母發(fā)酵前后產(chǎn)物的蛋白質(zhì)氧化損傷保護(hù)作用進(jìn)行研究。結(jié)果如圖2(a)所示，在SDS-PAGE膠中H2O2處理組的蛋白質(zhì)條帶明顯弱于正常組，說(shuō)明VC/H2O2/Fe3+體系產(chǎn)生的羥自由基對(duì)蛋白質(zhì)造成一定程度的損傷，模型成功建立；樣品組的蛋白質(zhì)條帶明顯強(qiáng)于H2O2處理組，表明樣品組具有清除羥自由基的作用，即對(duì)蛋白氧化損傷具有保護(hù)作用。通過(guò)蛋白質(zhì)條帶的灰度分析結(jié)果[圖2(b)]表明，SF-F處理組的蛋白質(zhì)條帶灰度比顯著高于其他處理組，說(shuō)明扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵液的蛋白氧化損傷保護(hù)作用最佳。

(a)SDS-PAGE凝膠電泳條帶及灰度；(b)樣品的蛋白質(zhì)氧化損傷保護(hù)率。Nor(normal)為正常組；Tre(treated)為 H2O2處理組；GA(gallic acid)為陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)食子酸；N-F(unfermented)為未發(fā)酵產(chǎn)物；SF-F(Saccharomycopsis fibuligera fermentation product)為扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵產(chǎn)物；SC-F(Saccharomyces cerevisiae fermentation product)為釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物；BS-F(BY4741 Saccharomyces cerevisiae fermentation product)為BY4741型釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物。BSA蛋白大小為66 ku。* 表示發(fā)酵后產(chǎn)物與N-F相比，具有顯著性差異(P<0.05)。圖2 芍藥果莢發(fā)酵前后產(chǎn)物蛋白氧化損傷保護(hù)作用Figure 2 Protective effects of oxidative damage of protein in P. lactiflora Pall. pods before and after fermentation products

2.4 乙酰膽堿酯酶抑制活性

乙酰膽堿酯酶是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵酶，能夠催化膽堿能突觸間隙的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水解，終止信號(hào)刺激，阻斷神經(jīng)信號(hào)在體內(nèi)的正常傳遞。乙酰膽堿酯酶抑制劑是一種能對(duì)乙酰膽堿酯酶進(jìn)行可逆性抑制的物質(zhì)，是目前臨床上最為廣泛使用的阿爾茨海默病治療藥物。芍藥果莢酵母發(fā)酵前后產(chǎn)物(1.0 mg/mL)對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用如圖3(a)所示，只有扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵后乙酰膽堿酯酶的抑制作用比發(fā)酵前顯著提高，較發(fā)酵前提高107.24%，并具有濃度依賴性[圖3(b)]，當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時(shí)，乙酰膽堿酯酶抑制活性(60.25%±4.09%)相當(dāng)于10 μg/mL加蘭他敏(陽(yáng)性對(duì)照)的抑制活性(62.54%±2.40%)。說(shuō)明芍藥果莢扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵產(chǎn)物有望作為抗阿爾茨海默病的藥物或保健品。

(a)酵母發(fā)酵前后產(chǎn)物的抑制作用；(b)不同濃度N-F、SF-F的抑制作用。GT(galanthamine)為陽(yáng)性對(duì)照加蘭他敏；N-F(unfermented)為未發(fā)酵產(chǎn)物；SF-F(Saccharomycopsis fibuligera fermentation product)為扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵產(chǎn)物；SC-F(Saccharomyces cerevisiae fermentation product)為釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物；BS-F(BY4741 Saccharomyces cerevisiae fermentation product)為BY4741型釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物。* 表示發(fā)酵后產(chǎn)物與N-F相比，具有顯著性差異(P<0.05)。圖3 芍藥果莢發(fā)酵前后產(chǎn)物乙酰膽堿酯酶抑制作用Figure 3 Inhibition of acetylcholinesterase produced by P. lactiflora Pall. pods before and after fermentation products

2.5 活性成分含量與抗氧化活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性之間的相關(guān)性

通過(guò)軟件SPSS 25對(duì)芍藥果莢發(fā)酵前后的活性成分含量及其抗氧化活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行相關(guān)性分析，所得各變量間的Pearson相關(guān)系數(shù)以及顯著性(雙側(cè))檢驗(yàn)結(jié)果如表2所示?；钚猿煞趾颗c活性之間均存在相關(guān)性，其中總酚含量與DPPH自由基清除活性(0.913)、總抗氧化活性(0.921)、總還原能力(0.978)、蛋白質(zhì)氧化損傷保護(hù)作用(0.908)和乙酰膽堿酯酶抑制活性(0.800)之間的相關(guān)系數(shù)均在0.8以上，表明存在極強(qiáng)相關(guān)性。相比之下，總黃酮含量與抗氧化活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性之間的相關(guān)系數(shù)多為0.4～0.6，顯示中等程度相關(guān)。

表2 芍藥果莢發(fā)酵前后的活性成分含量與抗氧化活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性之間的相關(guān)性

2.6 扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵后成分變化

通過(guò)體外抗氧化活性、蛋白質(zhì)氧化損傷保護(hù)作用和乙酰膽堿酯酶抑制活性結(jié)果顯示，扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵液可顯著提高芍藥果莢的生物活性。因此，進(jìn)一步對(duì)SF-F和N-F按照極性從小到大依次進(jìn)行分級(jí)萃取，并對(duì)萃取物進(jìn)行總抗氧化活性及總還原能力測(cè)定，如圖4所示。結(jié)果表明，抗氧化活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯層和正丁醇萃取層，且扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵后，兩個(gè)萃取層的活性均顯著提高。因此，進(jìn)一步利用LC-MS分析比較乙酸乙酯萃取層和正丁醇萃取層的活性成分變化。

(a)總抗氧化活性；(b)總還原能力。N-F(unfermented)為未發(fā)酵產(chǎn)物；SF-F(Saccharomycopsis fibuligera fermentation product)為扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵產(chǎn)物。* 表示SF-F、N-F相應(yīng)萃取層相比，具有顯著性差異(P<0.05)。圖4 扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵前后產(chǎn)物分級(jí)萃取后萃取級(jí)分的抗氧化活性Figure 4 Antioxidant activities of extraction stages of P. lactiflora Pall. pods before and after fermentation

如表3所示， N-F乙酸乙酯層主要有6個(gè)峰，其中沒(méi)食子酸、槲皮素和1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰-β-D -葡萄糖是主要活性成分，超過(guò)總量的85%；正丁醇層主要有10個(gè)峰，其中沒(méi)食子酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素是主要組成部分，超過(guò)總量的84%(表4)。而扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵液(SF-F)乙酸乙酯層和正丁醇層只有4個(gè)峰，主要成分均為沒(méi)食子酸，是總量的94%以上，比發(fā)酵前分別提高了175.02%(乙酸乙酯層)、204.62%(正丁醇層)。

表3 芍藥果莢扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵前后乙酸乙酯萃取物的成分變化

表4 芍藥果莢扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵前后正丁醇萃取物的成分變化

結(jié)合前期生物活性結(jié)果，推測(cè)芍藥果莢中的最主要生物活性物質(zhì)是沒(méi)食子酸，且經(jīng)扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵后沒(méi)食子酸含量顯著提高，這可能就是SF-F的生物活性顯著高于N-F的原因。此外，推測(cè)扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵過(guò)程中，一些大分子物質(zhì)如1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰-β-D-葡萄糖、2″-O-沒(méi)食子?；鸾z桃苷等被分解，轉(zhuǎn)化為小分子的沒(méi)食子酸。

2.7 分子對(duì)接模擬

分子對(duì)接可以通過(guò)研究分子間相互作用從而預(yù)測(cè)分子間的結(jié)合能力。分子對(duì)接親和力常數(shù)越小，配體與受體蛋白質(zhì)結(jié)合更穩(wěn)定，表明該藥物成分與關(guān)鍵蛋白質(zhì)具有強(qiáng)結(jié)合力。分子對(duì)接模擬為活性蛋白酶與化合物的相互作用方式給予一定的解釋，為進(jìn)一步研究小分子藥物奠定理論基礎(chǔ)。研究基于分子對(duì)接模擬對(duì)芍藥果莢活性成分的體內(nèi)抗氧化、抗衰老潛在活性進(jìn)行預(yù)測(cè)。將LC-MS分析得到的15種芍藥果莢活性物質(zhì)與4種抗氧化、抗衰老關(guān)鍵蛋白(過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽合成酶、SIRT 1、酪氨酸酶)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果如表5所示。芍藥果莢相關(guān)活性成分均對(duì)4種關(guān)鍵蛋白酶有一定的對(duì)接親和作用，其中以1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰-β-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、2″-O-沒(méi)食子?；鸾z桃苷等活性物質(zhì)的分子對(duì)接親和力均較高，表明芍藥果莢存在潛在的體內(nèi)抗氧化、抗衰老活性。

表5 芍藥果莢活性成分與抗氧化、抗衰老相關(guān)蛋白酶的分子對(duì)接

3 討論

微生物發(fā)酵技術(shù)可以改變中藥原有的性質(zhì)，從而提高療效，減少毒副作用，擴(kuò)大適應(yīng)證。芍藥種子富含多種酚類、萜類等物質(zhì)[17,22]，為尋找有效提高活性物質(zhì)提取率的微生物，選取釀酒酵母、扣囊復(fù)膜酵母、BY4741型釀酒酵母等3種酵母菌對(duì)芍藥果莢進(jìn)行發(fā)酵。釀酒酵母作為生物技術(shù)行業(yè)最常見(jiàn)酵母，應(yīng)用廣泛[23]；扣囊復(fù)膜酵母廣泛存在于各種酒曲中，具有高糖化力、高蛋白酶活性和酯生產(chǎn)能力[24]，同時(shí)用于植物成分提取[12]；BY4741型釀酒酵母則多與萜類化合物的合成相關(guān)[25]。研究以抗氧化活性變化來(lái)衡量并篩選發(fā)酵后活性最佳的酵母菌，并進(jìn)一步分析其發(fā)酵前后的化學(xué)成分變化。由圖1～3可知，扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵芍藥果莢后，抗氧化活性提升最顯著，發(fā)酵性能最佳。

多酚類物質(zhì)和黃酮類化合物是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，分布廣泛，其含量在一定程度上能反映植物的各項(xiàng)特性和特征[26]。周英彪等[27]利用釀酒酵母、醋酸桿菌、乳酸桿菌對(duì)荔枝酵素進(jìn)行發(fā)酵，并利用HPLC檢測(cè)發(fā)酵前后酚類物質(zhì)的變化，結(jié)果表明，荔枝果汁經(jīng)混菌優(yōu)化工藝發(fā)酵后，荔枝酵素的總酚含量是荔枝果汁的1.54倍，果汁檢出的14種酚類化合物中13種，經(jīng)發(fā)酵后均被完全轉(zhuǎn)化成其他酚類物質(zhì)。施敏等[28]利用短刺小克銀漢霉發(fā)酵將芍藥苷轉(zhuǎn)化為芍藥內(nèi)酯苷，且轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)43.00%±2.73%。芍藥果莢經(jīng)酵母發(fā)酵后，總酚、總黃酮含量和抗氧化活性都有所提高，其中扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵產(chǎn)物活性最高，這與李冰等[12]的結(jié)果基本一致。LC-MS分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵后，芍藥果莢中1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰-β-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷等大分子轉(zhuǎn)化為小分子沒(méi)食子酸；芍藥籽餅粕經(jīng)扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵后白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇[17]，推測(cè)扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵可能起到類似單寧酶作用[29]。

芍藥果莢為芍藥生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，目前作為垃圾被丟棄。研究首次揭示了酵母發(fā)酵對(duì)芍藥果莢成分和生物活性的影響，并利用LC-MS、分子對(duì)接分析確定了主要活性成分。研究結(jié)果表明，芍藥果莢經(jīng)扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵后，總酚含量、抗氧化活性及乙酰膽堿酯酶抑制作用均較發(fā)酵前顯著提高。LC-MS分析表明，經(jīng)扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵后，芍藥果莢中1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰-β-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、2″-O-沒(méi)食子?；鸾z桃苷等大分子物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為小分子沒(méi)食子酸，使發(fā)酵后的果莢中沒(méi)食子酸含量顯著提高。沒(méi)食子酸可以利用Nrf2通路介導(dǎo)MDA活性下降，SOD、CAT活性上升從而改善小鼠氧化應(yīng)激[30]，是一個(gè)很好的抗氧化劑。扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵可使芍藥果莢成為生產(chǎn)沒(méi)食子酸的天然資源，簡(jiǎn)便且易得，以廢變寶，降低生產(chǎn)成本。同時(shí)分子對(duì)接結(jié)果預(yù)測(cè)到芍藥果莢含有體內(nèi)抗氧化、抗衰老活性物質(zhì)，而扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵后芍藥果莢活性物質(zhì)種類減少對(duì)生物活性的影響及芍藥果莢扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵物的體內(nèi)生物活性有待進(jìn)一步研究。