曹 健， 劉沙玉， 王地廣， 柳志強

(海南大學 生命科學學院， ?？?570228)

橡膠樹是一種高大的喬木樹種，發(fā)源于亞馬遜熱帶森林，是天然橡膠重要來源[1]。橡膠炭疽病是橡膠樹一種重要的葉部病害，可直接導致橡膠產(chǎn)量銳減[2]。橡膠炭疽病主要是由膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioids)所引發(fā)的，常引起葉片枯黃、掉葉和嫩梢回枯等癥狀，造成嚴重的經(jīng)濟損失。橡膠炭疽病在全球范圍內(nèi)的感染面積每年都在擴大，造成橡膠產(chǎn)量急劇下滑[3]。目前，國內(nèi)外對膠孢炭疽菌的研究主要針對生物學特性和化學防治等方面，有關(guān)該病菌致病基因功能，以及菌體與宿主之間的相互作用機制等方面的報道很少，極大地限制了相關(guān)防治技術(shù)的發(fā)展。

轉(zhuǎn)錄因子又稱為反式作用因子，能夠與順式作用元件互作，確保目標基因在特定的時間和空間上準確表達[4]。鋅指蛋白家族是最廣泛地存在于原核及真核生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子家族，其結(jié)構(gòu)域通過Cys和His的殘基再加上處于游離態(tài)的鋅離子共同結(jié)合而成，在基因表達的調(diào)控中起著重要作用[5]。根據(jù)Cys和His殘基在數(shù)量大小和空間位置分布的差異，可將其鋅指蛋白分為C2H2型、C4型和C6型3種[6]。對真菌而言，C6型鋅指蛋白是一類特異的轉(zhuǎn)錄因子，通常會含有GAL4結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)控真菌生長、發(fā)育及致病等多個方面。如在釀酒酵母中，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通過調(diào)節(jié)C6型轉(zhuǎn)錄因子Crz1p影響鈣依賴性基因表達的變化[7]；在球孢白僵菌中，2個C6型轉(zhuǎn)錄因子Bbstr1和Bbstr2與氮源的利用相關(guān)，同時參與氧化應激反應和分生孢子的生長[8]；在小麥鐮刀菌中，EBR1的缺失造成孢子的萌發(fā)速度變快、萌發(fā)率降低，產(chǎn)孢量大量減少與致病力減弱[9]；在粗糙脈孢菌中，轉(zhuǎn)錄因子vad-5對孢子發(fā)育有促進作用[10]；在稻瘟病菌中，轉(zhuǎn)錄因子MoCRZI參與鈣離子調(diào)節(jié)、分生孢子發(fā)育、細胞壁完整性及致病性[11]；在蝗綠僵菌中，轉(zhuǎn)錄因子MaRcp缺失后該菌在正常培養(yǎng)條件下產(chǎn)孢方式發(fā)生了轉(zhuǎn)換，即由正常產(chǎn)孢轉(zhuǎn)換為微循環(huán)產(chǎn)孢[12]。

在前期研究中，我們從膠孢炭疽菌中鑒定了1個C6型轉(zhuǎn)錄因子Cgctf1，目前還未有關(guān)該轉(zhuǎn)錄因子生物學功能的研究。研究利用同源重組的方法對該轉(zhuǎn)錄因子基因進行敲除，通過表型分析探究其生物學功能，為深入認識膠孢炭疽菌致病的分子機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

菌株：膠孢炭疽菌野生型菌株WT、大腸桿菌感受態(tài)DH5α；質(zhì)粒：pMD18-T、pCB1532和pUC18載體；限制性內(nèi)切酶、連接酶及相關(guān)試劑盒等購于寶日醫(yī)公司。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

CM培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基，MM培養(yǎng)基，Czapek培養(yǎng)基[13]。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及序列分析

采用CTAB法獲得膠孢炭疽菌基因組[14]。采用試劑盒提取菌株WT中的總RNA并合成cDNA。參照GenBank中膠孢炭疽菌基因組(參考基因ID：CGGC5_v011271)設計引物Cgctf1F和Cgctf1R(表1)。以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，送測序公司進行測序。

表1 引物名稱及序列

Cgctf1的蛋白結(jié)構(gòu)域利用SMART(http:∥smart.embl.de/)進行在線分析；利用NCBI中BLASTp工具對Cgctf1蛋白進行序列比對，運用MEGA7.0軟件中的鄰近相接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 基因敲除與驗證

基因敲除采用同源重組的方法，原理見圖1。利用引物Cgctf1upF/Cgctf1upR和Cgctf1downF/Cgctf1downR(表1)分別對Cgctf1基因的上、下游序列進行擴增，連接到pCB1532上，得到敲除載體pKno-Cgctf1。利用PstI酶切對載體進行線性化，然后轉(zhuǎn)入WT制備的原生質(zhì)體中。原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化過程參照文獻[15]。利用添加氯嘧磺隆的培養(yǎng)基進行篩選，提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，利用引物(Cgctf1F+Cgctf1R、Cgctf1UU+PI、Cgctf1DD+PI1)進行PCR驗證。經(jīng)電泳檢測，Cgctf1F+CgctfR不能擴增得到ORF框，而Cgctf1UU+PI、Cgctf1DD+PI1均能擴增出片段的轉(zhuǎn)化子，即為敲除突變體。

圖1 Cgctf1基因的敲除原理Figure 1 Gene knockout mechanism of Cgctf1

利用引物Cgctf1hbF和Cgctf1hbR擴增Cgctf1基因的互補片段，與含潮霉素抗性基因的質(zhì)粒pUC18相連接，構(gòu)建互補載體pComp-Cgctf1。將互補載體轉(zhuǎn)化到以△Cgctf1制備的原生質(zhì)體中，在含有潮霉素的培養(yǎng)基中篩選抗性轉(zhuǎn)化子，利用引物Cgctf1F+Cgctf1R進行PCR驗證。能夠擴增出Cgctf1完整的ORF框的抗性轉(zhuǎn)化子，即為互補株。

1.2.3 敲除突變體表型分析

(1)營養(yǎng)生長及脅迫因子敏感性分析。將野生型、突變體和互補株接種于CM、MM、PDA和Czapek的平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察各菌株的生長情況。將上述菌株接種到添加有H2O2(20 mmol/L)、NaCl(0.8 mol/L)、SDS(0.01%)、KCl(1 mol/L)的MM平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，以接種MM培養(yǎng)基的菌株作為對照，觀察并記錄菌落直徑，試驗設置3個重復，并計算抑制率：

抑制率=(對照組菌落直徑-實驗組菌落直徑)/

(對照組菌落直徑-5 mm)×100%。

(2)孢子大小、孢子萌發(fā)率、產(chǎn)孢量和附著胞形成率測定。菌株活化后，接種于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，取1 mL濾液7 000 r/min離心8 min，棄上清液，添加1 mL無菌水重懸孢子，重復上述操作3次得到孢子懸液，利用血球計數(shù)板統(tǒng)計分生孢子的數(shù)量。將懸浮液的濃度調(diào)整為5×105mL-1，取25 μL分生孢子懸液(5.0×105mL-1)滴在載玻片上，28 ℃培養(yǎng)，分別于4、8和12 h觀察分生孢子萌發(fā)及附著胞形成情況。每組處理設置3個重復。

(3)洋蔥表皮侵染實驗。取10 μL孢子懸液(2.0×103mL-1)滴加在洋蔥內(nèi)表皮上，28 ℃保濕培養(yǎng)，于8、12 h觀察附著胞侵入和生長情況，每組處理設3個重復。

(4)玻璃紙實驗。取20 μL孢子懸液(5.0×105mL-1)滴于已經(jīng)鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2、3 d后揭開玻璃紙，再培養(yǎng)1 d后觀察結(jié)果，每組處理設3個重復。

(5)致病性分析。選取無傷的橡膠葉片，用酒精擦拭消毒。無菌針頭微創(chuàng)2 mm傷口，采用菌餅及分生孢子懸液(1.0×106mL-1)兩種方式，分別接種在橡膠葉片傷口位置，對照組(CK)分別為PDA瓊脂塊(菌餅方式)和無菌水(孢子懸液方式)。將葉片置于保鮮盒內(nèi)28 ℃保濕培養(yǎng)，5 d后觀察橡膠葉片的發(fā)病情況，每組試驗設置3個重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cgctf1基因生物信息學分析

利用PCR獲得Cgctf1基因(GenBank登錄號：MZ759779)的ORF序列，該基因共編碼405個氨基酸，含有1個GAL4域 [圖2(a)]，屬于C6型鋅指蛋白。利用MEGA7.0以鄰近相接法構(gòu)建Cgctf1系統(tǒng)進化樹 [圖2(b)]。Cgctf1蛋白與熱帶炭疽菌(C.tropicale)的同源蛋白相似度在99%以上，與大麗輪枝菌同源蛋白的相似度為62.96%。與稻瘟病菌和釀酒酵母同源蛋白相似度僅為44.44%和44.90%。

(a)Cgctf1蛋白結(jié)構(gòu)域分析，GAL4代表GAL4結(jié)構(gòu)域；(b)Cgctf1系統(tǒng)進化樹，標尺表示進化距離。圖2 Cgctf1蛋白結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進化分析Figure 2 Protein domain and phylogenetic analysis of Cgctf1

2.2 Cgctf1基因敲除與驗證

將敲除載體pKno-Cgctf1線性化后導入WT的原生質(zhì)體中。經(jīng)初步篩選和驗證，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子10號和43號能夠在Cgctf1UU+PI、Cgctf1DD+PI1為引物時擴增出目標片段，而Cgctf1F+Cgctf1R為引物時，無法擴增出目的片段(圖3)。最終確定第10和43號轉(zhuǎn)化子為敲除突變體，命名為△Cgctf1-10和△Cgctf1-43。

(a)引物Cgctf1F+Cgctf1R上的擴增結(jié)果；(b)引物Cgctf1UU+PI上的擴增結(jié)果；(c)引物Cgctf1DD+PI1上的擴增結(jié)果。M:Marker 2000 bp; 1:WT; 2:△Cgctf1-10; 3:△Cgctf1-43; 4:△Cgctf1/ctf1。圖3 Cgctf1基因敲除及互補驗證Figure 3 Cgctf1 gene knockout and complementary verification

將互補載體pComp-Cgctf1轉(zhuǎn)化到△Cgctf1- 43制備的原生質(zhì)體中，利用潮霉素做抗性標記，初步篩選得到30個轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過驗證發(fā)現(xiàn)8號轉(zhuǎn)化子可以擴增出Cgctf1基因的目的片段，確定為互補轉(zhuǎn)化子，并命名為△Cgctf1/ctf1。

2.3 營養(yǎng)生長及脅迫因子敏感性分析

將野生型、突變體和互補株接種在PDA、MM、Czapek以及CM平板上，在28 ℃培養(yǎng)7 d，隨后觀察其生長狀況?！鰿gctf1-10和△Cgctf1-43在4種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、菌絲生長速率同野生型相比無明顯差異。將各菌株接種到含不同脅迫因子的MM培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除突變體對NaCl和KCl的耐受能力減弱，抑制率略高于野生型；相較于野生型，△Cgctf1對SDS和H2O2的抗性有一定程度增強，抑制率低于野生型(圖4)。

(a)菌株在不同脅迫因子條件下的抑制程度比較；(b)生長抑制率顯著性分析統(tǒng)計(差異顯著水平P<0.05)。圖4 脅迫因子對野生型、突變體和互補株生長的影響Figure 4 Influence of stress factors on wild type,mutant,complementary strains

2.4 Cgctf1參與調(diào)控分生孢子產(chǎn)生、萌發(fā)及附著胞形成

利用血球計數(shù)板統(tǒng)計各菌株的分生孢子產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)△Cgctf1的孢子產(chǎn)量明顯低于WT[圖5(a)]。野生型的孢子產(chǎn)量約為△Cgctf1孢子產(chǎn)量的3.65倍，說明Cgctf1參與調(diào)控分生孢子的產(chǎn)生。野生型分生孢子呈短棒狀，大部分芽管較短，而△Cgctf1的分生孢子形態(tài)相對較大，接種4 h后，孢子萌發(fā)率為41%，附著胞形成率約為萌發(fā)率的一半，12 h后，孢子萌發(fā)率達到73%，附著胞形成率為41%。野生型在4 h時孢子萌發(fā)率就已經(jīng)達到了90%水平，附著胞形成率也在85%以上 [圖5(b)～(d)]。由此可見，Cgctf1與分生孢子萌發(fā)以及附著胞的形成有關(guān)。

(a)分生孢子產(chǎn)量統(tǒng)計；(b)孢子萌發(fā)率統(tǒng)計；(c)附著胞形成率統(tǒng)計；(d)分生孢子萌發(fā)及附著胞形成。co:分生孢子；gt:芽管；ap:附著胞。標尺：20 μm；差異顯著水平P<0.05。圖5 分生孢子產(chǎn)量，萌發(fā)及附著胞的形成Figure 5 Conidia production,germination and appressoriumformation

2.5 Cgctf1參與調(diào)控分生孢子的侵入能力

將各菌株的分生孢子懸液接種到洋蔥表皮上，8 h后，野生型已經(jīng)形成了明顯的附著胞并且分化出侵染結(jié)構(gòu)，12 h后侵染菌絲進一步擴大；突變株△Cgctf1分生孢子在8 h后萌發(fā)出芽管和附著胞，12 h后附著胞開始分化出侵染結(jié)構(gòu)。相比WT，△Cgctf1在形成侵染結(jié)構(gòu)時間上有所滯后(圖6)。

co：分生孢子；gt：芽管；ap：附著胞；ih：侵染菌絲。標尺：20 μm。圖6 洋蔥表皮侵染實驗Figure 6 Infection tests on onion epidermis

進一步測試分生孢子在玻璃紙上的穿透能力，突變株△Cgctf1在培養(yǎng)2 d時不能穿透玻璃紙，而野生型菌株已經(jīng)穿透玻璃紙并形成菌落；培養(yǎng)3 d時，△Cgctf1能夠穿透玻璃紙，但形成的菌落明顯小于野生型?？梢钥闯觯珻gctf1參與調(diào)控分生孢子的侵入能力(圖7)。

(a)菌株穿透玻璃紙形成的菌落大小比較；(b)菌落直徑統(tǒng)計(差異顯著水平P<0.05)。圖7 玻璃紙穿透實驗Figure 7 Cellophane penetration tests

2.6 致病性分析

將野生型、△Cgctf1與△Cgctf1/ctf1的菌餅和分生孢子懸液分別接種到離體橡膠葉片上，培養(yǎng)5 d后觀察致病效果(圖8)。無論是接種菌餅還是孢子懸液，△Cgctf1所形成的病斑直徑均小于野生型菌株，致病力下降。因此，Cgctf1參與調(diào)控膠孢炭疽菌的致病性。

(a)菌餅接種橡膠葉片試驗；(b)菌餅接種試驗病斑大小統(tǒng)計；(c)孢子懸液接種橡膠葉片試驗；(d)孢子懸液接種試驗病斑大小統(tǒng)計。差異顯著水平P <0.05。圖8 致病性試驗Figure 8 Pathogenicity tests

3 討論與結(jié)論

研究從膠孢炭疽菌中鑒定了1個C6型轉(zhuǎn)錄因子Cgctf1，系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子的同源蛋白在其他真菌中普遍存在，但其生物學功能在其他病原真菌中還未有報道。研究成功獲得了Cgctf1基因的敲除突變體，表型分析發(fā)現(xiàn)，Cgctf1的缺失并不影響膠孢炭疽菌的營養(yǎng)生長，但在NaCl、KCl、SDS、H2O2等脅迫因子的影響下，突變體生長與野生型相比表現(xiàn)出一定的差異，說明Cgctf1的敲除在一定程度上影響該病菌對高滲脅迫的響應及氧化應激反應。Cgctf1參與調(diào)控膠孢炭疽菌分生孢子的產(chǎn)生，其敲除突變體的分生孢子產(chǎn)量明顯低于野生型；另外，從孢子萌發(fā)率及附著胞形成率來看，突變體分生孢子的活力與野生型相比明顯降低。Cgctf1的敲除也造成了該病菌致病力的減弱，我們推測突變體分生孢子活力及侵入能力的減弱，可能是造成其致病力下降的主要原因。

目前有關(guān)膠孢炭疽菌轉(zhuǎn)錄因子功能的研究相對較少，已報道的轉(zhuǎn)錄因子如下：C2H2型轉(zhuǎn)錄因子CgAzf1參與調(diào)控膠孢炭疽菌分生孢子產(chǎn)生、萌發(fā)、附著胞的形成、黑色素合成以及致病性等[16]；Cgglt1參與調(diào)控附著胞形成，且與黑色素分泌相關(guān)[17]；bHLH型轉(zhuǎn)錄因子CgbHLH6與該病菌產(chǎn)孢能力、分生孢子形態(tài)、菌絲生長和抗氧化能力有關(guān)[18]；bZIP型轉(zhuǎn)錄因子CgHapX是調(diào)控生物體內(nèi)鐵離子代謝的關(guān)鍵因子，該基因的缺失直接導致菌絲生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率及附著胞形成率顯著下降[19]。在其他真菌中，C6型轉(zhuǎn)錄因子在參與調(diào)控生長發(fā)育及致病過程中發(fā)揮著不同的作用。在煙曲霉中，C6型轉(zhuǎn)錄因子LeuB參與調(diào)控亮氨酸生物合成和鐵的獲取[20]；在大麗輪枝菌中，VdFTF1 參與調(diào)控細胞壁降解酶相關(guān)基因的表達，進而影響其致病性[21]；在稻瘟病菌中，C6型轉(zhuǎn)錄因子PIG1參與黑色素的生物合成[22]；蕓薹生鏈格孢菌中，C6型轉(zhuǎn)錄因子AB04837參與調(diào)控營養(yǎng)生長，分生孢子發(fā)育，脅迫響應及致病性等[23]。由此可見，C6型轉(zhuǎn)錄因子的功能并不保守，此類轉(zhuǎn)錄因子在進化過程中功能不斷分化，參與調(diào)控不同的生長發(fā)育過程。

綜上所述，Cgctf1是膠孢炭疽菌一個新的C6型轉(zhuǎn)錄因子，其敲除突變體表現(xiàn)為對鹽脅迫較為敏感，對H2O2和SDS的抗性增強，分生孢子產(chǎn)量減少，孢子萌發(fā)率和附著胞形成率明顯降低，致病力減弱。因此，Cgctf1參與調(diào)控膠孢炭疽菌分生孢子產(chǎn)生及萌發(fā)，附著胞形成及侵入，脅迫響應及致病性等。