張 濃，李 娟，向建國 ，潘望城

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.常德大北農(nóng)飼料有限公司，湖南 常德 415400)

棘胸蛙(Quasipaa spinosa)主要分布于中國東南部山區(qū)和越南北部地區(qū)[1]，是中國重要的藥食同源動物[2-3]，其營養(yǎng)價值高，被美譽為“百蛙之王”。近年來，由于棲息地的人為破壞、除草劑等農(nóng)藥的廣泛使用及過度捕捉，棘胸蛙野生資源不斷減少，現(xiàn)已被國際自然保護聯(lián)盟(IUCN)和中國紅色名錄列為易危物種[4-5]。人工養(yǎng)殖是保護棘胸蛙資源的有效措施之一[6]，棘胸蛙雄性個體的經(jīng)濟性能優(yōu)于雌性，實現(xiàn)棘胸蛙的全雄養(yǎng)殖前景廣闊。

兩棲動物的性別由基因決定，但也受溫度和外源性激素等因素的影響[7-10]。溫度的作用一般表現(xiàn)為高溫誘導兩棲動物后代性比向雄性偏移，而低溫則會導致后代雌性化[7-8]。外源性類固醇激素也會影響兩棲動物的性別比率[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)：投喂含有17α-甲基睪酮的飼料會顯著提高棘胸蛙蝌蚪后代的雄性率，但也會導致棘胸蛙生長受抑制，死亡率和畸形率顯著上升[11]。因此，尋找一種高效、安全的雄性誘導方法具有重要意義。

芳香化酶是一種類固醇合成酶，可以催化雄性激素轉化為雌性激素，而芳香化酶抑制劑通過抑制其活性，可以直接調節(jié)兩棲動物的內源性類固醇激素水平，誘導后代性別比向雄性偏移，甚至可以完全雄性化，具有比外源性激素更好的調節(jié)效果[12-13]。來曲唑作為第3 代芳香化酶抑制劑，具有對芳香化酶更高的選擇性和抑制潛力[14]，但其在兩棲動物中的相關研究較少[15]。本試驗以棘胸蛙為研究對象，通過投喂含有不同來曲唑含量的飼料，研究來曲唑對其生長、性比及性激素(雌二醇和睪酮)水平的影響，以期為棘胸蛙全雄育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用棘胸蛙蝌蚪均來自湖南省常德市正興農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司巖蛙繁養(yǎng)基地，由同一批次受精卵孵化而來。

1.2 試驗設計及樣品采集

參照沈志剛[16]的研究方法，將來曲唑(購自上海賢鼎生物科技有限公司)用無水乙醇溶解后，與黑斑蛙人工飼料(寧波天邦股份有限公司，粗蛋白含量≥38.0%、粗脂肪含量≥3.3%、粗纖維含量≤4.0%、粗灰分含量≤18.0%、水分≤4.0%、總磷含量≥1.0%、賴氨酸含量≥1.9%)拌勻，分別配制成20、100、400 和1 000 mg/kg 的藥餌；對照組加入等量無水乙醇。4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

養(yǎng)殖試驗水溫(19±1) ℃，微流水養(yǎng)殖。將剛脫膜開口后的15 000 尾蝌蚪(平均每尾0.11 g)隨機分成5 組，每組3 個重復，每個重復1 000 尾，養(yǎng)殖于1 個養(yǎng)殖池 (3.0 m×3.0 m×0.2 m) 中，共15 個養(yǎng)殖池。5 個組分別投喂對照和不同來曲唑含量的飼料，分別記為CK、L20、L100、L400和L1000組，投喂周期為90 d，之后各組投喂正常飼料至變態(tài)完成。

在蝌蚪孵化后20、30、40、50、60 和70 d時，從各組隨機取6 尾大小一致、體質量相近(±0.1 g)的蝌蚪置于液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。蝌蚪變態(tài)完成后從各組中隨機取30 尾以上幼蛙備用。

1.3 變態(tài)幼蛙生長指標及性別比例的測定

隨機從各組中取幼蛙20 只(雌雄各10 只)進行生長指標的測定。幼蛙在解剖前用吸水紙吸干體表水分，使用電子天平稱其體質量，使用游標卡尺測量體長、頭長、頭寬、前臂及手長和后肢全長；解剖后參照圖1 鑒定性別，計算性比；分離肝臟后稱其質量，計算肝體比。

圖1 棘胸蛙變態(tài)完成時精巢 (左) 和卵巢 (右) 的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of testis (left) and ovary (right) of Quasipaa spinosa at the completion of the metamorphosis

1.4 棘胸蛙蝌蚪雌二醇和睪酮水平的測定

由于棘胸蛙蝌蚪提取血液較難，故采用全組織勻漿進行激素水平的測定。每個時期取6 尾蝌蚪，每尾為1 個樣本，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定棘胸蛙蝌蚪全組織勻漿中的雌二醇(E2)和睪酮(T)含量。E2和T 酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，按使用說明書進行性激素水平的測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS 25.0 進行雙因素方差(two-way ANOVA)分析，當方差分析差異顯著(P＜0.05)時，通過Duncan氏法對生長指標和性激素水平數(shù)據(jù)進行多重比較；采用卡方(χ2)檢驗對性別比例進行差異顯著性分析。試驗數(shù)據(jù)均采用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 來曲唑對棘胸蛙幼蛙生長的影響

由表1 可知：添加不同來曲唑含量的飼料飼養(yǎng)后，雌雄幼蛙的體長、頭長、頭寬、前臂及手長、后肢全長和肝體比等生長指標與CK 組相比均無顯著差異，說明來曲唑對棘胸蛙幼蛙的生長無影響。

表1 來曲唑對棘胸蛙幼蛙生長指標的影響Tab.1 Effects of letrozole on the growth indicators of young Quasipaa spinosa

2.2 來曲唑對棘胸蛙幼蛙性比的影響

由表2 可知：CK 組雄性率較低，為33.33%，顯著低于4 個來曲唑含量添加的飼料組，但不同來曲唑含量飼料組之間無顯著差異。

表2 來曲唑對棘胸蛙幼蛙性比的影響Tab.2 Effects of letrozole on the sex ratios of young Q.spinosa

2.3 來曲唑對棘胸蛙蝌蚪性激素水平的影響

由圖2 可知：與對照組相比，不同來曲唑含量處理組的雌二醇(E2)和睪酮(T)水平均顯著上升，但各來曲唑含量處理組之間無顯著差異。由圖3 可知：從原始性腺到出現(xiàn)精巢分化期間(20～50 日齡)，來曲唑添加組的E2水平與CK 組相比均顯著性上升，且增幅與來曲唑含量之間無明顯關聯(lián)；到60 日齡時，來曲唑添加組的E2水平下降至與CK 組無顯著差異；到70 日齡時，L20和L100組的E2水平與CK 組無顯著差異，但L400組和L1000組的E2水平顯著低于CK 組。此外，從原始性腺到性腺分化結束期間(20～70 日齡)，除60 日齡的L200和L1000組外，其余各時期、各來曲唑添加組的T 水平均與CK 組有顯著差異；30 日齡(卵巢分化前)時，各來曲唑添加組的T 水平顯著低于CK 組，其余各時期、各來曲唑添加組的T 水平均顯著高于CK 組，但T 水平的變化程度與來曲唑含量無關。

圖2 不同處理棘胸蛙蝌蚪的雌二醇(E2)和睪酮(T)水平Fig.2 Estradiol (E2) and testosterone (T) levels of Q.spinosa in different groups

圖3 來曲唑對不同日齡棘胸蛙蝌蚪雌二醇(E2)和睪酮(T) 水平的影響Fig.3 Effects of letrozole on the estradiol (E2) and testosterone (T) levels of Q.spinosa at different day age

3 討論

3.1 來曲唑對棘胸蛙幼蛙性別比例和生長指標的影響

芳香化酶抑制劑通過抑制雄性激素轉化為雌性激素，能夠使物種后代性別比例向雄性偏移。本研究投喂含有不同來曲唑含量的飼料均可顯著提高棘胸蛙幼蛙的雄性率，且各來曲唑處理組變態(tài)后代的生長指標與CK 組均無顯著差異，說明來曲唑在提高雄性率的同時不影響棘胸蛙變態(tài)幼蛙的生長。

棘胸蛙蝌蚪高溫偏向雄性，低溫趨向雌性[17]。本試驗條件下[(19±1) ℃]，棘胸蛙偏向雌性發(fā)育，導致CK 組雄性率較低(33.33%)。雖然來曲唑飼料能夠顯著提高棘胸蛙蝌蚪后代的雄性率，但與其他兩棲動物相比，來曲唑對棘胸蛙雄性率的提升效果有限。OLMSTEAD 等[12]研究發(fā)現(xiàn)：法倔唑可以使非洲爪蟾后代出現(xiàn)100%雄性；同樣地，福美斯坦也可以誘導普通跳蛙蝌蚪后代出現(xiàn)全部雄性[18]；投喂0.1 和1.0 mg/g 的來曲唑飼料可分別使虎紋蛙蝌蚪后代雄性率顯著提高至83.6%和92.4% (對照組雄性率54.9%)，且雄性率隨來曲唑含量的增加而增加[15]，但本研究中，不同來曲唑含量之間的雄性率無顯著差異。來曲唑不會影響兩棲類物種的生長[15]，但可提高棘胸蛙蝌蚪后代的雄性比例。因此，在未來棘胸蛙單性育種研究中，來曲唑誘導仍然是使棘胸蛙雄性化的重要方法。

3.2 來曲唑對棘胸蛙蝌蚪性激素水平的影響

性激素對兩棲類性別分化具有重要作用，但影響機制尚不清楚。本研究中，20～70 日齡期間，棘胸蛙E2和T 水平都發(fā)生顯著變化，其中，卵巢分化前期(20～30 日齡) E2水平顯著上升，精巢分化期間(40～50 日齡) T 水平顯著上升，說明E2和T 都對棘胸蛙的性別分化產(chǎn)生了影響，但二者之間與性別的關系尚不清楚。

對非洲爪蟾[12]的研究表明：蝌蚪持續(xù)(受精后到變態(tài)完成)暴露于1～64 μg/L 法倔唑后，兩性幼蛙血清中E2和T 質量濃度與對照組相比均無顯著差異。對魚類的研究發(fā)現(xiàn)：投喂含有芳香化酶抑制劑的飼料可顯著降低魚類血清E2水平[13]。來曲唑能夠直接抑制芳香化酶活性，減緩雄性激素向雌性激素轉化的速率，但同時芳香化酶抑制劑也會使物種發(fā)生代償反應，通過代償性上調芳香化酶基因表達和蛋白質翻譯、增加其他參與類固醇激素合成基因的表達，使物種E2水平上升[19-20]。在本研究中，70 日齡時L400和L1000組的E2水平顯著降低，而T 水平在大多數(shù)情況下都顯著升高，說明來曲唑對棘胸蛙性激素水平產(chǎn)生了直接作用，但由于代償作用，20～50 日齡期間不同來曲唑處理組E2水平較對照組上升。40～50 日齡期間，不同來曲唑處理組的T 水平顯著高于對照組，這與棘胸蛙在46 日齡開始精巢分化(另文發(fā)表)以及來曲唑能提高蝌蚪雄性率相符；同時，由于各來曲唑處理組間的T 水平差異不顯著，導致各來曲唑處理組的雄性率差異也不顯著。

4 結論

養(yǎng)殖水溫為(19±1) ℃時，投喂添加不同來曲唑含量的飼料，不會影響棘胸蛙幼蛙的生長；通過顯著提高棘胸蛙蝌蚪體內的睪酮水平，能夠顯著提高其后代雄性率，但與來曲唑的含量無關。未來可以搭配適當高溫以及其他雄性化激素作進一步研究，以挖掘來曲唑在棘胸蛙全雄育種研究中的潛力。