李 穎，何依依，孫俊薇，張治萍，梅馨月，王海寧，劉屹湘，李作森

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院；云南 昆明 650201)

間作是指同一田地上于同一生長期內(nèi)分行或分帶相間種植2 種或2 種以上作物的種植方式[1]，與單一種植模式相比，具有提高土地利用率、改善作物—病原物的生態(tài)平衡、控制病蟲害暴發(fā)并獲得更多有效養(yǎng)分等優(yōu)勢[2]。間作能有效抵御植物病害，植株形成天然的通風(fēng)道，可有效降低田間空氣濕度，增加田間透氣性，阻擋病源菌的相互傳播和交叉?zhèn)魅?，減輕病害發(fā)生[3-4]。研究表明：間作不但能有效控制氣傳病害發(fā)生，對生產(chǎn)中難以防治的土傳病害也有很好的防控效果，如辣椒‖玉米可抑制辣椒疫病[5]，大蒜‖煙草可顯著防治煙草黑脛病[6]，小麥‖蠶豆可有效防控小麥銹病的發(fā)生[7]。

引起辣椒疫病的辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)是一種廣泛傳播并具有毀滅性危害的土傳病原菌，許多研究表明：辣椒與其他作物間作是防控辣椒病害最普遍且最具經(jīng)濟(jì)效益的措施[8]。玉米‖辣椒系統(tǒng)中，玉米形成的“根墻”可限制辣椒疫霉菌跨行傳播[5]；韭菜‖辣椒系統(tǒng)中，韭菜根系分泌物能顯著抑制辣椒疫霉菌的侵染[9]，表明地下部分形成的“根墻”和根系分泌物是抑制疫霉菌傳播的關(guān)鍵因素。茴香可以有效抑制由真菌、細(xì)菌、線蟲和卵菌等引起的土傳病害[10-12]。生產(chǎn)上可以利用茴香與煙草合理輪作或間作控制煙草黑脛病的發(fā)生和危害，茴香根系分泌物能夠干擾煙草疫霉菌的侵染并抑制其菌絲生長[13]。另有研究顯示：蠶豆‖小麥可減輕由對羥基苯甲酸引起的自毒效應(yīng)，提高蠶豆根系中 POD 和SOD活性，有效降低蠶豆枯萎病發(fā)生[14]。

病情指數(shù)和病害發(fā)生率常被用于評估植物群體的發(fā)病程度和危害程度，但病害發(fā)生率只代表發(fā)病普遍率，不能反映發(fā)病程度；病情指數(shù)雖代表了發(fā)病程度，但病情指數(shù)相同時(shí)，病株率可能相差很大[15]。TRINDER 等[16]通過建立符合邏輯增長的Logistic 模型獲得初始增長率、漸近最大值、最大瞬時(shí)生長速率和達(dá)到目標(biāo)的時(shí)間等4 個(gè)建模參數(shù)對植物動(dòng)態(tài)生長過程進(jìn)行評估。WEI等[17]通過該模型研究了施氮量對三七皂苷含量、生物量、養(yǎng)分吸收和根系構(gòu)型的影響以及這些參數(shù)間的關(guān)系；ZHANG 等[18]利用Logistic 模型量化施肥和地膜覆蓋引起的種間競爭動(dòng)態(tài)規(guī)律。本研究使用Logistics 模型分析單作和間作對辣椒疫病的影響，通過10 次病害調(diào)查測定2 種種植模式下作物的生物量、根系形態(tài)和酶活性，明確不同種植模式下辣椒疫病的病害發(fā)生率和病情指數(shù)變化情況，以獲得預(yù)防辣椒疫病的最佳時(shí)機(jī)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和地點(diǎn)

供試?yán)苯访缳徸岳ッ魇袝x寧區(qū)育苗基地，茴香種子購自昆明市盤龍區(qū)茨壩農(nóng)貿(mào)市場，茴香和辣椒種植地位于云南省昆明市尋甸回族彝族自治縣云南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代教育基地(N25°20′，E102°41′，海拔2 369.9 m)。

1.2 供試菌株

辣椒疫霉菌菌株#501 由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性控制病害教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2021 年5—9 月選擇未種植過辣椒且未暴發(fā)過辣椒疫病的地塊進(jìn)行小區(qū)試驗(yàn)。試驗(yàn)小區(qū)長5.25 m、寬3.00 m，小區(qū)與小區(qū)間的過道寬40 cm，每個(gè)重復(fù)27 個(gè)小區(qū)，4 個(gè)重復(fù)共計(jì)108 個(gè)小區(qū)。種植方式為辣椒單作、茴香單作和辣椒間作茴香，其中，茴香單作僅用于測定干質(zhì)量和根冠比，其種植模式與辣椒單作一致。單作和間作種植模式的示意圖見圖1。

圖1 單作(a)和間作(b)種植模式的小區(qū)示意圖Fig.1 Planting patterns of monoculture (a) and intercropping (b) plot

1.3.2 供試植株種植

茴香于2021 年5 月10 日播種，生長至6 月5 日；育苗盤育苗約45 d 移栽辣椒苗，于2021年6 月5 日完成移栽，進(jìn)行后期田間管理，觀察田間作物的生長情況，及時(shí)處理缺苗和多苗。

1.3.3 供試菌株培養(yǎng)

供試培養(yǎng)基：V8 培養(yǎng)基。制備方法：取V8果汁150 mL、CaCO31.5 g 和瓊脂粉 20 g，加入ddH2O 定容至1 L；121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，待溫度降至60 ℃后倒入90 mm 塑料培養(yǎng)皿中，每皿15 mL，冷卻后保存?zhèn)溆谩?/p>

菌株培養(yǎng)：將辣椒疫霉菌菌株活化至制備好的V8 培養(yǎng)基平板上，于25 ℃光暗交替培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，備用；將活化的V8 固體培養(yǎng)基疫霉菌平板用5 mm 打孔器沿菌落邊緣打孔轉(zhuǎn)接至新的V8 固體培養(yǎng)基平板上，于25 ℃光暗交替培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～13 d，備用。

1.3.4 辣椒疫霉菌接種

于2022 年7 月24 日采用莖基部傷口貼菌餅法接種辣椒疫霉菌，接種辣椒條帶的中心4 株辣椒，后觀察辣椒疫病發(fā)病及擴(kuò)散情況。

1.3.5 病害調(diào)查方法及分級標(biāo)準(zhǔn)

接種病原菌5～7 d，接種株開始發(fā)病；于接種病原菌13 d 后開始對病害進(jìn)行調(diào)查，每隔3 d調(diào)查1 次，共調(diào)查10 次，并按癥狀對病情進(jìn)行分級。分級標(biāo)準(zhǔn)為：0 級，全株無??；1 級，1/5 以下側(cè)枝發(fā)病，或莖基部出現(xiàn)水漬狀病斑；2 級，1/5～1/2 側(cè)枝發(fā)病，或莖基部出現(xiàn)腐爛病斑，但植株不萎蔫；3 級，1/2～3/4 側(cè)枝發(fā)病，或莖基部有腐爛病斑，植株有可恢復(fù)的萎蔫現(xiàn)象；4 級：全株 3/4 以上側(cè)枝發(fā)病，部分枝條枯死，或植株呈不可恢復(fù)的萎蔫現(xiàn)象；5 級，全株枯死。利用病害發(fā)生率和病情指數(shù)對病情進(jìn)行評價(jià)，計(jì)算公式為：病害發(fā)生率=病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)×100%；病情指數(shù)=100×∑(各級病情級別植株數(shù)×各級病情級別代表值)/(調(diào)查總植株數(shù)×最高病情級別代表值)。統(tǒng)計(jì)植株發(fā)病率和病情指數(shù)時(shí)除去接種的中心株[19]。

1.3.6 辣椒和茴香生物量的測定

于2021 年9 月4 日對每個(gè)小區(qū)間作行位置的辣椒和茴香進(jìn)行取樣，每個(gè)小區(qū)取48 株辣椒和60 株茴香。取樣時(shí)將整株植株從地里取出，洗凈后把地上部及地下部分開，于105 ℃殺菌1 h，置于60 ℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，稱量干質(zhì)量。

1.3.7 辣椒根系的形態(tài)指標(biāo)及酶活性測定

病原菌接種第7 天后采集辣椒根系，放入自封袋內(nèi)做好標(biāo)記，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(1) 根系形態(tài)指標(biāo)測定。將辣椒根系置于盛有適量水的亞克力盒中，鋪開后使用根系掃描儀(Epson Perfection V750 Pro) 進(jìn)行掃描，得到的圖片經(jīng)WinRHIZO 軟件處理得到根總長、根直徑、根表面積和根體積等指標(biāo)數(shù)據(jù)。

(2) 根系酶活性測定。將辣椒根系放入滅菌的研缽中用液氮進(jìn)行研磨，稱量根系粉末0.1 g置于無酶離心管中，分別加入超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)試劑盒中的提取液，于振蕩機(jī)上混勻，放入離心機(jī)于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液于新的無酶離心管中待測。根據(jù)試劑盒說明書對待測液進(jìn)行處理，然后放入酶標(biāo)儀中測定不同波長(SOD：450 nm；POD：470 nm；CAT：510 nm)下各溶液的吸光光度值，并參考試劑盒說明書計(jì)算酶活性。SOD、POD 和CAT 試劑盒均購自蘇州格銳思生物科技有限公司。

1.3.8 Logistic 模型對辣椒疫病發(fā)病率和病情指數(shù)的評估

邏輯增長曲線可以評估植物從出生到死亡的動(dòng)態(tài)變化，故運(yùn)用邏輯增長曲線評估辣椒疫病的發(fā)病率和病情指數(shù)，分析辣椒疫病在單作和間作2 種種植模式下發(fā)生的規(guī)律。分別整理辣椒單作和辣椒間作茴香10 次調(diào)查時(shí)間的病害發(fā)生率和病情指數(shù)數(shù)據(jù)，使用最小二乘法將數(shù)據(jù)擬合到Logistic 方程中[16,20]，使用OriginPro8 軟件的統(tǒng)計(jì)程序Slogistic1 得到病害發(fā)生率和病情指數(shù)增長曲線、瞬時(shí)增長速率以及病害傳播時(shí)期的最大病害發(fā)生率和最大病情指數(shù)(a)、初始增長率(K)、最大瞬時(shí)生長速率(Imax)和達(dá)到目標(biāo)的時(shí)間(t50)等4 個(gè)參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Excel 2016 和SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組處理間的方差分析運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種植模式對辣椒和茴香生長的影響

由表1 可知：辣椒‖茴香可提高茴香生物量，其中間作模式的地上干質(zhì)量顯著高于單作模式；單作模式的茴香根冠比與間作模式相近；單作模式的辣椒地上干質(zhì)量高于間作模式，但地下干質(zhì)量和根冠比低于間作模式。說明間作模式可促進(jìn)茴香生長和辣椒根系發(fā)育。此外，辣椒‖茴香模式的土地當(dāng)量比為2.16 (大于1)，說明辣椒‖茴香比單作效率高，間作增產(chǎn)率為116%。

表1 不同種植模式辣椒和茴香的生物量和根冠比Tab.1 Biomass and root shoot ratio of pepper and fennel with different planting patterns

2.2 不同種植模式下辣椒的根際形態(tài)

由圖2 可知：不同種植模式下辣椒根系有顯著差異，辣椒‖茴香有利于辣椒根系形態(tài)生長。辣椒‖茴香模式下，辣椒的根長和根表面積極顯著大于辣椒單作，根直徑和根體積顯著大于辣椒單作。

圖2 不同種植模式下單株辣椒的根系指標(biāo)Fig.2 Root indexes of per pepper plant with different planting patterns

2.3 不同種植模式下辣椒根系的酶活性

由表2 可知：辣椒單作根系的POD 活性大于辣椒‖茴香模式，但兩者無顯著差異；辣椒單作根系的SOD 和CAT 活性極顯著低于辣椒‖茴香模式。說明辣椒‖茴香可顯著提高辣椒根系SOD和CAT 活性。

表2 不同種植模式辣椒根系的酶活性Tab.2 Enzyme activity of pepper root system with different planting patterns U/g

2.4 不同種植模式對辣椒疫病病害發(fā)生率和病情指數(shù)的影響

2.4.1 辣椒疫病發(fā)病率和病情指數(shù)

由圖3 可知：與辣椒單作相比，辣椒‖茴香可降低辣椒疫病病害發(fā)生率和病情指數(shù)。接菌13 d后，辣椒單作的病害發(fā)生率為36.1%、病情指數(shù)為30.6，間作模式的病害發(fā)生率為3.4%、病情指數(shù)為2.6；接菌40 d 后，辣椒單作的病害發(fā)生率為100.0%、病情指數(shù)為99.3，間作模式的病害發(fā)生率為31.4%、病情指數(shù)為26.2。從辣椒疫病開始侵染至侵染后期，間作模式顯著降低了辣椒疫病的病害發(fā)生率和病情指數(shù)。

圖3 不同種植模式辣椒疫病病害發(fā)生率和病情指數(shù)Fig.3 Incidence and disease index of Phytophthora capsici under different planting patterns

2.4.2 不同種植模式辣椒疫病病害發(fā)生率和病情指數(shù)的Logistic 模型

由圖4 和表3 可知：Logistic 模型對不同種植模式下辣椒病害發(fā)生率的擬合良好(0.943≤R2≤0.967，P＜0.05)。2 種種植模式下辣椒疫病病害發(fā)生率的初始增長速率(K)無顯著差異，且間作模式的K值小于辣椒單作；間作可顯著降低辣椒疫病的最大病害發(fā)生率(a)，并顯著推遲達(dá)到辣椒疫病病害最大增長速率的時(shí)間(t50)；間作還可顯著降低病害發(fā)生率的最大瞬時(shí)增長速率(Imax)。此外，Logistic 模型對不同種植模式下辣椒疫病病情指數(shù)的擬合良好(0.961≤R2≤0.980，P＜0.05)。2 種種植模式下辣椒疫病病情指數(shù)的K值無顯著差異，且間作模式的K值小低于辣椒單作；間作可顯著降低辣椒疫病的最大病情指數(shù)(a)和病情指數(shù)的Imax值，并推遲達(dá)到辣椒疫病病情指數(shù)最大增長速率的時(shí)間(t50)。

圖4 不同種植模式辣椒疫病病害發(fā)生率和病情指數(shù)的瞬時(shí)增長速率Fig.4 Instantaneous increase rates of P.capsici and disease index under different planting patterns

表3 辣椒疫霉菌病害發(fā)生率和病情指數(shù)的Logistic 生長曲線估算參數(shù)Tab.3 Estimated parameters of disease incidence and disease index of Phytophthora capsici by Logistic growth curve

3 討論

間作中植物根系互作可以有效控制土壤病原菌傳播，控制病害流行[21]。大量研究發(fā)現(xiàn)：低稈作物辣椒與高稈作物玉米間作時(shí)，不但能有效降低葉部病害的發(fā)生，還能有效控制辣椒疫病的傳播和擴(kuò)展[22]。茴香作為具備強(qiáng)化感作用的蔬菜，常被用于與其他作物間、套作控制田間病蟲害。孟玉芳等[23]研究發(fā)現(xiàn)：茴香根系分泌物對煙草疫霉菌的孢子有很強(qiáng)的吸引作用甚至能使其孢子裂解。本研究提出以茴香為低稈作物與高稈作物辣椒間作對辣椒疫病進(jìn)行防控，并對不同種植模式中辣椒疫病的發(fā)生動(dòng)態(tài)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明辣椒‖茴香具備提高產(chǎn)量的優(yōu)勢，同時(shí)能夠有效控制辣椒疫病的發(fā)生和危害。本研究中，辣椒‖茴香的土地當(dāng)量比大于1，能夠促進(jìn)茴香地上部和地下部生長，說明辣椒‖茴香能夠高效利用資源促進(jìn)茴香的生長以提高土地當(dāng)量比，這可能是茴香種子先于辣椒播種，茴香根系前期充分吸收土壤中的營養(yǎng)，與后移栽的辣椒競爭具備優(yōu)勢。李隆等[24-25]曾提出種間間作體系中物種通過競爭恢復(fù)過程實(shí)現(xiàn)最終高體系生產(chǎn)力，例如玉米‖小麥體系中，小麥先播種并在共生期具備競爭優(yōu)勢，而玉米雖然共生期生長受限，但能夠在小麥?zhǔn)斋@后快速恢復(fù)生長，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)體系生產(chǎn)力優(yōu)勢。這種競爭—恢復(fù)模式可能是辣椒‖茴香具備產(chǎn)量優(yōu)勢的重要原因。

物種根系互作促進(jìn)營養(yǎng)吸收并調(diào)控根系微生態(tài)是間作能夠增加產(chǎn)量和控制土傳病害的重要原因[26]。本研究中，間作辣椒的根長、根表面積、根體積和根直徑均顯著高于單作辣椒，同時(shí)根冠比也高于單作，說明間作辣椒在茴香提前播種具備競爭優(yōu)勢的情況下增加了碳水化合物對根系的分配，擴(kuò)大根系分布，增強(qiáng)養(yǎng)分和水分吸收能力。這種變化有助于增強(qiáng)辣椒在種間互作中的競爭能力，這可能是辣椒‖茴香中辣椒具備競爭優(yōu)勢的同時(shí)仍能保持產(chǎn)量不下降的重要原因。已有研究表明：間作體系中作物的根系形態(tài)與其競爭能力密切相關(guān)，如小麥‖玉米中，間作小麥根系分布和密度顯著高于單作，可幫助其在共生期競爭中獲得優(yōu)勢，而玉米的生長則受到抑制[25]。蠶豆‖玉米中，蠶豆因提前播種而在共生期具備競爭優(yōu)勢，玉米雖在生長初期受到限制，但更高的根長和密度在后期幫助玉米恢復(fù)到了單作水平[27]。因此，植物根系生長狀況可以增強(qiáng)作物在間作系統(tǒng)的競爭力，有助于增加產(chǎn)量。

本研究發(fā)現(xiàn)：間作不僅能促進(jìn)辣椒根系生長，還能顯著提高辣椒根系的SOD 和CAT 活性。POD、SOD 和CAT 是植物中重要的保護(hù)酶，酶活性增強(qiáng)可以提高植物對活性氧的耐受能力，進(jìn)而幫助植物抵御病害，降低病情指數(shù)[28]。由此可見，間作辣椒根系具備更強(qiáng)的抗氧化能力，有利于辣椒更好地抵御辣椒疫病。玉米與大豆、馬鈴薯間作也能顯著增強(qiáng)葉片的POD、SOD和CAT 活性，提高玉米的抗病能力，有效控制玉米銹病的發(fā)生和蔓延[29]。董艷等[30]研究表明：小麥‖蠶豆模式中，蠶豆根系的POD、SOD 和CAT均具有較高活性，提高了蠶豆自身生理抗性和抗病能力，減輕了蠶豆枯萎病的發(fā)生。由此可見，間作能夠通過提高植物組織生理生化反應(yīng)，降低病原菌及有害物質(zhì)對植株的傷害，抑制病原菌對植株的侵染。

已有研究基于生物量和產(chǎn)量數(shù)據(jù)擬合Logistic 曲線評估植物的動(dòng)態(tài)生長過程[16-17]。本研究通過Logistic 曲線評估2 種種植模式的辣椒疫病發(fā)病率和病情指數(shù)，結(jié)果表明：間作可以降低發(fā)病率和病情指數(shù)的最大值和最大瞬時(shí)增長速率，推遲達(dá)到該最大增長速率的時(shí)間。這一結(jié)果說明辣椒‖茴香對辣椒疫病跨行傳播的抑制主要是通過降低病害的增長速率和推遲病害發(fā)生高峰期的時(shí)間，也進(jìn)一步驗(yàn)證了間作模式下酶活性增加可提高對辣椒疫病的抗性。孟飛等[31]通過聚類分析對24 份玉米品種頂腐病進(jìn)行評估，比較準(zhǔn)確地確定了品種的抗病程度。然而，該方法對于遺傳距離較大的作物抗病程度評估較為困難。Logistic 模型常用于評估植物的生長動(dòng)態(tài)，而病害發(fā)生動(dòng)態(tài)的不穩(wěn)定性比生長動(dòng)態(tài)更強(qiáng)，且受環(huán)境因素影響較大，因此，Logistic 模型擬合病害發(fā)生瞬時(shí)增長速率曲線的精確度受到了一定的影響，后期研究將通過增加樣本量提高擬合曲線的精確度。

4 結(jié)論

辣椒‖茴香可通過促進(jìn)茴香生長以增加體系生產(chǎn)力，其中間作辣椒的根長、根表面積、根直徑和根體積明顯增加可能是間作辣椒保證產(chǎn)量不受抑制的重要原因。間作可通過降低辣椒疫病最大增長速率、推遲病害高峰期時(shí)間以降低辣椒疫病的危害；此外，間作可以提高辣椒根系的SOD 和CAT 活性，這可能也是間作控制辣椒疫病的重要作用機(jī)制。