楊石有，張 蕊，孔 瓊，蒲金基，袁盛勇*，張 賀*

（1.紅河學院生物科學與農(nóng)學學院云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室，云南蒙自 661199；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，?？?571101）

酰胺類殺菌劑是一類化學結構中含有酰胺結構的殺菌劑，在殺菌劑市場中占有相當重要的地位[1]。從1966年第一個酰胺類殺菌劑萎銹靈被開發(fā)成功至今，酰胺類殺菌劑經(jīng)過近60年的發(fā)展，已經(jīng)有數(shù)十個品種，尤其是近些年通過雜環(huán)及氟原子的引入，不斷出現(xiàn)了一些結構新穎的酰胺類殺菌劑品種。目前，酰胺類殺菌劑已成為年銷售額增長速率最快，最為活躍的殺菌劑品種之一[2-3]。噻呋酰胺是美國孟山都公司開發(fā)的噻唑酰胺類殺菌劑，具有用量少、藥效高、內(nèi)吸傳導性強和持效期長等特點，通過抑制琥珀酸脫氫酶的形成導致菌體死亡，對多種病原菌具有較好的防效，尤其是對紋枯病防效較好[4-6]。環(huán)酰菌胺是由德國拜爾公司于1989年開發(fā)的新型酰胺類內(nèi)吸性殺菌劑，主要抑制病原菌甾醇的生物合成，可用于防治灰霉病[7]。

酰胺類殺菌劑作為殺菌劑的重要類別，在作物病害防治方面發(fā)揮著重要作用。然而，由于我國目前施藥器械多以手動或小型機器為主，藥液霧滴粒徑較大，導致在靶標葉片上的沉積量較少，很大部分藥液發(fā)生飄移而流失到空氣、水體、土壤中，給環(huán)境造成了嚴重的污染[8]。據(jù)調(diào)查，2017年我國手動噴霧器的市場占有率仍達80%[9]，其農(nóng)藥有效沉積率僅為10%~30%[10]。隨著國家重點研發(fā)計劃“化學肥料和農(nóng)藥減施增效綜合技術研發(fā)”項目的實施，農(nóng)藥器械和施藥技術得到快速發(fā)展，尤其是一些高效植保機械如自走式噴桿噴霧機[11]、植保無人飛機[12]、無人駕駛噴霧機器人[9]的發(fā)展，大大提高了我國的農(nóng)藥利用率。據(jù)報道，2020年我國水稻、小麥、玉米三大糧食作物上的農(nóng)藥沉積率為40.6%，比2015年提高4%[13]。雖然我國農(nóng)藥利用率整體得到較大提高，但還是有將近60%的農(nóng)藥未被充分利用而流失到環(huán)境中，對非靶標生物帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

農(nóng)藥對非靶標生物的安全性評價是農(nóng)藥登記的必備材料，也是評價農(nóng)藥環(huán)境安全性的重要依據(jù)，對農(nóng)藥的科學合理使用具有重要的指導作用[14-15]。家蠶、蜜蜂、斑馬魚及蚯蚓是農(nóng)藥環(huán)境安全性評價研究中常用的靶標對象，用于反映農(nóng)藥在空氣、水體、土壤中的暴露情況。目前，關于噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺的研究主要集中在病害防治[4-7]、環(huán)境中的降解行為[4,16-17]等方面，而關于噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對非靶標生物的急性毒性研究還較少，因此有必要開展其對非靶標生物的安全性評價，了解其毒性情況，以期為該藥劑的使用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 供試生物

意大利工蜂（Apis melliifera），購于海南省儋州市那大鎮(zhèn)養(yǎng)蜂場，挑選大小一致、活潑健康的成年工蜂饑餓2 h，用于急性經(jīng)口毒性試驗。

家蠶（Bombyx mori），卵塊購于山東廣通蠶種集團有限公司，品種為‘菁松×皓月’，采用常規(guī)方法催青，于（25±2）℃、相對濕度為70%～85%的恒溫人工氣候箱中飼養(yǎng)。挑選健康活潑、大小一致的2齡蠶供試。

斑馬魚（Brachydanio rerio），購于海南省儋州市那大鎮(zhèn)花鳥市場，體長約為2 cm，于實驗室馴化7 d，挑選健康活潑、大小一致的幼魚進行試驗，試驗前24 h停止喂食。

赤子愛勝蚯蚓（Eisenia foetida）購于天津賈立明蚯蚓養(yǎng)殖中心，于室內(nèi)避光馴養(yǎng)，待出現(xiàn)明顯繁殖環(huán)帶，挑選大小一致健康的成年蚯蚓進行試驗。

1.2 供試藥劑

96%噻呋酰胺原藥，寧波三江益農(nóng)化學有限公司；98%環(huán)酰菌胺原藥，陜西恒潤化學工業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 意大利工蜂急性毒性試驗

參照GB/T 31270.10—2014《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第10部分：蜜蜂急性毒性試驗》[18]，測定急性經(jīng)口毒性。在預試驗的基礎上，用50%的蔗糖水溶液分別將2種藥劑稀釋為5個濃度梯度，其中噻呋酰胺的濃度分別為100、200、300、400和500 mg/L，環(huán)酰菌胺的濃度分別為125、250、500、750和1 000 mg/L。取200 μL藥液分別加入離心管中，稱重后置于蜂籠中，向每個蜂籠中接入事先饑餓2 h的意大利工蜂各10頭，并置于黑布遮蓋的飼養(yǎng)架上，于3 h后取出離心管并稱重，記錄每組藥液的消耗量。之后替換為50%蔗糖水溶液飼養(yǎng)，以不添加藥劑的50%蔗糖水溶液為對照，每處理重復3次。分別于24和48 h觀察記錄意大利工蜂中毒癥狀和死亡數(shù)，計算48 h-LD50值，評價該藥劑對意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性。

1.3.2 家蠶急性毒性試驗

參照GB/T 31270.11—2014《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第11部分：家蠶急性毒性試驗》[19]，采用浸葉法進行測定。在預試驗基礎上，分別設置5個藥劑濃度，其中噻呋酰胺藥劑濃度分別為200、300、400、500和600 mg/L，環(huán)酰菌胺藥劑濃度分別為4 000、5 000、6 000、7 000和8 000 mg/L，向不同藥劑溶液中分別添加50 μL吐溫-80，攪拌混合均勻即為試驗藥劑。將新鮮干凈的桑葉置于各濃度藥液中浸漬10 s，取出晾干后放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿分別接入20頭2齡家蠶，每處理重復3次，以清水和加體積分數(shù)為1%丙酮的水溶液為對照。將各處理置于人工氣候箱內(nèi)在25℃條件下飼養(yǎng)，分別于24、48和96 h觀察家蠶的中毒癥狀及死亡情況，計算96 h-LC50值，評價該藥劑對家蠶的急性毒性。

1.3.3 斑馬魚急性毒性試驗

參照GB/T 31270.12—2014《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第12部分：斑馬魚急性毒性試驗》[20]，采用半靜態(tài)法進行測定。在預試驗的基礎上，用事先經(jīng)過脫氯處理的自來水將噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺母液均稀釋為0.5、1、2、4和6 mg/L 5個濃度，挑選事先經(jīng)過實驗室馴化7 d，健康活潑，長約2 cm大小的幼魚，分別飼養(yǎng)于不同濃度藥液中，以事先脫氯處理并加入相同體積溶劑的自來水為空白對照，每處理重復3次，每重復10條斑馬魚。每隔24 h更換1次藥液，在試驗開始后6 h內(nèi)隨時觀察記錄受試魚的中毒及死亡情況，其后在24、48、72及96 h分別觀察斑馬魚的中毒癥狀及死亡情況，及時清除死魚，計算96 h-LC50值，評價該藥劑對斑馬魚的急性毒性。

1.3.4 赤子愛勝蚯蚓急性毒性試驗

參照GB/T 31270.15—2014《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第15部分：蚯蚓急性毒性試驗》[21]，采用人工土壤接觸法進行測定。在預試驗的基礎上，將人工土與藥液充分混勻后置于通風櫥中蒸發(fā)去除丙酮，使毒土中噻呋酰胺濃度分別為50、100、200、300和500 mg/kg，環(huán)酰菌胺濃度分別為100、200、400、600和800 mg/kg。用蒸餾水將土壤含水量調(diào)至30%，以不含藥劑、含水量30%的人工土為對照，將土樣裝入標本瓶中，挑選大小一致、出現(xiàn)明顯繁殖環(huán)帶的成年蚯蚓放入標本瓶中，每處理重復3次，每重復放入10條蚯蚓。用紗布封口后置于（20±1）℃、相對濕度為80%～85%的人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于7和14 d觀察記錄蚯蚓的中毒及死亡情況，及時清除死亡的蚯蚓，計算14 d-LC50值，評價該藥劑對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析及毒性評價

采用Probit回歸方法計算噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對4種非靶標生物的LC50值和LD50值。毒性評價依據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》[18-22]中的標準，評價藥劑對意大利工蜂、家蠶、斑馬魚、赤子愛勝蚯蚓的毒性等級。

2 結果與分析

2.1 對意大利工蜂的急性毒性

本研究分別測定了噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性，結果發(fā)現(xiàn)藥劑處理后24 h，高濃度處理組意大利工蜂出現(xiàn)輕微中毒癥狀，少量中毒意大利工蜂出現(xiàn)激烈飛行，然后行動逐漸變緩、靜止趴著不動，而低濃度處理組未出現(xiàn)中毒和死亡現(xiàn)象。48 h后，各濃度處理組意大利工蜂均出現(xiàn)了不同程度的中毒癥狀和死亡，中毒癥狀和死亡率與藥劑濃度成正比，中毒意大利工蜂身體出現(xiàn)顫抖、抽搐、蜷縮現(xiàn)象，翅膀呈“一”或“V”字形展開，同時腹部出現(xiàn)發(fā)黑現(xiàn)象，而試驗過程中對照組均未出現(xiàn)死亡。噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對意大利工蜂的48 h急性經(jīng)口毒性LD50值分別為6.51和9.12 μg/蜂（表1）。根據(jù)試驗準則中農(nóng)藥對蜜蜂的毒性等級劃分標準[18]，噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性等級均為中毒。

表1 噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對意大利工蜂的48 h急性毒性

2.2 對家蠶的急性毒性

本研究分別測定了噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對家蠶的急性毒性，結果發(fā)現(xiàn)處理組家蠶經(jīng)浸漬桑葉給藥24 h，家蠶未出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，和對照組相比差異不大。給藥48 h后高濃度組家蠶出現(xiàn)頭部翹起、取食減少，少量家蠶出現(xiàn)吐液、死亡情況，而低濃度處理組與對照組無明顯差異，未出現(xiàn)死亡。給藥96 h后高濃度組家蠶出現(xiàn)吐液、體縮及死亡現(xiàn)象，低濃度處理組家蠶出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，部分家蠶還出現(xiàn)晃頭、扭曲掙扎、假死現(xiàn)象，少量家蠶死亡，而試驗過程中對照組家蠶均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對家蠶的急性毒性96 h-LC50值分別為375.51和5 802.32 mg/L（表2）。根據(jù)試驗準則中農(nóng)藥對家蠶的毒性等級劃分標準[19]，噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對家蠶的急性毒性等級為低毒。

表2 噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對家蠶的急性毒性（96 h）

2.3 對斑馬魚的急性毒性

本研究分別測定了噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對斑馬魚的急性毒性，結果發(fā)現(xiàn)隨著藥劑濃度的增加和染毒時間的延長，斑馬魚的中毒癥狀和死亡率呈逐漸增加趨勢。高濃度藥劑對斑馬魚的影響較大，斑馬魚在接觸藥劑短時間內(nèi)活動出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為快速游動、時而竄動等中毒癥狀，隨后表現(xiàn)為反應遲緩、游速減慢、側翻、鰓部發(fā)紅、魚體發(fā)白、腹部腫大并沉于水底。低濃度處理組斑馬魚中毒癥狀出現(xiàn)緩慢并出現(xiàn)少量死亡，而對照組未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對斑馬魚的急性毒性96 h-LC50值分別為2.95和2.39 mg/L（表3）。根據(jù)試驗準則中農(nóng)藥對魚類的毒性等級劃分標準[20]，噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對斑馬魚的急性毒性等級為中毒。

表3 噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對斑馬魚的急性毒性（96 h）

2.4 對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性

本研究分別測定了噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性，結果發(fā)現(xiàn)空白對照組赤子愛勝蚯蚓活動正常，無死亡現(xiàn)象，藥劑處理組出現(xiàn)不同程度的死亡，死亡率與藥劑濃度和暴露時間呈正相關，低濃度藥劑對赤子愛勝蚯蚓影響不大。赤子愛勝蚯蚓在處理組土壤中暴露7 d后，高濃度處理組中的部分赤子愛勝蚯蚓出現(xiàn)身體潰爛、體液滲出等中毒癥狀，存活的赤子愛勝蚯蚓出現(xiàn)身體縮短變細、活動少、爬行困難、環(huán)帶膨大等中毒癥狀，而低濃度處理組中的赤子愛勝蚯蚓與對照組變化不大。在毒土中暴露14 d后，中毒癥狀逐漸加深，死亡率增加，高濃度處理組中的赤子愛勝蚯蚓出現(xiàn)身體斷裂、潰爛等癥狀，而低濃度處理組中的赤子愛勝蚯蚓出現(xiàn)少量死亡，身體變軟。噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性14 d-LC50值分別為171.73和383.37 mg/kg干土（表4）。根據(jù)試驗準則中農(nóng)藥對蚯蚓的毒性等級劃分標準[21]，噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性等級為低毒。

表4 噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性（14 d）

3 討 論

施藥技術的落后和農(nóng)藥的不合理使用，致使大量農(nóng)藥進入環(huán)境中，對非靶標生物帶來了巨大的風險。開展農(nóng)藥對非靶標生物的安全性評價是農(nóng)藥開發(fā)與應用中必不可少的環(huán)節(jié)，急性毒性試驗操作簡單、快速，可在短時間內(nèi)確定農(nóng)藥對非靶標生物的毒性高低，為慢性毒性試驗和藥劑使用提供依據(jù)和參考。

蜜蜂作為生態(tài)系統(tǒng)中的重要授粉昆蟲，經(jīng)口毒性試驗可模擬田間施藥后蜜蜂覓食受污染花粉的情況，反映污染物對蜜蜂的毒性大小。本研究中發(fā)現(xiàn)噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性等級均為中毒，因此，在藥劑使用時，應盡量避開養(yǎng)蜂區(qū)、開花期或者選擇在無風或微風天氣施藥，避免藥劑飄移對蜜蜂產(chǎn)生毒害。農(nóng)藥除了對蜜蜂會產(chǎn)生直接毒殺作用外，亞致死劑量還會干擾蜜蜂的行為，如覓食、飛行和方向感等。張寶蘭等[22]發(fā)現(xiàn)低濃度阿維菌素會減弱蜜蜂的趨光性，造成蜜蜂的爬行、飛行等運動能力不可逆的損傷。本試驗發(fā)現(xiàn)中毒意大利工蜂出現(xiàn)激烈飛行且無方向感、覓食降低、活動減弱等現(xiàn)象。

家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲，桑葉在生長過程中容易受到周圍農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境和桑園自身防治病蟲害所用農(nóng)藥的污染，導致家蠶急性或慢性中毒事件時有發(fā)生，這桑業(yè)造成一定的損失[23]。本試驗中發(fā)現(xiàn)噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對家蠶的急性經(jīng)口毒性等級均為低毒，說明其對家蠶安全。農(nóng)藥除對家蠶產(chǎn)生直接影響外，低濃度農(nóng)藥還會造成家蠶慢性中毒，影響家蠶的生長發(fā)育、生理代謝和經(jīng)濟性狀，如眠蠶體重、全繭量、繭層量、繭層率、結繭率和化蛹率等[24-25]。本試驗對96 h處理未死亡的家蠶換為健康桑葉繼續(xù)飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)家蠶結繭率、化蛹率、繭層量等指標均低于空白對照，說明噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺會引起家蠶中毒，在藥劑使用時應當注意施藥濃度、次數(shù)、安全間隔期等，避免慢性毒性的產(chǎn)生。

魚類種群是水生生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，斑馬魚是開展農(nóng)藥對魚類急性毒性和慢性毒性試驗的重要生物材料，可以反映農(nóng)藥進入水體的風險程度。本試驗中發(fā)現(xiàn)噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對斑馬魚的急性毒性等級均為中毒，這與沈艷、楊陽等[26-27]研究結果一致，二者均發(fā)現(xiàn)噻呋酰胺對斑馬魚的急性毒性為中毒。因此，在藥劑配制時應盡量避開河道或溝渠，同時藥劑施用時應盡量遠離水源，嚴禁將使用完的農(nóng)藥包裝品丟棄至河道或溝渠。相同的農(nóng)藥有效成分，不同的劑型種類對斑馬魚的毒性存在差異，24%噻呋酰胺懸浮劑對斑馬魚的急性毒性為低毒，而本試驗中發(fā)現(xiàn)96%噻呋酰胺原藥對斑馬魚的急性毒性為中毒。張國福等[28]發(fā)現(xiàn)不同劑型苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯及其原藥對斑馬魚的急性毒性存在差異，毒性從高到低依次為原藥、懸浮種衣劑、懸浮劑、水分散粒劑，說明經(jīng)過劑型加工后可以降低藥劑對斑馬魚的毒性，故在噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺的劑型加工過程中可適當考慮向水分散粒劑或其他緩釋性劑型方向發(fā)展。

蚯蚓作為土壤中的主要非靶標動物，對土壤富集營養(yǎng)和有機物、無機物的分解有著極其重要的作用[29]。蚯蚓對環(huán)境變化較為敏感，常作為模式生物用于土壤污染監(jiān)測[30]。農(nóng)藥是土壤污染物的重要來源，蚯蚓可通過皮膚直接接觸或取食土壤中受污染的食物而接觸農(nóng)藥，從而引起蚯蚓死亡或影響其生長。蚯蚓急性毒性的測定方法主要有濾紙接觸法、人工土壤法、飼喂法、注射法、浸入法、點滴法、強迫攝食法和自然土壤法等，人工土壤法為開展化學品對蚯蚓急性毒性試驗的標準方法[31]。本研究發(fā)現(xiàn)噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性等級為低毒，14 d-LC50值分別為171.73和383.37 mg/kg干土，遠高于國標標準（低毒14 d-LC50值＞10 mg/kg干土）。施海燕等[32]測定了噻呋酰胺在南京黃棕壤、東北黑土、江西紅壤中的降解，其半衰期分別為9.4、17.8和20.1 d；許振嵐等[33]測定了環(huán)酰菌胺在紅壤和水稻土中的降解，其半衰期分別為0.63和5.06 d。以上結果表明2種藥劑均為易降解藥劑，在土壤中的殘存期短，對蚯蚓的安全性較好。

開展農(nóng)藥對非靶標生物的急性毒性試驗可在較快時間內(nèi)獲得農(nóng)藥對非靶標生物的安全性數(shù)據(jù)，對農(nóng)藥的環(huán)境安全性評價和藥劑使用具有重要的指導作用。有關2種藥劑對4種非靶標生物的慢性毒性還未知，本團隊將在接下來的研究中繼續(xù)開展慢性毒性試驗，以期為2種藥劑的使用提供數(shù)據(jù)支撐。