徐建強(qiáng)，張 勇，楊 嵐，平忠良，李佳婷， 夏彥飛，鄭 偉，林曉民

(1.河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南洛陽 471003; 2.安徽省農(nóng)科院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，安徽合肥 230031)

近年來，由禾谷絲核菌AG-D融合群引起的小麥紋枯病(wheat sharp eyespot)在中國小麥種植區(qū)普遍發(fā)生，已成為僅次于條銹病和赤霉病的主要病害[1-2]。由于目前生產(chǎn)中尚無對紋枯病高抗或免疫的小麥品種[3]，控制該病主要依靠三唑酮、苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇等藥劑，但已出現(xiàn)對這些藥劑的敏感性表現(xiàn)下降的菌株，生產(chǎn)中需篩選防治該病的替換藥劑[4-5]。琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHIs)屬于酰胺類殺菌劑的一類，近年來，SDHIs類殺菌劑新品迭出，且新品上市后需求量增長迅速，引起了國內(nèi)外廣泛關(guān)注[6]。SDHIs類殺菌劑中的氟酰胺對小麥紋枯病菌有很好的抑制活性[7]；而噻呋酰胺則對水稻紋枯病的防效明顯[8-9]。在中國農(nóng)藥信息網(wǎng)有關(guān)噻呋酰胺登記用于水稻的信息有130條[10]。有研究結(jié)果[11-13]表明噻呋酰胺對小麥紋枯病菌也有很強(qiáng)的抑制活性；任學(xué)祥等[14]研究發(fā)現(xiàn)，噻呋酰胺包衣對小麥紋枯病的防效可達(dá)90%左右，顯著高于同等劑量的其他藥劑，且對小麥安全。然而，在中國農(nóng)藥信息網(wǎng)有關(guān)噻呋酰胺登記用于小麥的信息只有4條[10]，并且尚無噻呋酰胺對河南省小麥紋枯病菌抑制活性的系統(tǒng)報(bào)道。因此，本研究采用菌絲生長速率法測定噻呋酰胺對2016年從河南省15個地市分離的98株病菌菌絲生長的抑制活性，以期為噻呋酰胺在河南省小麥紋枯病綜合防控中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與藥劑

從2016年分離自河南省15個地市的228株病菌中，每地市隨機(jī)選取3～12株，共98株菌株用于試驗(yàn)。97%噻呋酰胺(thifluzamide)原藥由江蘇省鎮(zhèn)江農(nóng)藥廠生產(chǎn)；97%苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)原藥由先正達(dá)(中國)投資有限公司生產(chǎn)；97%戊唑醇(tebuconazole)原藥由廣西田園生化股份有限公司生產(chǎn)；62.5%井岡霉素(jinggangmycin)原藥由浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司生產(chǎn)；97.6%甲基立枯磷(tolclofos-methyl)原藥由江蘇省東海農(nóng)藥廠生產(chǎn)。井岡霉素預(yù)溶于滅菌超純水，其他殺菌劑預(yù)溶于丙酮或甲醇，均配成10 mg·mL-1母液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

用菌絲生長速率法測定紋枯病菌對不同藥劑的敏感性。在平板培養(yǎng)基中添加不同濃度的藥劑作為處理組，其中，噻呋酰胺的質(zhì)量濃度為0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1 μg·mL-1，苯醚甲環(huán)唑的質(zhì)量濃度為0.025、0.05、0.1、0.5、2.5和5 μg·mL-1，戊唑醇的質(zhì)量濃度為0.003、0.005、0.01、0.03、0.05和0.1 μg·mL-1，井岡霉素的質(zhì)量濃度為0.15、0.2、0.25、0.35、0.5和1 μg·mL-1，甲基立枯磷的質(zhì)量濃度為0.035、0.065、0.1、0.2、0.3和0.5 μg·mL-1；以不含藥劑的PSA平板培養(yǎng)基為對照，25 ℃培養(yǎng)5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，并計(jì)算藥劑對菌絲生長的抑制率。菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑平均值-處理菌落直徑平均值)/(對照菌落直徑平均值-菌餅直徑)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

在得到抑制率的基礎(chǔ)上，采用Excel 2007和DPS 6.55軟件的“數(shù)量型數(shù)據(jù)機(jī)值分析”模塊計(jì)算藥劑抑制菌絲生長的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和有效中質(zhì)量濃度(EC50值)，并進(jìn)行EC50值的正態(tài)性分布檢驗(yàn)，以正態(tài)性分布的EC50值的平均值作為病菌對噻呋酰胺的敏感性基線[5]。采用DPS 6.5軟件的LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)；采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行聚類分析[5]；參照徐建強(qiáng)等[15]的方法分析噻呋酰胺與其他殺菌劑對紋枯病菌毒力間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥紋枯病菌對噻呋酰胺的敏感基線

菌絲生長速率測定結(jié)果顯示，隨著噻呋酰胺質(zhì)量濃度的增加，其對病菌的抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到1μg·mL-1時，對所有供試菌株的抑制率均已達(dá)到90%以上，對個別菌株的抑制率達(dá)到100%，說明噻呋酰胺對小麥紋枯病菌有很強(qiáng)的抑制作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，供試病菌對噻呋酰胺的EC50值為0.009～0.405 μg·mL-1，且EC50最大值是最小值的44.47倍，平均值為0.070±0.061 μg·mL-1，EC50值的分布整體呈連續(xù)性分布(圖1-A)。Shapiro-Wilk結(jié)果顯示，菌株對藥劑的敏感性(即EC50值)分布不符合正態(tài)分布(W=0.740，P=0.000<0.05)，說明小麥紋枯病菌群體中存在對噻呋酰胺敏感性較低的亞群體；但有75.51%的菌株(74株)位于主峰內(nèi)，呈連續(xù)單峰頻次的近似正態(tài)分布(W=0.968，P=0.054>0.05)，其EC50平均值為0.043±0.019 μg·mL-1(圖1-B)，故將此值作為紋枯病菌對噻呋酰胺的相對敏感基線。

圖1 小麥紋枯病菌對噻呋酰胺的敏感性(A)及敏感性頻率分布(B)

表1 河南省不同地區(qū)小麥紋枯病菌對噻呋酰胺的敏感性Table 1 Sensitivity(EC50 value) of R.cerealis to thifluzamide from different areas in Henan province

變異倍數(shù)為EC50最大值與最小值之比；表中同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示取樣地點(diǎn)間差異顯著(P<0.05)。

Variable ratiois the ratio of maximum to minimum of EC50values of isolates from the same region.Different small letters in the same column indicate significant difference at 0.05 levelfor different sampling sites.

2.2 不同地區(qū)的菌株對噻呋酰胺的敏感性

由表1可知，同一地市內(nèi)的菌株對噻呋酰胺的敏感性差異明顯，其中，差異最大的為取自平頂山市的菌株，其EC50值的變異倍數(shù)達(dá)34.89倍；其次為取自南陽市的菌株，為27.24倍；取自漯河市的菌株差異最小，僅1.78倍；其他地區(qū)菌株為2.13～9.84倍。

而不同地市菌株對噻呋酰胺的敏感性差異不太明顯，噻呋酰胺EC50平均值為0.035～0.155 μg·mL-1，其中，鶴壁市菌株的EC50值為0.035 μg·mL-1，最為敏感，許昌市菌株的EC50值為0.155 μg·mL-1，最不敏感，兩者的EC50值相差4.41倍。方差分析表明，取自鶴壁、漯河、鄭州3市的菌株對噻呋酰胺敏感，但其敏感性與除南陽、許昌2市外其他10個地市菌株的差異均未達(dá)到顯著水平。

2.3 菌株對噻呋酰胺敏感性水平的系統(tǒng)聚類分析

每地市隨機(jī)選取3個菌株，共45株，利用SPSS軟件對噻呋酰胺抑制菌株菌絲生長的EC50值進(jìn)行聚類分析。結(jié)果(圖2)表明，噻呋酰胺對45個菌株的EC50值分在5個聚類組，包含的菌株數(shù)分別為16、16、3、9及1個。各市的菌株均出現(xiàn)在不同的聚類組，說明同一個市的菌株間存在較大差異；除第Ⅴ聚類組外，其他聚類組包含河南省大部分市的菌株，說明不同地區(qū)菌株對噻呋酰胺的敏感性差異不明顯，這與表1中方差分析的結(jié)果一致，進(jìn)一步說明病菌對噻呋酰胺的敏感性差異與菌株來源的地理位置無顯著相關(guān)性。

圖2 抑制小麥紋枯病菌菌絲生長的噻呋酰胺中質(zhì)量濃度(EC50值)的系統(tǒng)聚類分析

2.4 噻呋酰胺和其他藥劑對紋枯病菌毒力間的相關(guān)性分析

噻呋酰胺和苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、甲基立枯磷、井岡霉素4種藥劑對紋枯病菌毒力間的相關(guān)性分析表明，藥劑毒力之間的P值均小于0.05，而戊唑醇和甲基立枯磷的斜率為正，苯醚甲環(huán)唑及井岡霉素的斜率為負(fù)，但其決定系數(shù)(R2)均小于0.8，說明噻呋酰胺和其他4種藥劑對病菌的毒力間無明顯相關(guān)性(圖3)。這意味著生產(chǎn)中噻呋酰胺可以與這些藥劑輪換或交替使用，從而延長藥劑的使用壽命。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，河南省小麥紋枯病菌對噻呋酰胺具有較高的敏感性。同一地市菌株對藥劑敏感性的差異較大，這可能是由菌株本身的生理差異及群體組成的多樣性引起的；但不同地市菌株間對藥劑的敏感性差異不明顯，說明河南省各地區(qū)的用藥水平基本相同。徐建強(qiáng)等[5,15-16]在研究河南省小麥紋枯病菌對苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、井岡霉素、甲基立枯磷、咯菌睛的敏感性時均得到了相同的結(jié)論。盡管有對藥劑敏感性較低的亞群體，但所占比例較低，噻呋酰胺可作為小麥紋枯病化學(xué)防治的備選藥劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

本研究建立的小麥紋枯對噻呋酰胺的相對敏感基線略低于齊永志等[11]以及Zhang等[13]建立的基線，這可能與菌株來源的地理位置不同有關(guān)。齊永志等選用的菌株中有83.7%的菌株取自河北省，僅11.4%的菌株取自河南省鶴壁市[11]；Zhang等所用菌株有89.2%的菌株取自江蘇省，取自河南省商丘市的菌株僅占2.5%[13]。因此，兩者的研究結(jié)果分別能更好地反映河北省和江蘇省小麥紋枯病菌對噻呋酰胺敏感性的現(xiàn)狀。而本研究的菌株全部采自河南省，研究結(jié)果更能全面反映河南省小麥紋枯病菌對噻呋酰胺的敏感性。

圖3 小麥紋枯病菌對噻呋酰胺和其他4種殺菌劑敏感性間的相關(guān)性

齊永志等[11]、Zhang等[13]及Sun等[17]的研究均表明，小麥紋枯病菌對噻呋酰胺的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)屬于中低等。Sun等[17]研究顯示，病菌對噻呋酰胺中等及低等水平的抗藥性分別是由病菌琥珀酸脫氫酶基因RcSdhB、RcSdhC及RcSdhD發(fā)生點(diǎn)突變引起。這表明噻呋酰胺可以連續(xù)用于小麥紋枯病的化學(xué)防治。但為延長藥劑的使用壽命，生產(chǎn)中可將噻呋酰胺與其他藥劑混合或輪換使用。齊永志等[11]的研究表明，噻呋酰胺與戊唑醇、咯菌腈、井岡霉素、三唑酮、丙環(huán)唑及多菌靈之間無交互抗性關(guān)系。本研究對EC50值的回歸分析也表明，噻呋酰胺對紋枯病菌的毒力與苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、甲基立枯磷、井岡霉素4種藥劑間無明顯相關(guān)性，說明在生產(chǎn)中可將噻呋酰胺與這些藥劑輪換或交替使用，從而延長其使用壽命。