黃耀宗，郭清泉，焦文娟，趙甜甜，張友勝*，黃國(guó)滋

（1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州 511400）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）（3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，廣東廣州 510640）

藤茶，又稱莓茶、張家界莓茶、連州白茶、長(zhǎng)壽藤，是一種藥食同源的藤本植物，學(xué)名為顯齒蛇葡萄植物（Ampelopsis grossedentata），廣泛分布于中國(guó)南部山區(qū)及平原地帶。在《飲膳正要》（1330）、《草木便方》（1873）、《廣西植物名錄》（1971）等歷代植物志中及藥用植物名錄中均有記載[1]。藤茶具有止咳、化痰、解痙消炎、預(yù)防上呼吸道感染、抗氧化和清除自由基、防止肝功能退化、預(yù)防酒精性肝損傷、增強(qiáng)免疫力等作用，是一種具有營(yíng)養(yǎng)、保健、藥用功能的類茶植物[2-5]。藤茶既含有豐富的蛋白質(zhì)（11%～15%）、17 種游離氨基酸、17 種礦物質(zhì)以及胡蘿卜素（5.23 mg/100 g）、維生素E（6.32 mg/100 g）等多種營(yíng)養(yǎng)成分，又含有黃酮和多糖兩大類活性成分。藤茶中的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為35%～45%，其中單體黃酮類化合物二氫楊梅素一般為25%～35%，在目前發(fā)現(xiàn)的所有植物中，藤茶所具有的黃酮含量最高，被譽(yù)為“黃酮之王”[6-9]。

藤茶多糖是藤茶中另一主要活性成分。隨著研究的不斷深入，逐漸發(fā)現(xiàn)藤茶多糖具有如免疫調(diào)節(jié)功能、降低致病菌的繁殖速度、抗感染、降血糖、降血脂等多種的生物活性功能[10-13]。

從2013年藤茶被批準(zhǔn)為新資源食品，2015年把“藤茶提取物”收錄進(jìn)化妝品原料目錄中，藤茶多糖被許多企業(yè)作為原料進(jìn)行深加工研發(fā)產(chǎn)品。與其它植物多糖一樣，藤茶多糖不是一種單一的化學(xué)物質(zhì)，而是由各種單糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)等不同的物質(zhì)聚合一起形成的復(fù)合物。羅祖友等[14]對(duì)藤茶多糖中的兩個(gè)純化多糖組分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果表明兩種藤茶多糖組分均含有中性糖（57.6%和46.2%）、糖醛酸（32.3%和45.7%），蛋白質(zhì)（3.5%和4.7%）。由于多糖本身不具備還原性和變旋現(xiàn)象，其含量需要經(jīng)過一定的處理后才能檢測(cè)得出。目前比色法、滴定法、色譜法、高效毛細(xì)管電泳法等都是目前較為常用的多糖含量檢測(cè)方法[15,16]，但時(shí)至今日，許多文獻(xiàn)報(bào)道的各種方法由于單糖留存較多，干擾較大，常常使結(jié)果出現(xiàn)較大的誤差，不同的多糖所適用的檢測(cè)方法也不同，所以尚無統(tǒng)一的多糖測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。鑒于此，本研究選擇目前常用的苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、硫酸-紫外法和二硝基水楊酸（DNS）法等4 種多糖常用檢測(cè)方法，通過光譜掃描，單因素試驗(yàn)、方法學(xué)考察，比較分析四種方法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，旨在確定出最佳的藤茶多糖測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

藤茶原茶，由湖南乾坤生物科技有限公司提供；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；濃硫酸、苯酚、蒽酮、DNS（3,5-二硝基水楊酸），天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；其它所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800 型紫外分光光度計(jì)，日本島津有限公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Milipore 超純水凈化系統(tǒng)，美國(guó)Milipore超純水系統(tǒng)。

1.3 藤茶粗多糖的提取及粗多糖溶液的制備

稱取200 g 藤茶原茶，以1:6 的料液比加入超純水，在100 ℃水浴中提取1 h，過濾，重復(fù)2 次，合并濾液；將濾液置于4 ℃冰箱中過夜，在4 000 r/min條件下離心20 min 去沉淀；取上清液旋轉(zhuǎn)濃縮至原體積的1/2 后重復(fù)4 ℃冰箱靜置過夜，在4 000 r/min 條件下離心20 min 后重新去沉淀。取上清液后加入三倍體積無水乙醇，室溫放置24 h，在4 000 r/min 條件下離心20 min，收集沉淀，冷凍干燥得藤茶粗多糖[7,17]。

取500.0 mg 上述干燥所得藤茶粗多糖加入1 000 mL 蒸餾水中，充分搖勻攪拌溶解，即得濃度為0.5 mg/mL 的藤茶粗多糖溶液。

1.4 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取200 mg 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水定容至20.0 mL，配得10.0 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，放入4 ℃冰箱備用。分別量取0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液置于50 mL 容量瓶中用水稀釋至刻度線，搖勻，即得濃度0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL 和0.5 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 苯酚溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5.0 g 苯酚，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇定容于100 mL 棕色的容量瓶中，混勻即得5wt%苯酚溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.4.3 蒽酮-硫酸溶液的配制

準(zhǔn)確稱取蒽酮50.0 mg置于100 mL棕色的容量瓶中，濃硫酸定容，混合即得0.5 mg/mL 的蒽酮-硫酸溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.4.4 DNS 試劑的配制

準(zhǔn)確稱取DNS 3.15 g，加入500 mL 超純水，水浴至45 ℃后逐步加入100 mL 0.2 g/mL的氫氧化鈉溶液，不斷攪拌直至溶液清澈透明。再加入四水酒石酸鉀鈉91.0 g、苯酚2.50 g 和無水硫酸鈉2.50 g，再加入300 mL 超純水，45 ℃水浴攪拌至完全溶解，室溫冷卻用超純水定容至1 000 mL，混勻后貯于棕色瓶中避光保存7 d。

1.5 四種檢測(cè)方法的比較測(cè)定

1.5.1 苯酚-硫酸法

用移液槍分別吸取“1.3”項(xiàng)下制備的0.5 mL 藤茶粗多糖溶液和“1.4.1”項(xiàng)下制備的0.5 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于2.0 mL 離心管中，室溫下分別加入50 mg/mL 苯酚溶液200～1 000 μL 搖勻，緩慢加入濃硫酸300～700 μL，混合后加水定容至2.0 mL，置于50～90 ℃下水浴顯色5～40 min，冷水浴冷卻，在485.5 nm 下分別測(cè)定吸光值，以獲得最佳的苯酚加入量、濃硫酸加入量、水浴溫度和水浴時(shí)間等實(shí)驗(yàn)參數(shù)。然后通過吸取不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行操作，在485.5 nm 下測(cè)定吸光度，繪制苯酚-硫酸法中使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按標(biāo)準(zhǔn)曲線最后測(cè)定藤茶粗多糖溶液吸光度并計(jì)算其多糖含量[18]。

1.5.2 蒽酮-硫酸法

用移液槍分別吸取“1.3”項(xiàng)下制備的0.5 mL 藤茶粗多糖溶液和“1.4.1”項(xiàng)下制備的0.5 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于2.0 mL 離心管中，冰水浴中加入1.4.3 制備的0.5 mg/mL 蒽酮-硫酸溶液200～600 μL，搖勻，置于60～100 ℃下水浴顯色5～40 min 后迅速置于冰水中冷卻，在620 nm 下分別測(cè)定吸光值，以獲得最佳的蒽酮-硫酸溶液加入量、水浴溫度和水浴時(shí)間等實(shí)驗(yàn)參數(shù)。然后通過吸取不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行操作，在620 nm 下測(cè)定吸光度，繪制蒽酮-硫酸法中使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按標(biāo)準(zhǔn)曲線最后測(cè)定藤茶粗多糖溶液吸光度并計(jì)算其多糖含量[18]。

1.5.3 硫酸-紫外法

用移液槍分別吸取“1.3”項(xiàng)下制備的0.5 mL 藤茶粗多糖溶液和“1.4.1”項(xiàng)下制備的0.5 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于2.0 mL 離心管中，快速加入濃硫酸300～700 μL，置于25～60 ℃下水浴5～40 min，搖勻30 s 后放入冰水沙浴中快速冷卻，加水至2.0 mL，在315 nm 下分別測(cè)定吸光值，以獲得最佳的濃硫酸加入量、水浴溫度和水浴時(shí)間等實(shí)驗(yàn)參數(shù)。然后通過吸取不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行操作，在315 nm 下測(cè)定吸光度，繪制硫酸-紫外法中使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按標(biāo)準(zhǔn)曲線最后測(cè)定藤茶粗多糖溶液吸光度并計(jì)算其多糖含量[19]。

1.5.4 DNS 法

用移液槍分別吸取“1.3”項(xiàng)下制備的0.5 mL 藤茶粗多糖溶液和“1.4.1”項(xiàng)下制備的0.5 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于2.0 mL 離心管中，加入DNS 溶液220～300 μL，混勻，加水至2.0 mL，置于60～100 ℃下水浴顯色3～7 min 后取出，立即用冰水浴快速冷卻至室溫，搖勻后在510 nm 下分別測(cè)定吸光值，以獲得最佳的DNS 溶液加入量、水浴溫度和水浴時(shí)間等實(shí)驗(yàn)參數(shù)。然后通過吸取不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行操作，在510 nm 下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按標(biāo)準(zhǔn)曲線最后測(cè)定藤茶粗多糖溶液吸光度并計(jì)算其多糖含量[20]。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 精密度測(cè)定

取0.5 mL 藤茶粗多糖樣品溶液，分別用“1.5”項(xiàng)四種方法的最佳參數(shù)處理后在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，同一樣品溶液在2 min 內(nèi)連續(xù)測(cè)定6 次吸光度，計(jì)算結(jié)果的RSD 值。

1.6.2 重復(fù)性測(cè)定

稱取1.0 g 藤茶粗多糖5 份，制備成樣品溶液后分別用“1.5”項(xiàng)四種方法的最佳參數(shù)處理后在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算結(jié)果的RSD 值。

1.6.3 加標(biāo)回收率測(cè)定

取5 份已知含量的藤茶多糖樣品溶液，加入一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液后分別用“1.5”項(xiàng)四種方法的最佳參數(shù)處理后在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算結(jié)果的RSD 值。

1.6.4 穩(wěn)定性測(cè)定

取0.5 mL 藤茶粗多糖樣品溶液，分別用“1.3”項(xiàng)四種方法的最佳參數(shù)處理后在最大吸收波長(zhǎng)處每隔20 min 測(cè)定吸光度，共測(cè)定6 次（120 min），計(jì)算結(jié)果的RSD 值。

1.7 不同藤茶樣品中多糖含量的測(cè)定

按“1.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行樣品多糖的提取，按“1.5”項(xiàng)下所獲得最佳參數(shù)方法和步驟進(jìn)行多糖含量測(cè)定。

1.8 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析

所有分析測(cè)試結(jié)果均采用三次平行處理；采用SPSS 26.0 軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用Origin 9 軟件進(jìn)行繪圖處理；顯著性水平取0.05，數(shù)據(jù)表示形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 四種方法最適吸收波長(zhǎng)的確定

用四種檢測(cè)方法分別處理葡萄糖溶液和藤茶多糖溶液后，用紫外光譜檢測(cè)220～700 nm 波長(zhǎng)內(nèi)的吸光度。由掃描結(jié)果（圖1）可知，苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、硫酸-紫外法和DNS 法的最適吸收波長(zhǎng)分別為485.5、620、315 和510 nm。與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[18-20]。另外，從出峰波長(zhǎng)及對(duì)稱性來看，苯酚-硫酸法、（圖1a）、二硝基水楊酸（DNS）法（圖1d）可能比其它2 種更適合測(cè)定藤茶樣品中總多糖的含量。

圖1 四種方法在220～700 nm 波長(zhǎng)處的紫外掃描圖Fig.1 The results of ultraviolet scanning of four methods at 220～700 nm

2.2 四種方法最佳實(shí)驗(yàn)條件的確定

2.2.1 苯酚-硫酸法

苯酚-硫酸法是多糖在硫酸的作用下生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，在485.5 nm 處有一最大紫外吸收峰，隨著多糖含量的增加，其顏色和吸光度也會(huì)遞增。由此可見，苯酚-硫酸法測(cè)定的多糖結(jié)果是否準(zhǔn)確、穩(wěn)定與實(shí)驗(yàn)過程中加入的硫酸數(shù)量、苯酚數(shù)量、生成橙黃色化合物時(shí)的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等4 個(gè)關(guān)鍵因素具有密切關(guān)系[21]。

由圖2可以看出苯酚-硫酸法中4個(gè)關(guān)鍵檢測(cè)條件的單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)吸光值的影響結(jié)果。在0.5 mL 藤茶粗多糖溶液（濃度為0.5 mg/mL）體系中，隨著濃硫酸添加量逐漸增加，與各添加量對(duì)應(yīng)的吸光值顯示出增加后持平的趨勢(shì)，當(dāng)濃硫酸的添加量為500 μL 時(shí)吸光時(shí)最大，進(jìn)一步增加時(shí)的吸光值沒有發(fā)現(xiàn)顯著的差異（p＜0.05）；逐步增加50 mg/mL 苯酚溶液的加入量，各加入量對(duì)應(yīng)的吸光值呈現(xiàn)先增加后緩慢減少的趨勢(shì)，在加入量為600 μL 時(shí)吸光值為最大，數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異（p＜0.05）；當(dāng)水浴時(shí)間達(dá)到20 min 時(shí)，對(duì)應(yīng)吸光值最大，即使延長(zhǎng)水浴時(shí)間，吸光值也沒有顯著差異（p＜0.05）；隨著水浴溫度變高，與各溫度對(duì)應(yīng)吸光值有增加的趨勢(shì)，溫度達(dá)到60 ℃時(shí)達(dá)到最大吸光值，之后的吸光值沒有顯著差異（p＜0.05）。因此，利用苯酚-硫酸法測(cè)定藤茶粗多糖含量，綜合考慮吸光值大小、實(shí)驗(yàn)時(shí)間和操作難易程度，其最佳實(shí)驗(yàn)條件為500 μL 濃硫酸、600 μL 苯酚溶液、60 ℃水浴溫度和20 min 水浴時(shí)間。

圖2 苯酚-硫酸法中檢測(cè)條件對(duì)吸光值的影響Fig.2 Influence of detection conditions on absorbance value in phenol-sulfuric acid method

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與楊勤等[22]用苯酚-硫酸法測(cè)定地參多糖、謝建華等[23]用苯酚-硫酸法測(cè)定青錢柳多糖的研究相比，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間存在差異，其原因可能在于一是反應(yīng)體系內(nèi)多糖種類、含量之間存在差異；二是部分實(shí)驗(yàn)沒有對(duì)測(cè)定的吸光值進(jìn)行差異性分析，事實(shí)上盡管數(shù)值的絕對(duì)值仍在變化，但數(shù)值之間并沒有顯著性差異。尤其就苯酚-硫酸法而言，反應(yīng)為放熱反應(yīng)，反應(yīng)過程中產(chǎn)生的熱量能夠保證反應(yīng)的正常進(jìn)行，過高的溫度不利于操作，選擇適當(dāng)?shù)蜏夭⒉挥绊憣?shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2.2 蒽酮-硫酸法

蒽酮-硫酸法其原理與苯酚-硫酸法類似，多糖在硫酸的作用下生成糖醛衍生物（羥甲基糖醛），再與蒽酮脫水縮合成藍(lán)綠色化合物，通過紫外掃描發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在620 nm 處有最大吸收峰，其顏色的深淺和吸光值與多糖含量呈正比。由原理可知蒽酮-硫酸試劑的加入量、水浴溫度和水浴時(shí)間是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵條件[24]。

由圖3可以看出蒽酮-硫酸法中3 個(gè)關(guān)鍵檢測(cè)條件的單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)吸光值的影響結(jié)果。在0.5 mL 藤茶粗多糖溶液（濃度為0.5 mg/mL）體系中，逐步增加0.5 mg/mL 的蒽酮-硫酸溶液的加入量，各加入量對(duì)應(yīng)的吸光值呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢(shì)，當(dāng)加入量達(dá)到400 μL 時(shí)對(duì)應(yīng)的吸光值最大，增大加入量，吸光值無顯著性差異（p＜0.05）；在60～100 ℃水浴溫度范圍內(nèi)，各溫度對(duì)應(yīng)的吸光值均有顯著性差異（p＜0.05）且溫度越高吸光值越大，說明水浴溫度對(duì)吸光值的影響很大，實(shí)驗(yàn)要求在沸水狀態(tài)下進(jìn)行；當(dāng)水浴時(shí)間達(dá)到20 min 時(shí)，吸光值最大，延長(zhǎng)水浴時(shí)間，對(duì)應(yīng)的吸光值呈緩慢下降趨勢(shì)。因此，利用蒽酮-硫酸法測(cè)定藤茶粗多糖含量，綜合考慮吸光值大小、實(shí)驗(yàn)時(shí)間和試劑用量，其最佳實(shí)驗(yàn)條件為0.5 mg/mL 蒽酮-硫酸溶液400 μL、100 ℃水浴、水浴時(shí)間20 min。

圖3 蒽酮-硫酸法中檢測(cè)條件對(duì)吸光值的影響Fig.3 Influence of detection conditions on absorbance value in anthrone-sulfuric acid method

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張紅等[25]利用蒽酮-硫酸法測(cè)定桑葉中多糖的含量、王文潔等[26]利用蒽酮-硫酸法測(cè)定涼粉草多糖所獲得的蒽酮-硫酸用量和反應(yīng)溫度兩個(gè)條件有所不同。其主要原因在于多糖具有多種反應(yīng)體系，蒽酮-硫酸的用量取決于多糖種類及含量，所以不能一概而論；另外糖醛衍生物與蒽酮反應(yīng)需要合適的溫度以及合適的時(shí)間，溫度高，時(shí)間可以縮短，溫度低，相應(yīng)反應(yīng)時(shí)間要延長(zhǎng)。

2.2.3 硫酸-紫外法

硫酸-紫外法是2013年Ammar等[27]以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟、縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間以及避免因苯酚-硫酸法中所使用的苯酚給人體及環(huán)境帶來危害為目的而改進(jìn)的一種方法。硫酸-紫外法是直接利用強(qiáng)酸水解多糖，利用多糖水解后所產(chǎn)生的糖醛或其衍生物在315 nm 波長(zhǎng)處具有紫外吸收的特點(diǎn)，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)多糖進(jìn)行定量測(cè)定。應(yīng)用硫酸-紫外法測(cè)定多糖，實(shí)驗(yàn)過程中的濃硫酸用量和反應(yīng)時(shí)的溫度、時(shí)間是對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響的主要因素。

由圖4可以看出，濃硫酸用量少于或超過500 μL時(shí)對(duì)吸光值產(chǎn)生明顯影響，其原因可能在于濃硫酸用量過多時(shí)，過量的濃硫酸可能對(duì)315 nm 波長(zhǎng)處有紫外吸收的產(chǎn)物進(jìn)行繼續(xù)水解形成沒有紫外吸收的產(chǎn)物；而濃硫酸用量過少時(shí)，部分多糖可能沒有得到水解。在25～60 ℃水浴溫度范圍內(nèi)，溫度對(duì)吸光值沒有顯著差異，其原因可能在于硫酸-紫外法為放熱反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的熱量足夠保證反應(yīng)正常進(jìn)行；當(dāng)水浴時(shí)間達(dá)到20 min 時(shí)，吸光值最大，延長(zhǎng)水浴時(shí)間，對(duì)應(yīng)的吸光值沒有差異。因此，利用硫酸-紫外法測(cè)藤茶多糖的最佳實(shí)驗(yàn)條件是500 μL 濃硫酸、水浴溫度25 ℃、水浴20 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與辛敏等利用硫酸-紫外法測(cè)定千兩茶中總多糖的條件基本一致[28]。

圖4 硫酸紫外法中檢測(cè)條件對(duì)吸光值的影響Fig.4 Influence of detection conditions on absorbance value in sulfuric acidUV method

2.2.4 DNS 法

DNS 法是還原糖能在堿性條件下與DNS 發(fā)生顯色反應(yīng)，在高溫條件下呈棕紅色，其顏色的深淺和吸光度與還原糖含量成正比。故DNS 方法適合用在多糖水解產(chǎn)生的多種還原糖體系中。對(duì)于DNS 法而言，DNS 用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間是影響吸光度的主要因素。

由圖5可以看出，隨著DNS 用量的增加，吸光值呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，當(dāng)加入量達(dá)到240 μL 時(shí)，吸光值達(dá)到最大；在60～100 ℃水浴溫度范圍內(nèi)，各溫度對(duì)應(yīng)的吸光值均有顯著性差異（p＜0.05），且溫度越高吸光值越大，說明水浴溫度對(duì)吸光值的影響很大，實(shí)驗(yàn)要求在沸水狀態(tài)下進(jìn)行；反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5 min 時(shí)，吸光值變化呈平穩(wěn)狀態(tài)。因此，利用DNS 法測(cè)定藤茶粗多糖含量，在0.5 mL 藤茶粗多糖溶液（濃度為0.5 mg/mL）反應(yīng)體系中，選擇DNS 用量240 μL、水浴溫度100 ℃，反應(yīng)時(shí)間5 min 時(shí)，吸光值最大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與任婧等[20]用DNS 法測(cè)定番茄果實(shí)總糖、歐能奉等[28]測(cè)定當(dāng)歸多糖的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間基本相同，但選擇DNS 最佳用量與本研究有較大差別，其主要原因在于實(shí)驗(yàn)過程中反應(yīng)體系中多糖的種類和含量不同所致。

圖5 DNS 法中檢測(cè)條件對(duì)吸光值的影響Fig.5 Influence of detection conditions on absorbance value in dinitrosalicylic acid method

2.3 四種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較

按照“1.5”項(xiàng)下所獲得的最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)和步驟進(jìn)行操作，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到四種方法相對(duì)應(yīng)的線性回歸方程：苯酚-硫酸法：A=1.516 8C+0.091 1，R2=0.998 9，線性范圍為0.1～0.6 mg/mL；蒽酮-硫酸法：A=1.445 2C+0.169 7，R2=0.998 4，線性范圍為0.1～0.6 mg/mL；硫酸-紫外法：A=0.799 9C+0.294 8，R2=0.998 8，線性范圍為0.1～0.6 mg/mL；DNS法：A=0.981 2C-0.021 7，R2=0.998 6，線性范圍為0.1～0.6 mg/mL。四種方法的相關(guān)系數(shù)R2表明在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，四種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線均線性良好。

2.4 四種測(cè)定方法的方法學(xué)考察結(jié)果

方法學(xué)分析結(jié)果如表1所示，四種方法精密度的RSD 值均小于1.5%，說明方法的精密度較好；四種方法重復(fù)性的RSD 值均小于2.0%，在誤差允許范圍內(nèi)再現(xiàn)性良好；在120 min 實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，4 種方法的穩(wěn)定性RSD 值均小于1.6%，說明方法測(cè)定所基于的產(chǎn)物是基本穩(wěn)定的；四種方法的加標(biāo)回收率結(jié)果顯示，相互之間并沒有顯著性差異。

表1 四種方法測(cè)定藤茶樣品中總多糖的含量及方法學(xué)考察結(jié)果Table 1 The comparison of methodological and results of polysaccharide in Ampelopsis grossedentata by four methods (%,x±SD,n=3)

綜合方法學(xué)考慮結(jié)果，就藤茶多糖而言，苯酚-硫酸法是一種最好的方法，其精密度最高（RSD 為0.18%），穩(wěn)定性最好（RSD 為0.30%），重復(fù)性（RSD為1.56%）、加標(biāo)回收率（RSD 為100.41%）也處于4種方法的中值。其原因可能在于，苯酚-硫酸法中是分開加入試劑，試劑之間互相影響較小，加入苯酚試劑后迅速加入濃硫酸，濃硫酸與多糖生成的產(chǎn)物迅速與苯酚反應(yīng)，濃硫酸所放出的熱量足夠讓反應(yīng)得以順利完全進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程中的反應(yīng)溫度不應(yīng)該是關(guān)鍵因素；此外，反應(yīng)生成的最后產(chǎn)物也比較穩(wěn)定，在一定時(shí)間內(nèi)不會(huì)分解，所以穩(wěn)定性和精密度比較好；由于反應(yīng)比較徹底完全，所以重復(fù)性和回收率也比較高。

從樣品總多糖含量測(cè)定的數(shù)據(jù)來看，DNS 測(cè)得的樣品含量最高（61.65%），硫酸-紫外法測(cè)得樣品含量最低（53.56%），苯酚-硫酸法（59.43%）和蒽酮-硫酸法（58.08%）居于中間，含量均具有顯著性差異（p＜0.05）。其原因可能在于DNS 法的專屬性不強(qiáng)，顯色的深淺只與多糖中還原基團(tuán)的數(shù)量有關(guān)，而對(duì)還原基團(tuán)的種類沒有選擇性，從而使得所測(cè)結(jié)果偏高[20,27]；而硫酸-紫外法是直接利用強(qiáng)酸處理多糖，利用處理后所產(chǎn)生的糖醛或其衍生物在315 nm 處直接顯色進(jìn)行測(cè)定，但有可能部分多糖產(chǎn)物在315 nm 處不顯色，從而使得所測(cè)結(jié)果偏低[19]。苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下脫水生成的糖醛衍生物與苯酚生成的橙黃色化合物，在485.5 nm 處測(cè)定吸光值，而蒽酮-硫酸法則是利用多糖在硫酸的作用下脫水生成糖醛衍生物與蒽酮脫水縮合成藍(lán)綠色化合物，在620 nm 處測(cè)定吸光度。苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法能夠測(cè)定可溶性糖含量，所以測(cè)得的多糖含量居于4 種方法的中間[18,21]。

2.5 四種方法對(duì)不同樣品多糖含量的測(cè)定

用苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、硫酸-紫外法、DNS法分別對(duì)來自相同季節(jié)、不同地點(diǎn)的7 批樣品中的多糖含量進(jìn)行了統(tǒng)一檢測(cè)。由表2和表3可以看出，DNS法檢測(cè)的多糖含量最高，硫酸-紫外法檢測(cè)的多糖含量最低，7 個(gè)樣品中總多糖含量幼嫩莖葉為9.87～10.47 mg/g、粗老莖葉為29.77～30.47 mg/g。從統(tǒng)計(jì)學(xué)來看，4 種方法檢測(cè)的結(jié)果基本均存在顯著性差異（p＜0.05）。樣品測(cè)定的多糖含量結(jié)果趨勢(shì)與4 種方法的方法學(xué)考察時(shí)的結(jié)果趨勢(shì)一致。

表2 不同樣品中多糖含量（幼嫩莖葉，mg/g）Table 2 The polysaccharide content in different samples (young stems and leaves,mg/g)

表3 不同樣品中多糖含量（粗老莖葉，mg/g）Table 3 The polysaccharide content in different samples (coarse old stems and leaves,mg/g)

3 結(jié)論

本研究以葡萄糖為對(duì)照品，選用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、硫酸-紫外法和DNS 法對(duì)藤茶中的多糖含量進(jìn)行比較測(cè)定，四種測(cè)定方法相的最大紫外吸收波長(zhǎng)分別為485.5、620、315 和510 nm，此時(shí)樣品多糖與標(biāo)準(zhǔn)品的峰形基本一致，對(duì)稱性較好。四種方法的單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，在0.5 mL 藤茶粗多糖溶液（濃度為0.5 mg/mL）反應(yīng)體系中，苯酚-硫酸法的最佳實(shí)驗(yàn)條件為500 μL 濃硫酸、600 μL 苯酚溶液、60 ℃水浴溫度和20 min 水浴時(shí)間，蒽酮-硫酸法的最佳實(shí)驗(yàn)條件為0.5 mg/mL 蒽酮-硫酸溶液400 μL、100 ℃水浴、水浴時(shí)間20 min，硫酸-紫外法的最佳實(shí)驗(yàn)條件為500 μL 濃硫酸、水浴溫度25 ℃、水浴時(shí)間20 min，DNS 法的最佳實(shí)驗(yàn)條件為DNS 用量240 μL、水浴溫度100 ℃，水浴時(shí)間5 min，此時(shí)吸光值最大，實(shí)驗(yàn)所用試劑和實(shí)驗(yàn)時(shí)間最少。四種方法的方法學(xué)分析結(jié)果表明，四種方法均可用于藤茶多糖含量的測(cè)定。其精密度的RSD 值均小于1.5%，方法的精密度較好；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的RSD 值均小于2.0%，在誤差允許范圍內(nèi)，四種方法均有良好的重現(xiàn)性；在120 min 實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，4 種方法的穩(wěn)定性RSD 值均小于1.6%，說明方法測(cè)定所基于的產(chǎn)物是基本穩(wěn)定，使用時(shí)只要嚴(yán)格控制測(cè)定時(shí)間方法是穩(wěn)定的；加標(biāo)回收率結(jié)果顯示，四種方法之間數(shù)據(jù)沒有顯著性差異。但就藤茶多糖而言，苯酚-硫酸法是最好的方法，其精密度最高（RSD為0.18%），穩(wěn)定性最好（RSD 為0.30%），重復(fù)性（RSD為1.56%）、加標(biāo)回收率（RSD 為100.41%）和最終測(cè)得的多糖含量數(shù)值也處于4 種方法的中值。利用4 種方法對(duì)藤茶幼嫩莖葉干燥樣品進(jìn)行測(cè)量，7 個(gè)樣品中總多糖含量幼嫩莖葉為9.87～10.47 mg/g、粗老莖葉為29.77～30.47 mg/g。