曾繁濠，季杏迪，王兆梅，曹晶，潘振輝，黃燦慶，羅歆桐*

（1.廣州酒家集團(tuán)利口福食品有限公司，廣東廣州 511442）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

果膠是自然界中最為豐富的結(jié)構(gòu)多糖，近年來，一類由果膠降解得到的具有突出生物活性的“改性果膠”（Modified Pectin，MP）受到廣泛關(guān)注，其中以抗腫瘤活性最為引人注目[1-4]，一種改性柑橘果膠（GCS-100）處于Ⅱ期的臨床研究可用于免疫和抗腫瘤輔助調(diào)節(jié)[5]。然而原果膠是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的酸性雜多糖，包含兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)區(qū)域，即聚半乳糖醛酸（Homogalacturonan，HG）和鼠李半乳糖醛酸I（RG-I）[6]，因此需要優(yōu)化果膠結(jié)構(gòu)得到高活性片段。目前通過化學(xué)降解、酶法降解、超聲降解[7]等獲取MP，其中果膠的光催化降解是利用過氧化氫產(chǎn)生的自由基裂解果膠中的GalA，得到富含RG-I 的果膠片段。與原果膠相比，降解修飾后的改性果膠活性更強(qiáng)，因此能更好地發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用[8]。

大量的同行研究和臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，MP 的抗腫瘤活性與其對半乳糖凝集素-3（Galectin-3，Gal-3）顯著的拮抗作用密切相關(guān)[9,10]。Gal-3 能通過糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域（Carbohydrate Recognition Domain，CRD）與半乳糖殘基通過受體-配體作用產(chǎn)生特異性結(jié)合，與癌細(xì)胞表面大量表達(dá)的Gal-3 相互識(shí)別，阻斷Gal-3 與其他蛋白質(zhì)及多肽的結(jié)合，進(jìn)而抑制Gal-3 介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的吸附與遷移[11,12]。因此，Gal-3 是近年來糖生物學(xué)領(lǐng)域倍受關(guān)注的抗癌藥物新靶點(diǎn)，是臨床檢驗(yàn)?zāi)[瘤的重要指標(biāo)之一。

鑒于果膠相關(guān)的抗腫瘤活性與其對Gal-3 的多價(jià)結(jié)合而產(chǎn)生的拮抗作用密切相關(guān)，本文提出基于果膠與Gal-3 的糖-凝集素配體特異性結(jié)合的原理，從復(fù)雜的果膠降解片段中定向分離與Gal-3 結(jié)合的活性潛力片段，驗(yàn)證其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，為優(yōu)化果膠降解方法，發(fā)掘高活性的果膠片段食品功能因子提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

柑橘果膠（P9135，≥99%），上海Sigma Aldrich公司；人重組半乳凝集素-3，美國BioVison 公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

制備改性果膠的光催化降解設(shè)備主要由CEL-LAB500光化學(xué)反應(yīng)儀、CEL-LX1000 低溫冷卻循環(huán)水泵、500WLMLS 500 W 長弧汞燈泡三部分組成，均購自北京奧萊特有限公司；XSP-11C 光學(xué)顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠；MCO-175 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本SAMYO 公司；Infinite M200 多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酸堿協(xié)同紫外光催化過氧化氫氧化法降解果膠

根據(jù)曹晶等[13]優(yōu)化的紫外光催化過氧化氫氧化工藝（Ultraviolet Light Catalytic Hydrogen Peroxide Oxidation System，UHP）協(xié)同一定的酸堿微環(huán)境進(jìn)行果膠降解。稱取適量柑橘果膠粉末于去離子水中充分溶解至溶液濃度10 mg/mL。分別用1.0 mol/L 的HCl或NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至4.0 和10.0，再向果膠溶液中滴加H2O2溶液（30%，V/V）使其最終濃度為0.03 mol/L。取20 mL 上述反應(yīng)溶液置于光化學(xué)反應(yīng)儀的石英試管中，在磁力攪拌與紫外光照射條件下反應(yīng)不同時(shí)間（1、3、5、7 h），得到果膠降解溶液。反應(yīng)結(jié)束后，立即用1.0 mol/L 的NaOH 或HCl 調(diào)節(jié)pH 值至中性，并加入4 倍體積的無水乙醇，隔夜靜置沉降，7 104g離心15 min，得到的沉淀在60 ℃真空干燥得到果膠降解產(chǎn)物，根據(jù)反應(yīng)酸堿度和時(shí)間分別用編號(hào)UHP 4-1、UHP 4-3、UHP 4-5、UHP 4-7、UHP 10-1、UHP 10-3、UHP 10-5、UHP 10-7 表示。準(zhǔn)確稱量果膠降解產(chǎn)物質(zhì)量m1，原果膠質(zhì)量m0，按公式計(jì)算每種降解產(chǎn)物的產(chǎn)率（C，%）。

1.3.2 分子質(zhì)量

參考Yang 等[14]方法并作適當(dāng)修改。用Waters 凝膠滲透色譜儀（GPC）測定果膠及降解產(chǎn)物的分子量。4～5 mg 果膠降解產(chǎn)物溶于2 mL 20 mmol KH2PO4緩沖溶液中，用0.45 μm 水系膜過濾。色譜條件：兩根串聯(lián)的TSK 凝膠柱TSK（G-5000PWXL，7.8×300 mm 和G-3000PWXL，7.8×300 mm），Waters 2414 示差檢測器，洗脫液為20 mmol KH2PO4緩沖液（pH 值4.0），流量0.6 mL/min，柱溫35 ℃，運(yùn)行時(shí)間45 min。用不同重均分子量（Mw）葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（1 400、668、410、273、148、48.6、23.8、11.6、5.2 ku）建立線性方程。

1.3.3 甲氧酯化度（Degree of Methylation，DM）和乙酰酯化度（Degree of Acetylation，DA）

果膠降解產(chǎn)物（10 mg）在0.5 mL 6 mmol CuSO4、1.0 mL 0.5 mol NaOH 和10 μL 4 mmol 異丙醇的溶液中4 ℃反應(yīng)30 min，7 104g離心10 min。用0.5 mol HCl調(diào)pH 值2.0，用0.45 μm 膜過濾后待用。標(biāo)準(zhǔn)曲線用10 μL 100 μL/mL 異丙醇（IPA）、10 μL 100 μL/mL 乙酸（AcOH）、6 μL 甲醇（MeOH）和2 mL 超純水測定。采用Waters 1525 高效液相色譜系統(tǒng)，C18色譜柱（SinoChrom ODS-BP，250×4.6 mm）和示差檢測器（Waters 2414）。取20 μL注入HPLC 體系，柱溫25 ℃，運(yùn)行時(shí)間20 min，洗脫液為4 mmol H2SO4，流量為0.8 mL/min。以IPA 為內(nèi)標(biāo)得到MeOH 和AcOH 的響應(yīng)因子FR，再計(jì)算出DM 和DA。

式中：

M——下標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量；

A——下標(biāo)物質(zhì)的峰面積；

GalA%——樣品中半乳糖醛酸的質(zhì)量百分含量。

1.3.4 果膠降解產(chǎn)物的分離純化

取1 mL 濃度為10 mg/mL 果膠降解產(chǎn)物緩慢加入到平衡后載有DEAE-cellulose 的層析柱（2.6 cm×60 cm）中，分別用蒸餾水和三個(gè)濃度梯度的NaCl 水溶液（通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定濃度梯度為0.1 mol、0.3 mol 和1.0 mol）洗脫，體積流量1.2 mL/min。收集主要洗脫餾分后，再用Sephadex G200（2.6 cm×60 cm）凝膠層析柱進(jìn)一步純化。收集峰最大的組分，透析后冷凍干燥，得到純化的果膠降解片段，根據(jù)洗脫液組分分別用UHP 4-5-0、UHP 4-5-0.1、UHP 4-5-0.3 和UHP 4-5-1.0 表示。

1.3.5 Gal-3 誘導(dǎo)的紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)

Gal-3 誘導(dǎo)的紅細(xì)胞凝集（Galectin-3-Mediated Hemagglutination，G3H）實(shí)驗(yàn)被普遍應(yīng)用于鑒定某種物質(zhì)是否為Gal-3 的抑制劑[15]。在V 型透明的96 孔板上，設(shè)定第一孔作為陰性對照組加入75 μL PBS，第二孔為陽性對照組加入50 μL PBS，其余除第三孔外各加入50 μL PBS。以PBS 為溶劑配置濃度為1 mg/mL 的待測果膠樣品溶液，取100 μL 樣品溶液加入到第三孔，然后按2 倍逐步稀釋，靜置10 min。除第一孔，其它所有孔各加25 μL 20 μg/mL Gal-3，混勻后靜置30 min。所有孔各加25 μL 4%雞血紅細(xì)胞，25 ℃下靜置1.5 h后觀察雞血紅細(xì)胞的凝集狀態(tài)。若紅細(xì)胞最終沉降為一個(gè)小紅點(diǎn)，則判斷為完全不凝集；若紅細(xì)胞在孔壁上大量凝集，則判斷為完全凝集。以乳糖（Lac）、半乳糖（Gal）、CP、酶改性柑橘果膠（Pectasol-C）作為陽性對照，以完全抑制雞血紅細(xì)胞凝集所需樣品的最小抑制濃度（Minimum Inhibition Concentration，MIC）表示樣品的抑制活性。

1.3.6 腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

選用CCK-8 比色法進(jìn)行果膠降解產(chǎn)物抑制腫瘤細(xì)胞（HepG 2、MCF-7）增殖的實(shí)驗(yàn)，以及果膠降解片段對正常細(xì)胞毒性（293A）和腫瘤細(xì)胞（HepG2、MCF-7、HeLa）的抑制增殖實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25wt%胰蛋白酶制成細(xì)胞懸液，控制細(xì)胞密度為每毫升5×104個(gè)。在96 V 型孔板上每孔接種100 μL細(xì)胞液，置于CO2培養(yǎng)箱的37 ℃條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度大于80%時(shí)，用PBS 潤洗孔板3 次。加入100 μL不同濃度的樣品，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h。而后緩慢吸出液體，再用PBS 潤洗孔板3 次，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，公式如下所示：

式中：

B——細(xì)胞增值率，%；

OD1——加樣組平均OD 值；

OD0——正常對照組OD 值。

1.3.7 結(jié)構(gòu)表征

1.3.7.1 紅外光譜

采用FT-IR 光譜儀Vertex 70 測定樣品的FT-IR 光譜。1 mg 樣品與200 mg KBr 混合，壓成薄片，在4 000～400 cm-1光譜范圍內(nèi)進(jìn)行掃描分析。

1.3.7.2 單糖組成分析

用對羥基二苯法[16]測定GalA 含量。中性糖組成用高效陰離子交換色譜（HPAEC）測定[17]?？傊行蕴牵∟S）含量由巖藻糖（Fuc）、鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖（Glc）和木糖（Xyl）之和計(jì)算。

1.3.7.3 核磁共振分析

稱取約30 mg 樣品溶解于500 μL 的重水（99.96%）溶液中。在室溫下用Bruker AVIII 600M 獲取1H NMR譜。用標(biāo)準(zhǔn)Bruker 程序記錄二維光譜HSQC。采用MestReNova 6.1.1 處理光譜。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)處理和分析采用SPSS 25.0 和Origin 2018 軟件。同一類不同處理的數(shù)據(jù)采用沃勒-鄧肯多重檢驗(yàn)方法，并用字母標(biāo)注顯著性（顯著水平p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸堿協(xié)同UHP 對果膠的降解

圖1反映了在不同反應(yīng)時(shí)間下酸堿協(xié)同UHP 降解果膠的結(jié)果與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化。隨著反應(yīng)進(jìn)行，果膠降解產(chǎn)物的產(chǎn)率不斷下降，但本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)最低產(chǎn)率仍高于50%。相比于堿協(xié)同UHP 反應(yīng)（產(chǎn)率66.5%～94.2%），UHP 4 系列產(chǎn)物的得率（54.0%～75.4%）更低，這與酸性果膠更易發(fā)生降解有關(guān)。反應(yīng)過程中果膠內(nèi)部發(fā)生鏈裂解使分子量不斷降低，如圖1a 所示，UHP-4 系列產(chǎn)物的重均分子量由原果膠的641.2 ku 降低至65.3 ku，而UHP-12 的分子量更低為54.7 ku，這主要是由于堿性環(huán)境中果膠發(fā)生了去酯化和β-消除反應(yīng)[18]。圖1b 中UHP 10 的DM 值（38.74%～24.39%）相比UHP 4 的DM 值（56.01%～45.52%）顯著降低，說明相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)UHP10 系列產(chǎn)物的降解程度更高，UHP 10 和UHP 4 在DA 值上的差異同是降解程度導(dǎo)致的，因此堿協(xié)同UHP 可以去除更多的甲氧基和乙?；?，而在酸性環(huán)境中更傾向于主鏈末端斷裂的降解模式。值得注意的是，堿協(xié)同UHP 反應(yīng)導(dǎo)致DM 和DA 較大程度地降低，因此，這一反應(yīng)對果膠側(cè)鏈小分子基團(tuán)的酯化作用明顯，與酸堿改性的作用相似[6]，而與目前通常采用的酶法降解果膠不同[19]，這將為果膠定向修飾提供一個(gè)新途徑。

圖1 不同反應(yīng)時(shí)間下降解果膠片段的結(jié)構(gòu)參數(shù)Fig.1 Structural parameters of pectin fragment prepared at different reaction time

2.2 活性引導(dǎo)果膠片段的純化分離

紅細(xì)胞膜表面分布著一定量的寡糖鏈，可被凝集素特異性識(shí)別并結(jié)合，因此向雞紅細(xì)胞中加入Gal-3 后產(chǎn)生細(xì)胞凝集，而當(dāng)體系中添加含有乳糖Lac 或半乳糖Gal 的成分則可阻斷二者結(jié)合，從而抑制紅細(xì)胞凝集。圖2為基于Gal-3 結(jié)合的活性引導(dǎo)果膠片段分離示意圖及分離結(jié)果，柑橘果膠CP 和商業(yè)改性果膠Pectasol-C 的MIC 都大于1.0 mg/mL，果膠降解產(chǎn)物UHP 4-1 與UHP 10-1 的MIC 值均大于1.0 mg/mL，說明一定時(shí)間和程度的氧化降解對組分的結(jié)合能力有促進(jìn)作用。隨著果膠的不斷降解，酸協(xié)同UHP 降解產(chǎn)物的MIC 值整體呈降低趨勢，其中UHP 4-5 的MIC 值（0.125～0.25 mg/mL）最小，且與半乳糖相當(dāng)，因此，UHP 4-5 與Gal-3 的結(jié)合能力等同于陽性對照組的半乳糖。而堿協(xié)同UHP 降解產(chǎn)物的MIC 值普遍偏高，僅有UHP 10-7 的MIC 值為0.25～0.5 mg/mL。因此對比分析，UHP 4系列產(chǎn)物抑制Gal-3介導(dǎo)的雞血紅細(xì)胞凝集的濃度更低，說明其與Gal-3 結(jié)合能力更強(qiáng)，這可能是由于堿性條件下果膠甲氧基的大量去除不利于降解產(chǎn)物與Gal-3 的結(jié)合。接下來，UHP 4-5 經(jīng)過DEAE 纖維素柱層析和葡聚糖凝膠柱層析分離，得到4 種純化組分UHP 4-5-0、UHP 4-5-0.1、UHP 4-5-0.3 和UHP 4-5-1.0，經(jīng)紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)篩選，確定了其中的主要純化組分UHP 4-5-0.3 為活性片段，MIC 值為0.016 mg/mL，約為乳糖的1/3、半乳糖的1/12，這一結(jié)果優(yōu)于pH 改性的柑橘果膠[20]，與人參花蕾果膠[21]、人參果膠[22]等果膠片段活性相當(dāng)，因此具備進(jìn)一步開發(fā)為Gal-3 抑制劑的潛力。在本文后面的研究中，所述的果膠片段如無特別說明，均指活性引導(dǎo)純化后得到的果膠片段UHP 4-5-0.3。

圖2 活性引導(dǎo)果膠片段分離示意圖Fig.2 Schematic diagram of activity-guided separation of pectin fragments

2.3 果膠降解產(chǎn)物對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

采用CCK-8 法分析不同濃度的果膠降解產(chǎn)物對Gal-3 高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖3所示。所有果膠降解產(chǎn)物在0.5 mg/mL 濃度下對應(yīng)腫瘤細(xì)胞的存活率明顯低于濃度0.1mg/mL 的相應(yīng)組分，表明果膠降解產(chǎn)物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用呈濃度依賴性。圖3a 中，在0.5 mg/mL 濃度下UHP 4 對HepG 2腫瘤細(xì)胞的抑制作用（細(xì)胞存活率71.9%～77.9%）低于UHP 10 對其的抑制作用（細(xì)胞存活率66.8%～74.0%），這與G3H 的結(jié)果一致。而在UHP 4 的系列產(chǎn)物中UHP 4-3 對HepG2 的抗增殖作用最大（77.9%），同時(shí)在G3H 實(shí)驗(yàn)中也表明UHP 4-3 與Gal-3 的結(jié)合活性最強(qiáng)。與CP（存活率47.4%）相比，高濃度的果膠降解產(chǎn)物對 MCF-7 的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)（81.2%～85.1%）。而0.1 mg/mL 濃度下的抑制作用與CP（22.3%）相近，其中在低濃度下UHP 4-5 的抗增殖作用最強(qiáng)（33.9%），這也與G3H 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。因此，可通過果膠片段與Gal-3 的結(jié)合活性判斷其抗腫瘤增殖的能力。

圖3 果膠降解產(chǎn)物對腫瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of pectin degradation products on the proliferation of tumor cells

果膠片段對293A、HepG2、MCF-7 和HeLa 細(xì)胞存活率的影響如圖4所示。未純化的果膠片段UHP 4-5 對人正常腎細(xì)胞293A 的增殖活性無顯著影響，而純化后的UHP 4-5-0.3 在高濃度（0.5 mg/mL）下293A 細(xì)胞存活率降至72.1%，表明在此濃度下UHP 4-5-0.3 對正常細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性，這可能與高濃度下的高滲透壓對細(xì)胞壁的機(jī)械損傷有關(guān)。純化可以顯著提高果膠片段的體外抗腫瘤活性，與UHP 4-5 相比，添加純化后的UHP 4-5-0.3 所對應(yīng)的腫瘤細(xì)胞的存活率加大幅度降低，在0.1 mg/mL 濃度下，添加UHP 4-5 后HepG 2 和MCF-7的細(xì)胞存活率分別為72.9%和66.1%，而添加UHP 4-5-0.3組的相應(yīng)細(xì)胞存活率分別下降到27.2%和10.0%，這一現(xiàn)象與G3H 實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。而對于HeLa 細(xì)胞，低濃度的果膠片段展現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖抑制作用，這可能是由于HeLa 細(xì)胞對果膠活性片段的敏感性更強(qiáng)，后續(xù)需降低濃度進(jìn)行試驗(yàn)。但整體上，G3H 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以反映果膠片段的抗腫瘤活性，說明UHP 4-5-0.3 可能通過與腫瘤細(xì)胞表面的寡糖鏈結(jié)合從而拮抗促轉(zhuǎn)移蛋白Gal-3，最終抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、聚集、粘附和轉(zhuǎn)移[23,24]。然而，這一設(shè)想的詳細(xì)機(jī)制還有待后續(xù)研究。

圖4 果膠片段對四種細(xì)胞增殖活性的影響Fig.4 Effect of pectin fragment on the proliferation of four cells

2.4 結(jié)構(gòu)表征

表1列出了純化前后果膠片段的理化性質(zhì)與單糖組成。在所有樣品的單糖組成中，GalA 均是主要成分，平均摩爾百分比超過50%。經(jīng)降解純化后，Gal 的百分含量由CP 的12.7%增加到17.3%，同時(shí)研究表明富含半乳糖殘基的多糖和果膠對糖-凝集素的結(jié)合起促進(jìn)作用[25]。中性糖摩爾百分含量由CP 的22.41%增加到37.52%，這主要是由于UHP 反應(yīng)過程中對果膠結(jié)構(gòu)中的HG 部分產(chǎn)生定向降解從而去除了部分GalA[26]。中性糖如Xyl、Glc 和Rha 在降解處理后也顯著增加，導(dǎo)致鼠李半乳糖醛酸（RG）結(jié)構(gòu)域在最終產(chǎn)物中比例提高。此外，UHP 4-5 與UHP 4-5-0.3 的Rha/GalA 比值分別為0.14 和0.11，根據(jù)RG-I 型結(jié)構(gòu)模型，Rha/GalA比值一般在0.05～1.0 之間[27]，因此，推測酸協(xié)同UHP氧化降解得到的果膠片段是一種高度支化的RG-I 富集型果膠片段。此外，代表果膠線性度的指標(biāo)GalA 與NS 摩爾比GalA/NS 從CP 的3.46 顯著降低到1.08（UHP 4-5）和1.67（UHP 4-5-0.3），表明CP 由線性主導(dǎo)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉种ЫY(jié)構(gòu)。綜上所述，原果膠的降解主要是通過破壞主要化學(xué)成分GalA，產(chǎn)生高度分支的RG-I 型果膠片段。

表1 果膠片段的單糖組成與結(jié)構(gòu)Table 1 Monosaccharide composition and structure of the pectin fragments

果膠片段UHP 4-5-0.3 的紅外光譜如圖5a 所示，與CP 相比，UHP 4-5-0.3 在1 750 cm-1處（酯化羰基特征峰）的峰強(qiáng)度明顯減弱，而在1 640 cm-1和1 446 cm-1處（游離羧酸基團(tuán)特征峰）的峰強(qiáng)度增強(qiáng)，說明CP 降解過程中酯化度降低，這與圖1中DM 值的變化趨勢相同。1 200 cm-1至800 cm-1之間的光譜區(qū)域普遍被認(rèn)為是多糖類化合物的特殊指紋區(qū)，與CP 和UHP 4-5 相比，UHP 4-5-0.3 在1 102 cm-1和1 012 cm-1處的吸收峰（阿拉伯半乳聚糖的特征峰）明顯增強(qiáng)[28]，而阿拉伯半乳聚糖常作為中性側(cè)鏈與RG-I 相連接，表明純化過程中富集了含有中性糖分支的果膠結(jié)構(gòu)域。

圖5 果膠片段的結(jié)構(gòu)表征圖Fig.5 Structure spectra of the pectin fragment

利用1H NMR 和HSQC 譜圖分析了UHP 4-5-0.3 的分子結(jié)構(gòu)。為了便于結(jié)構(gòu)推測，本研究根據(jù)Mohnen[29]提出的果膠典型結(jié)構(gòu)模型，將果膠片段結(jié)構(gòu)簡化為HG+RG-I，其中 RG-I 由重復(fù)的雙糖單元[1,4-α-D-GalA-1,2-α-L-Rha-]n組成主鏈，大部分鼠李糖（Rha）殘基被半乳糖等中性糖取代形成側(cè)鏈。Rha 是RG-I 主鏈中唯一連接到分支的糖殘基，因此根據(jù)1,2-Rha 和O-2,4-Rha 的摩爾數(shù)量和兩者的數(shù)量比例推測分支數(shù)量。如圖5所示1H NMR 和HSQC 譜圖所提供的信息，1,2-Rha 和O-2,4-Rha 所對應(yīng)的峰面積比分別為67.4%和32.6%，故UHP 4-5-0.3 中Rha 分支的數(shù)量約為46。根據(jù)單糖組成分析（表1），Gal 和Ara 是RG-I 側(cè)鏈上除Rha 以外的主要中性糖，通過Ara/Gal的峰面積及兩者與O-2,4-Rha 的數(shù)量比例，推測UHP 4-5-0.3中RG-I側(cè)鏈平均由8個(gè)糖殘基組成。根據(jù)HSQC譜圖分析，RG-I 區(qū)域具有多種Ara 和Gal 類型（圖5d），1→5 和1→t 連接的α-Ara 殘基且面積比分別為56.4%和43.6%，說明UHP 4-5-0.3 存在一定量的α-1,5-Arab伴隨著α-1,t-Arab 側(cè)鏈，故UHP 4-5-0.3 中存在四種連接形式(1→4、1→6、1→3,6 與1→3)的Gal 殘基，且28×10-6/92.23×10-6的H-1/C-1 信號(hào)為糖殘基中的還原端。3.70×10-6歸屬于酯化GalA基團(tuán)羧基部分的甲氧基，與CP 相比UHP 4-5-0.3 的信號(hào)強(qiáng)度弱，表明降解后的產(chǎn)物DM 值降低。GalA 上O-6 取代的甲酯殘基的相關(guān)峰在4.55×10-6處的信號(hào)也在減弱，進(jìn)一步證實(shí)了DM的變化。

2.5 果膠片段的結(jié)構(gòu)模型

通過化學(xué)和譜圖信息分析，推測出UHP 4-5-0.3 的分子結(jié)構(gòu)如圖6所示。果膠片段中的活性區(qū)域是具有中性糖側(cè)鏈的RG-I 結(jié)構(gòu)域，含有[-α-D-GalA-1,2-α-L-Rha-1-4-]n的雙糖重復(fù)主鏈，分支度達(dá)到32.6%。通過譜圖計(jì)算得到更詳細(xì)的信息，RG-I約有46 條由Rha 連接的側(cè)鏈，且平均側(cè)鏈長達(dá)8 個(gè)糖殘基。果膠片段的高活性與其半乳聚糖側(cè)鏈的數(shù)目和長度緊密相關(guān)，高支化度的分子結(jié)構(gòu)更有利于與Gal-3的多價(jià)結(jié)合作用[30]。而線性HG 結(jié)構(gòu)域是由α-1,4-GalA組成，C-6 羧基處部分甲基化，O-2 和O-3 處輕度乙酰化，它的存在可以增強(qiáng)RG-I 結(jié)構(gòu)域的生物活性[10]。

圖6 果膠片段UHP 4-5-0.3 的結(jié)構(gòu)模型Fig.6 A proposed structural model of the pectin fragment UHP 4-5-0.3

3 結(jié)論

采用酸堿協(xié)同紫外光催化氧化工藝降解柑橘果膠，生成低分子量、低酯化度、RG-I 富集的果膠片段。不同的分子特征的果膠片段結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致其與Gal-3多價(jià)結(jié)合能力不同。基于此，提出活性引導(dǎo)分離的思路，通過果膠活性片段與Gal-3 特異性結(jié)合的G3H 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，篩選出結(jié)合能力強(qiáng)的果膠片段UHP 4-5。通過CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了所選片段對多株腫瘤細(xì)胞顯著的增殖抑制作用，證實(shí)果膠片段通過對Gal-3 的拮抗作用而產(chǎn)生抗腫瘤的潛力。結(jié)構(gòu)分析確定了果膠片段主要是由具有中性糖側(cè)鏈的RG-I 結(jié)構(gòu)域和線性HG 結(jié)構(gòu)域組成。本研究獲得一種結(jié)構(gòu)明確的高抗腫瘤活性的果膠片段，也為探尋高活性的Gal-3 多糖拮抗劑提供了新的思路。