魏鑫，杜勇，賴曉琴，冷銀江，陳曉姣，謝李明，喻康杰，馬懿*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005；2.四川省釀酒專用糧工程技術(shù)研究中心，四川 宜賓 644000；3.五糧液集團(tuán)有限公司，四川 宜賓 644000）

獼猴桃又名奇異果，富含維生素C、維生素A、氨基酸、可溶性膳食纖維、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[1-3]。除此之外，獼猴桃還富含黃酮類、多酚類、萜類等活性成分[4-6]，具有抗氧化、抗衰老、預(yù)防心血管疾病等多種功能[7-8]。獼猴桃果酒作為獼猴桃精深加工產(chǎn)品之一，具有獨(dú)特的風(fēng)格，市場(chǎng)前景廣闊[9-10]。但單一的獼猴桃發(fā)酵果酒存在風(fēng)味淡薄、香氣不突出等問(wèn)題。為了改善獼猴桃果酒風(fēng)味淡薄的問(wèn)題，將獼猴桃與紅茶混合發(fā)酵，在酒香的基礎(chǔ)上賦予茶香，使果酒香氣更加馥郁。

近年來(lái)，對(duì)茶酒的研發(fā)引起人們的重視，將茶葉應(yīng)用于釀造低度酒，如天麻茶酒[11]、檸檬茶酒[12]、卷丹百合茶酒[13]等。將水果與茶葉結(jié)合研發(fā)新型果茶酒是現(xiàn)在茶酒行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)，與傳統(tǒng)茶酒相比，新型果茶酒兼具茶香與果香的特點(diǎn)。目前，以獼猴桃和紅茶為原料進(jìn)行發(fā)酵所制果茶酒的研究鮮有報(bào)道，且兩者結(jié)合是否能在豐富口感的基礎(chǔ)上增加其抗氧化活性也是待解決的主要問(wèn)題。

綜上，本試驗(yàn)以獼猴桃和紅茶為主要原料，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化獼猴桃茶酒的生產(chǎn)工藝并對(duì)獼猴桃茶酒抗氧化活性進(jìn)行研究。本研究基于獼猴桃和茶均具有極高的食用價(jià)值，將兩者結(jié)合以提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，以期獲得一款感官特性優(yōu)良且具有較強(qiáng)抗氧化活性的新型茶酒，為獼猴桃與紅茶資源綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃、白砂糖、紅茶：市售；釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（初始酶活500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀（食品級(jí)）、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%）：成都市科龍化工實(shí)劑廠；福林酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JYZ-E25榨汁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；GZ-250-HS11培養(yǎng)箱：廣智科技設(shè)備有限公司；STARTER 2C pH計(jì)：奧豪斯儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；AR1140電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 獼猴桃茶酒工藝流程

獼猴桃茶酒工藝流程見(jiàn)圖1。

圖1 獼猴桃茶酒工藝流程Fig.1 Processing technology of kiwifruit tea wine

將獼猴桃中的雜質(zhì)等異形物去除，挑選無(wú)損傷的獼猴桃，清洗、去皮榨汁待用，果膠酶添加量為60 mg/L。1 g紅茶用100 mL水浸泡，在超聲功率300 W、超聲溫度80℃條件下，茶葉超聲提取15 min得到紅茶。前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，獼猴桃與茶汁體積比為1∶1發(fā)酵，酒香更加充盈。因此，后續(xù)試驗(yàn)將超聲提取后的紅茶與獼猴桃果汁以體積比1∶1混合，用250mL錐形瓶發(fā)酵，加入白砂糖調(diào)整糖度，添加偏重亞硫酸鉀160 mg/L，添加檸檬酸調(diào)整發(fā)酵液pH值。酵母活化，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的糖水中加入活性干酵母，其中酵母與糖水比為1∶30（g/mL），37℃保溫30 min。發(fā)酵結(jié)束后，過(guò)濾獼猴桃茶酒，并于65℃水浴保溫30 min，進(jìn)行巴氏滅菌。

1.3.2 獼猴桃茶酒工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 酵母接種量對(duì)獼猴桃茶酒的影響

在初始發(fā)酵pH值為3.5、初始糖度20°Brix、獼猴桃與茶汁體積比為1∶1時(shí)，調(diào)整不同酵母接種量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%），26℃恒溫發(fā)酵 7 d，考察酵母接種量對(duì)獼猴桃茶酒的影響。

1.3.2.2 初始糖度對(duì)獼猴桃茶酒的影響

在初始發(fā)酵pH值為3.5、酵母接種量0.1%、獼猴桃與茶汁體積比為1∶1時(shí)，調(diào)整不同糖度（17、19、21、23、25 °Brix），26 ℃恒溫發(fā)酵 7 d，考察初始糖度對(duì)獼猴桃茶酒的影響。

1.3.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)獼猴桃茶酒的影響

在初始發(fā)酵pH值為3.5、酵母接種量0.1%、初始糖度20°Brix、獼猴桃與茶汁體積比為1∶1時(shí)，調(diào)整不同發(fā)酵溫度（22、24、26、28、30 ℃），恒溫發(fā)酵 7 d，考察發(fā)酵溫度對(duì)獼猴桃茶酒的影響。

1.3.2.4 發(fā)酵pH值對(duì)獼猴桃茶酒的影響

在酵母接種量0.1%、初始糖度20°Brix、獼猴桃與茶汁體積比為1∶1時(shí)，調(diào)整不同初始初始發(fā)酵pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0），26 ℃恒溫發(fā)酵 7 d，考察初始發(fā)酵pH值對(duì)獼猴桃茶酒的影響。

1.3.3 獼猴桃茶酒工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案，確定最佳工藝條件組合。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.3.4 獼猴桃茶酒抗氧化活性分析

以0.3%維生素C溶液為陽(yáng)性對(duì)照，獼猴桃茶酒稀釋20倍，測(cè)定獼猴桃茶酒的DPPH自由基、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS] 陽(yáng)離子自由基、·OH清除能力和鐵離子還原能力，探究獼猴桃茶酒的抗氧化活性。

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

DPPH自由基清除能力參考金海炎等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

ABTS+自由基清除能力參考吳雙從等[15]的方法測(cè)定。

1.3.4.3 ·OH清除能力測(cè)定

·OH清除能力參考程宏楨等[16]的方法測(cè)定。

1.3.4.4 還原能力測(cè)定

還原能力參考程宏楨等[16]的方法測(cè)定。

1.3.4.5 總酚、總黃酮含量的測(cè)定

總酚含量采用福林酚法[17]測(cè)定。以沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：y=0.235 1x-0.007 3，y為吸光度，x為沒(méi)食子酸含量（mg/mL），相關(guān)系數(shù) R2=0.996 9。

總黃酮含量參考李少鵬等[18]的方法測(cè)定。以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：y=0.189 8x-0.0177，y為吸光度，x為蘆丁含量（mg/mL），相關(guān)系數(shù)R2=0.996 4。

1.4 理化指標(biāo)與感官指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 理化指標(biāo)的測(cè)定

總酸含量參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行測(cè)定[19]；酒精度采用酒精計(jì)測(cè)定；pH值采用pH計(jì)測(cè)定；可溶性固形物含量采用手持糖度計(jì)測(cè)定。

1.4.2 感官評(píng)定

挑選12名經(jīng)過(guò)品評(píng)專業(yè)培訓(xùn)人員組成品評(píng)小組，感官評(píng)分參考葡萄酒與果酒評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 獼猴桃茶酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory scoring criteria of kiwifruit tea wine

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010處理數(shù)據(jù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次；使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；使用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃茶酒單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酵母接種量對(duì)獼猴桃茶酒品質(zhì)的影響

酵母接種量對(duì)獼猴桃茶酒品質(zhì)的影響見(jiàn)表3。

表3 酵母接種量對(duì)獼猴桃茶酒品質(zhì)的影響Table 3 Effect of yeast inoculation amount on the quality of kiwifruit tea wine

由表3可知，獼猴桃茶酒的感官評(píng)分隨著酵母接種量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。酵母接種量為1.0%時(shí)，感官評(píng)分最高，為77.84，且顯著高于其它接種量的感官評(píng)分（p＜0.05）。酵母接種量對(duì)獼猴桃茶酒精度影響較大，不同處理組間差異顯著（p＜0.05）。酵母接種量直接影響茶酒的品質(zhì)，這是由于酵母接種量過(guò)大，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)過(guò)快，快速代謝大量副產(chǎn)物，進(jìn)而對(duì)酒的風(fēng)味產(chǎn)生不良影響[20]。而酵母接種量過(guò)小會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵不充分，發(fā)酵速率慢，酒精轉(zhuǎn)換量低。因此，選擇酵母菌接種量0.8%、1.0%、1.2%用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 初始糖度對(duì)獼猴桃茶酒品質(zhì)的影響

初始糖度對(duì)獼猴桃茶酒品質(zhì)的影響見(jiàn)表4。

表4 初始糖度對(duì)獼猴桃茶酒品質(zhì)的影響Table 4 Effect of initial sugar content on the quality of kiwifruit tea wine

由表4可知，隨著初始糖度的升高，獼猴桃茶酒感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。初始糖度為23°Brix時(shí)，感官評(píng)分最高，為79.46，且顯著高于其它組（p＜0.05）；當(dāng)初始糖度為 17 °Brix～25 °Brix時(shí)，酒精度隨著初始糖度的增加呈上升的趨勢(shì)。當(dāng)初始糖度為25°Brix時(shí)，其酒精度為 12.09%vol，顯著高于其它組（p＜0.05）。糖作為酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的能源物質(zhì)，決定了酵母新陳代謝的快慢，從而影響發(fā)酵進(jìn)程及酒精生產(chǎn)。但糖度過(guò)高，會(huì)影響酒的感官品質(zhì)[21]，基質(zhì)中糖度過(guò)高可能會(huì)對(duì)其它微生物活動(dòng)產(chǎn)生不利影響。因此，選擇初始糖濃度 21、23、25 °Brix用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)獼猴桃茶酒品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對(duì)獼猴桃茶酒品質(zhì)的影響見(jiàn)表5。

表5 不同發(fā)酵溫度對(duì)獼猴桃茶酒品質(zhì)的影響Table 5 Effect of fermentation temperature on the quality of kiwifruit tea wine

由表5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，獼猴桃茶酒的感官評(píng)分與酒精度均呈先上升后下降的趨勢(shì)。發(fā)酵溫度為26℃時(shí)，酒精度達(dá)到最高值11.58%vol，而感官評(píng)分在28℃時(shí)達(dá)到最大值78.61，發(fā)酵溫度對(duì)獼猴桃茶酒精度影響較大，不同處理組差異顯著（p＜0.05）。發(fā)酵溫度越高，獼猴桃茶酒揮發(fā)性香氣成分越容易損失，所以發(fā)酵溫度的升高不利于酒的感官品質(zhì)；由于26℃與28℃時(shí)的獼猴桃茶酒感官評(píng)分差異不大，且酵母生長(zhǎng)代謝有最適溫度區(qū)間，過(guò)高或過(guò)低的溫度均會(huì)影響酵母生長(zhǎng)代謝，不利于酒精的生產(chǎn)轉(zhuǎn)化[22]。因此，選擇發(fā)酵溫度24、26、28℃用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 初始發(fā)酵pH值對(duì)獼猴桃茶酒品質(zhì)的影響

初始發(fā)酵pH值對(duì)獼猴桃茶酒品質(zhì)的影響見(jiàn)表6。

表6 初始發(fā)酵pH值對(duì)獼猴桃茶酒品質(zhì)的影響Table 6 Effect of initial pH on the quality of kiwifruit tea wine

由表6可知，獼猴桃茶酒的感官評(píng)分與酒精度隨著pH值的升高均呈先升高后下降的趨勢(shì)。pH值為3.5時(shí)，獼猴桃茶酒的酒精度和感官評(píng)分均為最高值，分別為11.38%vol和77.53，與其他各組差異顯著（p＜0.05）。但當(dāng)pH值高于3.5時(shí)，獼猴桃茶酒的酒精度與感官評(píng)分均迅速下降，可能是由于pH值的升高，會(huì)導(dǎo)致獼猴桃茶酒發(fā)生不良化學(xué)反應(yīng)，如氧化褐變。因此，選擇初始發(fā)酵pH3.0、3.5、4.0用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酵母接種量（A）、初始糖度（B）、發(fā)酵溫度（C）和初始發(fā)酵 pH 值（D）4個(gè)因素，以感官評(píng)分與酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)獼猴桃茶酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果分析見(jiàn)表7。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Orthogonal test results

續(xù)表7 正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 7 Orthogonal test results

由表7可知，以酒精度和感官評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)的最優(yōu)組合分別為A2B2C1D3和A3B1C2D3，由極差R可知，影響獼猴桃茶酒酒精度和感官評(píng)價(jià)因素主次順序分別為 C＞A＞B＞D，C＞A＞D＞B；綜合考慮酒精度與感官評(píng)分，獼猴桃茶酒工藝的理論最優(yōu)組合為A2B2C2D3（驗(yàn)證組）。由L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果可知A2B1C2D3組合酒精度與感官評(píng)分均為最高，因此，將直觀分析所得的最優(yōu)組合A2B1C2D3作為對(duì)照組和由均值k得到的理論最優(yōu)組合A2B2C2D3作為驗(yàn)證組同時(shí)進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 8 Data of validation test

由表8可知，A2B2C2D3（驗(yàn)證組）的感官評(píng)分與酒精度均大于A2B1C2D3（對(duì)照組）。綜合上述分析，確定正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A2B2C2D3，即最佳獼猴桃茶酒生產(chǎn)工藝條件為酵母接種量1.0%、發(fā)酵溫度26℃、初始糖度23°Brix、初始發(fā)酵pH4。該工藝條件發(fā)酵后的獼猴桃茶酒酒精度為11.9%vol，感官評(píng)分為80.4。

3 獼猴桃茶酒的理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

3.1 理化指標(biāo)結(jié)果

最優(yōu)工藝條件發(fā)酵所得的獼猴桃茶酒的可溶性固形物含量 8.5 °Brix、酒精度 11.9%vol、總酸含量7.7 g/L、pH3.8、總酚含量1.57 mg/mL、總黃酮含量0.84 mg/mL。獼猴桃茶酒外觀呈黃色，清亮透明，有光澤；具有優(yōu)雅的獼猴桃果香氣，茶香、酒香和諧；口感鮮美，醇和、爽口柔和，酸度適宜；酒體較協(xié)調(diào)，具有果酒的典型風(fēng)格。綜上，根據(jù)正交試驗(yàn)所得最優(yōu)發(fā)酵條件生產(chǎn)的獼猴桃茶酒的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)均符合國(guó)標(biāo)要求。

3.2 抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果

抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 獼猴桃茶酒的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of kiwifruit tea wine

由圖2（a）可知，獼猴桃茶酒DPPH自由基清除率隨著獼猴桃茶酒用量增加而逐漸升高，在獼猴桃茶酒超過(guò)0.8 mL時(shí)抗氧化能力大于維生素C，此時(shí)的DPPH自由基清除率為93.7%，且在獼猴桃茶酒使用量超過(guò)0.8 mL時(shí)，其抗氧化能力逐漸趨于平緩，僅有輕微的上下浮動(dòng)。

由圖2（b）可知，獼猴桃茶酒ABTS+自由基清除率隨著獼猴桃茶酒用量增加而逐漸升高，在樣品用量超過(guò)1.6 mL時(shí)抗氧化能力與維生素C溶液的抗氧化能力接近，ABTS+自由基的清除率為93.4%。當(dāng)樣品用量低于1.6 mL時(shí)，維生素C溶液ABTS+自由基的清除率優(yōu)于發(fā)酵的獼猴桃茶酒。

由圖2（c）可知，獼猴桃茶酒·OH清除率在樣品用量為0.2 mL～1.6 mL時(shí)，隨著獼猴桃茶酒樣品用量的增加，抗氧化能力明顯增強(qiáng)，在樣品用量1.6 mL時(shí)，獼猴桃茶酒·OH清除率為試驗(yàn)組內(nèi)·OH自由基清除率的最大值，此時(shí)·OH的清除率為78.78%。維生素C溶液·OH的清除率一直優(yōu)于發(fā)酵的獼猴桃茶酒。

由圖2（d）可知，獼猴桃茶酒還原能力隨著樣品用量的增加呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。在獼猴桃茶酒樣品用量為1.6 mL時(shí)，吸光度為0.947，與VC還原能力相當(dāng)。還原能力的變化趨勢(shì)區(qū)別于其他抗氧化指標(biāo)的變化趨勢(shì)可能與其抗氧化機(jī)制有關(guān)，其檢測(cè)原理是抗氧化物質(zhì)將三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵，二價(jià)鐵與2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪生產(chǎn)藍(lán)色物質(zhì)，在593 nm處有最大吸收，吸光度越大表明獼猴桃茶酒的抗氧化性越高。

4 結(jié)論

以獼猴桃和紅茶為原料，獼猴桃茶酒的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為酵母接種量1.0%、獼猴桃果汁與紅茶湯體積比1∶1、初始發(fā)酵pH值為4、初始糖度23°Brix，26℃發(fā)酵7 d，發(fā)酵制成獼猴桃紅茶復(fù)合茶酒DPPH自由基、ABTS+自由基清除率均大于90%，總酚含量達(dá)到1.57 mg/mL，獼猴桃茶酒兼具獼猴桃果香與紅茶清香，使兩者在營(yíng)養(yǎng)、香氣及口感上互補(bǔ)且具有一定的抗氧化性。獼猴桃紅茶復(fù)合茶酒的研發(fā)為茶酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展開辟了新途徑，對(duì)豐富獼猴桃產(chǎn)品及開發(fā)新型的茶酒具有一定的研究意義。