葉樹才，侯銀臣，，閆東旭，完顏紅影，楊盛茹，梁金明，曹必好

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.中山市農(nóng)業(yè)科技推廣中心，廣東 中山 528403；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046）

長根菇（Oudemansiella radicata）又名黑皮雞樅菌、姬白蟻菌、蟻樅等，屬于擔(dān)子菌亞門，傘菌目，白蘑科，

富含氨基酸、三萜類、糖類、多酚等多種營養(yǎng)和生物活性成分[1-4]。具有免疫調(diào)節(jié)[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化[7]等多種生理功能。植物多酚是植物新陳代謝過程中產(chǎn)生的化學(xué)成分，主要存在于植物的根、樹皮、樹葉和果實中，是一種重要的生物活性成分[8]。多酚中的大多數(shù)處于游離狀態(tài)屬于游離酚，另外一些則與其他物質(zhì)結(jié)合為結(jié)合酚[9]。國內(nèi)外研究表明多酚具有多種活性功能，如抑制細(xì)菌[10]、抗氧化[11-12]、抗癌[13]、抗炎[14]、抗病毒[15]和改善情緒[16]等。

本文主要通過超聲輔助浸提長根菇多酚，采用響應(yīng)面法對提取工藝進行優(yōu)化，并考察其對·OH、DPPH·和ABTS+·的清除能力，為長根菇活性成分的提取以及在各種抗氧化功能食品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑設(shè)備

長根菇：中山市高校畢業(yè)生創(chuàng)業(yè)農(nóng)業(yè)孵化基地。酒石碳酸鉀鈉：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑：上海羅恩試劑有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；過硫酸鉀：廣州凌飛化工有限公司；沒食子酸：合肥千盛生物科技有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：合肥巴斯夫生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，以上試劑均為分析純。

MTQ 500電子天平：深圳市美孚電子有限公司；TG16-WS高速臺式離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV759CRT紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；8812電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：蘇州昇遠(yuǎn)科技有限公司；3S超聲波反應(yīng)器：蘇州江大五棵松生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 長根菇多酚的提取

將長根菇干制品放置于干燥箱中，烘干至恒重，過80目篩后置于密封袋在干燥條件下保存，采用超聲輔助法提取多酚。在前期預(yù)試驗基礎(chǔ)上，稱取適量長根菇粉末，按照試驗條件加入一定濃度的乙醇溶液，置于超聲波反應(yīng)器，在超聲功率300 W、頻率28 kHz、溫度40℃條件下提取多酚，設(shè)置不同的時間，超聲提取后5 000 r/min離心15 min，取上清液，用福林-酚比色法測定上清液的多酚含量。

1.2.2 多酚含量的測定

采用福林-酚比色法測定長根菇多酚的含量，參考郭鴻儒[17]的方法，略作修改。配制5 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至25 mL，加入0.2 mL福林酚，搖勻后反應(yīng)3 min～8 min，再依次加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的NaCO3溶液?；靹蚝蠓磻?yīng)1 h，760 nm處測定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到線性回歸方程為y=21.112x-0.279 3，其中R2=0.9926，y為吸光度，x為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度。樣品中多酚含量按照公式（1）計算。

式中：M表示樣品多酚含量，mg/g；X表示按一定比例稀釋后的樣品根據(jù)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的質(zhì)量濃度，g/mL；m表示樣品質(zhì)量，g；V表示樣品液定容體積，mL；N表示樣品液稀釋倍數(shù)。

1.2.3 長根菇多酚提取工藝條件優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗

以長根菇多酚得率為指標(biāo)，分別考察液料比[10∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）]、乙醇濃度（25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%）、超聲時間（30、60、90、120、150 min）對長根菇多酚得率的影響，以確定最佳單因素水平。

1.2.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以長根菇多酚得率為響應(yīng)值，對提取工藝條件進行響應(yīng)面優(yōu)化。響應(yīng)面試驗設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 Levels and factors of Box-Behnken design

1.2.4 長根菇多酚的體外抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH自由基清除率的測定

參考Hou等[18]的方法測定長根菇多酚的DPPH自由基清除率。取2.0mL不同濃度的長根菇多酚提取液，依次加入2mL0.2mmol/LDPPH自由基溶液，室溫25℃下混合靜置反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測定吸光度記為Ai，空白對照為2.0 mL蒸餾水，吸光度記為Aj，另一空白對照為2.0 mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液，吸光度記為A0。DPPH·清除率按照公式（2）計算。

1.2.4.2 ABTS+·清除率的測定

參考張友維[19]的方法，略作修改。乙醇調(diào)零，長根菇多酚提取液和VC配制成不同濃度測定其ABTS+·清除率。先準(zhǔn)確吸取3 mL ABTS溶液和1 mL不同濃度的樣品分別加入試管中，混勻后避光反應(yīng)5 min，在734 nm處測得吸光度記為Rj；再使用移液槍準(zhǔn)確吸取1 mL乙醇溶液和3 mL ABTS溶液加入試管中，混勻后避光反應(yīng)5 min，在734 nm處測得吸光度記為Rk。ABTS+·清除率按照公式（3）計算。

1.2.4.3 ·OH清除率的測定

參照劉皓涵等[20]的方法，略作修改。將樣品用蒸餾水稀釋至不同濃度，取5.0 mL待測液與3.0 mL 0.3 mmol/mL FeSO4、2.0 mL 0.3 mmol/mL 水楊酸-乙醇和0.1 mL 0.03%H2O2混勻后37℃靜置反應(yīng)10 min，空白不添加H2O2溶液，在510 nm處測其吸光度記為A1；空白蒸餾水的吸光度記為A0。羥基自由基清除率按照公式（4）計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，試驗計量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 長根菇多酚提取工藝條件研究

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1.1 液料比對長根菇多酚得率的影響

以多酚得率為指標(biāo)，固定超聲時間為60 min、乙醇濃度為75%，確定不同液料比對長根菇多酚提取量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 液料比對長根菇多酚得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of polyphenols

由圖1可知，在一定液料比范圍內(nèi)，長根菇多酚得率隨著溶劑體積的增大而升高，在液料比為50∶1（mL/g）時，多酚得率達(dá)到最高水平，為6.57%，當(dāng)液料比超過50∶1（mL/g）時，多酚得率無明顯變化。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是乙醇作為提取溶劑，有利于多酚的溶解，隨著溶劑體積的增加，多酚得率也會上升。但隨著溶劑體積的增加，過多的乙醇在提取多酚的同時還會溶出其他成分，因此提取長根菇多酚的最適液料比為50 ∶1（mL/g）。

2.1.1.2 超聲時間對長根菇多酚得率的影響

以多酚得率為指標(biāo)，固定液料比為50∶1（mL/g），乙醇濃度為75%，確定不同超聲時間對長根菇多酚提取量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時間對長根菇多酚得率的影響Fig.2 Effect of sonication time on the yield of polyphenols

由圖2可知，超聲時間為30 min～60 min時，長根菇多酚得率隨著超聲時間的延長而升高，超聲時間為60 min時，多酚得率達(dá)到最高水平，為6.58%，當(dāng)超聲時間超過60 min后，多酚得率明顯降低。這可能是超聲時間過長會破壞長根菇多酚類物質(zhì)中的鄰二酚羥基等基團，從而導(dǎo)致多酚提取量下降，因此提取長根菇多酚的最佳超聲時間為60 min。

2.1.1.3 乙醇濃度對對長根菇多酚得率的影響

以多酚得率為指標(biāo)，固定液料比為50∶1（mL/g）、超聲時間為60 min，研究不同乙醇濃度對長根菇多酚提取量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 乙醇濃度對長根菇多酚得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols

由圖3可知，乙醇濃度為25%～45%時，隨著乙醇濃度的增加，多酚得率不斷升高，而且呈現(xiàn)較快的增長速度，當(dāng)乙醇濃度為45%時，多酚得率最高，為9.12%，隨后下降。原因可能是乙醇濃度過高時，多酚與溶劑的極性相差很大，蛋白質(zhì)變性沉淀，同時會有大量脂溶性、醇溶性物質(zhì)溶解，導(dǎo)致酚類化合物的溶解度降低，因此選擇最佳乙醇濃度為45%。

2.1.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，對長根菇多酚提取工藝條件進行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，回歸模型的方差分析數(shù)據(jù)見表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance in response surface

對試驗結(jié)果進行二次回歸分析，計算得到回歸方程：R=8.86+1.16A-0.075B+0.19C+0.32AB+0.25AC-0.025BC-0.31A2-2.935B2-1.45C2。由表3可知，此模型的P＜0.000 1，表明長根菇多酚得率的回歸模型的結(jié)果極顯著。失擬項F值為0.95，由此可以看出回歸模型的計算結(jié)果和檢驗結(jié)果的差異并沒有表現(xiàn)出顯著性?；貧w模型的總決定系數(shù)R2=0.995 1，顯示該試驗?zāi)Ｐ涂煽?；其修正相關(guān)系數(shù)R2adj=0.988 9，變異系數(shù)CV為3.08%，表明長根菇多酚得率的回歸模型擬合性好，可以較好地預(yù)測長根菇多酚得率試驗結(jié)果。綜上所述，該模型可被用于分析和預(yù)測長根菇多酚的最佳提取工藝。由表3可知，液料比對長根菇多酚得率影響極顯著，超聲時間對多酚得率影響顯著，乙醇濃度對多酚得率影響不顯著。對比3個因素的F值的大小，可以推測出3個試驗因素對多酚得率的影響順序為液料比（A）＞超聲時間（C）＞乙醇濃度（B）。

2.1.3 響應(yīng)面試驗的交互因素分析

分別將模型中的一個因素固定在中間水平，得到另外2個因素交互作用對多酚得率影響的子模型，并根據(jù)模型繪制三維曲面圖，見圖4。

圖4 液料比、乙醇濃度和超聲時間交互作用對長根菇多酚得率的影響Fig.4 Effect of interaction of liquid-to-material ratio，ethanol concentration，and sonication time on the yield of polyphenols

由圖4可知，當(dāng)液料比不變時，隨著乙醇濃度的增大，多酚得率呈先上升后下降的趨勢；當(dāng)乙醇濃度不變時，隨著溶劑體積的變化，多酚得率逐漸增加；當(dāng)液料比不變時，隨著超聲時間的逐漸延長，多酚得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；當(dāng)超聲時間保持不變時，隨著溶劑體積的增加，多酚得率逐漸升高；當(dāng)乙醇濃度保持不變時，隨著超聲時間的延長，多酚得率呈先上升后下降的趨勢；當(dāng)超聲時間保持不變時，隨著乙醇濃度的增加，多酚得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

根據(jù)Design-Expert軟件優(yōu)化，得到長根菇多酚提取的最佳工藝條件為乙醇濃度45%、超聲時間65 min、液料比50∶1（mL/g），在該條件下，長根菇多酚的得率可達(dá)到9.76 mg/g。為檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，采用以上得到的最佳提取條件提取3次，實際得到長根菇多酚的平均得率為9.82 mg/g，與預(yù)測值擬合率為99.39%，表明預(yù)測值和實際值良好吻合，優(yōu)化模型可靠。

2.2 長根菇多酚體外抗氧化活性

2.2.1 ABTS+·清除能力

長根菇多酚的ABTS+·清除率如圖5所示。

圖5 長根菇多酚與VC的ABTS+·清除能力Fig.5 ABTS+·scavenging rate of VCand polyphenols

由圖5可知，多酚與VC的ABTS+·清除率均隨濃度的升高而升高，具有明顯的濃度依賴性。多酚與VC的ABTS+·清除率的IC50分別為280 μg/mL和170 μg/mL，多酚的ABTS+·清除能力略低于VC，當(dāng)濃度為1 000μg/mL時，多酚與VC的ABTS+·清除能力基本相同。

2.2.2 ·OH清除能力

長根菇多酚的·OH清除率如圖6所示。

圖6 長根菇多酚與VC的·OH清除能力Fig.6·OH scavenging rate of VCand polyphenols

由圖6可知，多酚與VC對·OH均有較好的清除作用，且均具有明顯的劑量依賴性，當(dāng)濃度為240 μg/mL時，多酚與VC的清除率最高，分別達(dá)到65.68%和79.63%。經(jīng)計算多酚與VC對·OH清除率IC50分別為110.78 μg/mL 和 68.41 μg/mL，說明 VC的·OH 清除能力明顯高于多酚。

2.2.3 DPPH·清除能力

長根菇多酚的DPPH·清除率如圖7所示。

圖7 長根菇多酚與VC的DPPH·清除能力Fig.7 DPPH·scavenging rate of VCand polyphenols

由圖7可知，多酚與VC的DPPH·清除率隨濃度的增加逐漸上升，當(dāng)濃度大于200 μg/mL時，多酚的DPPH·清除率增長緩慢。當(dāng)濃度為300 μg/mL時，多酚與VC的DPPH·清除率分別為60.56%和95.71%。經(jīng)計算多酚與VC的DPPH·清除率IC50分別為178.78 μg/mL和30.24 μg/mL，多酚的DPPH·自由基清除能力明顯小于 VC。

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到長根菇多酚的最佳提取工藝條件為乙醇濃度45%、超聲時間 65 min、液料比 50 ∶1（mL/g），在該條件下，長根菇多酚的得率達(dá)到9.82 mg/g；體外抗氧化研究表明，長根菇多酚具有較好的ABTS+·、·OH和DPPH·清除能力，且呈現(xiàn)劑量依賴性，其IC50分別為280、110.78μg/mL和 178.78 μg/mL，其中當(dāng)濃度為 1 000 μg/mL 時多酚與VC的ABTS+·清除能力基本相同，其余濃度條件下均小于VC的ABTS+·、·OH和DPPH·清除能力。該研究為長根菇抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的參考依據(jù)。