滿在偉，崔慧慧，蔣心怡，陳一鳴，鄒祎然，張軒，郭靜*

（1.常州大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.山東恒仁工貿(mào)有限公司，山東 棗莊 277533；3.常州大學(xué)石油化工學(xué)院，江蘇 常州 213164）

傳統(tǒng)麥芽糖是我國(guó)歷史悠久的淀粉糖食品，由麥類在發(fā)芽過程中產(chǎn)生的淀粉酶系水解淀粉制得[1-3]。麥芽中的淀粉酶主要有α-淀粉酶[4]、β-淀粉酶[5]和極限糊精酶等，多種淀粉酶的協(xié)同作用能夠高效地將淀粉水解成麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖和葡聚糖等多種糖分[3，6-9]。相比蔗糖、葡萄糖等精制糖，傳統(tǒng)麥芽糖由麥、米等谷物轉(zhuǎn)化而來(lái)，谷物中的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等基本保留，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，適宜大部分人群食用[2]。近年來(lái)，糖尿病患病人數(shù)持續(xù)增加。研究表明，人體持續(xù)性攝入過量的可消化糖能夠引起糖尿病及其并發(fā)癥[10-12]。傳統(tǒng)麥芽糖食品可消化糖含量高，不能滿足目前人們低糖、健康的飲食需求。

低聚異麥芽糖是一類含有一個(gè)或多個(gè)α-1，6糖苷鍵的低聚葡萄糖[13]。低聚異麥芽糖由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)，不能被口腔菌群發(fā)酵產(chǎn)酸，具有抗齲齒功能。同時(shí)，人體胃和腸道不能有效降解吸收低聚異麥芽糖，攝入低聚異麥芽糖不會(huì)升高血糖水平。并且低聚異麥芽糖能夠增殖腸道雙歧桿菌、提高腸道益生菌菌群占比，有利于機(jī)體健康。因此，低聚異麥芽糖是一種集甜味和保健功能于一體的功能性低聚糖[14-16]。另外，低聚異麥芽糖保濕性和黏度適中，適用于食品加工，糖果和糕點(diǎn)等食品中添加低聚異麥芽糖對(duì)食品質(zhì)構(gòu)無(wú)不良影響[17-18]。異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖也稱為“有效三糖”，是低聚異麥芽糖的主要功能成分[19]。低聚異麥芽糖目前主要采用酶法催化生產(chǎn)[13-15]，以淀粉為原料，將淀粉酶法水解成麥芽糖，然后利用α-葡萄糖苷酶催化麥芽糖生成低聚異麥芽糖[20-22]。

本研究對(duì)傳統(tǒng)麥芽糖制備過程中麥芽淀粉酶活性、糖化過程還原糖種類和含量等參數(shù)進(jìn)行分析，并在糖化過程中添加α-葡萄糖苷酶，催化糖化液中的麥芽糖轉(zhuǎn)化成低聚異麥芽糖，制作出含有低聚異麥芽糖的傳統(tǒng)麥芽糖食品，旨在為傳統(tǒng)食品利用現(xiàn)代生物技術(shù)提升健康功能提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淮麥16號(hào)新鮮小麥、新鮮大米：市售；3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液：常州市潤(rùn)友商貿(mào)有限公司；改良型Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；葡萄糖、可溶性淀粉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；食品級(jí)α-葡萄糖苷酶（酶活5.0×105U/mL）：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（StabS2型）：上海潤(rùn)度生物科技有限公司；恒溫水浴鍋（HH-1型）：國(guó)華（常州）儀器制造有限公司；離心機(jī)（1-14型）：德國(guó)Sigma公司；研磨機(jī)（YM-B05型）：品羅創(chuàng)新實(shí)業(yè)有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-1200B）：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麥芽培養(yǎng)與米飯制備

新鮮小麥用純凈水清洗3次后于純凈水中浸泡15h。利用育苗盤在20℃下進(jìn)行麥芽培養(yǎng)，育苗盤中加入純凈水浸潤(rùn)小麥，每24h更換1次純凈水。小麥根須長(zhǎng)出后，降低純凈水水位，使小麥根須接觸到水即可。

利用純凈水清洗3次大米，然后加入1.5倍大米質(zhì)量的純凈水，常壓蒸煮30 min。

1.3.2 麥芽淀粉酶活力的測(cè)定

麥芽淀粉酶活力定義：每分鐘催化淀粉水解產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol葡萄糖還原力的還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（1 U）。為了避免麥芽淀粉酶提取過程中由于麥芽研磨程度不同等因素造成的誤差，本研究以每毫克麥芽蛋白中所含淀粉酶的酶活力，即淀粉酶比活力來(lái)分析麥芽培養(yǎng)過程中的淀粉酶活力變化情況。

于麥芽不同培養(yǎng)時(shí)間取適量麥芽加入5倍質(zhì)量的純凈水，研磨機(jī)研磨2 min，研磨液8 000 r/min離心2 min，上清液即為麥芽淀粉酶酶液，用所得酶液進(jìn)行蛋白濃度和淀粉酶活力測(cè)定。

蛋白濃度參照改良型Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。

麥芽淀粉酶活力測(cè)定采用DNS法，以可溶性淀粉為底物[23]。稀釋后的麥芽淀粉酶酶液與2%淀粉溶液按照體積比 1∶1混合，于50℃反應(yīng)10 min，沸水浴10 min終止反應(yīng)。反應(yīng)液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后與DNS溶液按照體積比1∶1混合，沸水浴15 min，冷卻后于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光值。沸水浴失活的麥芽淀粉酶酶液進(jìn)行相同的反應(yīng)，并作為空白對(duì)照。

1.3.3 糖化過程

稱取45 g培養(yǎng)的麥芽加入90 g純凈水，用研磨機(jī)研磨2min，與540g米飯混合均勻。密封并置于48、54、60℃水浴進(jìn)行糖化。糖化過程中將糖化物混合均勻快速取樣，糖化物1 g與5 mL純凈水振蕩混勻，沸水浴10 min用以滅活淀粉酶，然后加純凈水定容至10 mL，充分振蕩獲得糖化物溶液。取出1 mL糖化物溶液8 000 r/min離心2 min，上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后采用DNS法分析糖化物中還原糖總量。適當(dāng)稀釋后的糖化物溶液上清與DNS溶液按照體積比1∶1混合，沸水浴15 min，冷卻后于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光值。

1.3.4 糖化物添加α-葡萄糖苷酶

取50 g糖化混合物于糖化開始分別加入0、15、20、25、30 μL α-葡萄糖苷酶，密封置于 54 ℃水浴進(jìn)行糖化和轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。糖化過程中將糖化物混合均勻快速取樣，糖化物樣品1 g與5 mL純凈水振蕩混勻，沸水浴10 min使淀粉酶和α-葡萄糖苷酶失活，然后加水定容至10 mL，充分振蕩。取出1 mL溶解液8 000 r/min離心2 min，上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后分析糖化液中糖的種類與含量。對(duì)于糖化過程中麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖、低聚異麥芽糖等糖的含量采用液相色譜分析，樣品送至江南大學(xué)分析測(cè)試中心進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥芽培養(yǎng)過程淀粉酶活力分析

麥芽培養(yǎng)過程淀粉酶活力分析如圖1所示。

圖1 麥芽淀粉酶活力Fig.1 The amylase activity in malt

如圖1所示，干小麥（新鮮小麥）淀粉酶活力為6.7 U/mg蛋白，浸泡15 h后淀粉酶活力下降至5.0 U/mg蛋白。這一現(xiàn)象與艾志錄等[24]的研究結(jié)果相似。根據(jù)趙玉錦等[25]和Yu等[4]的研究，這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能為在浸種開始后小麥胚中儲(chǔ)存的淀粉酶被激活，然后輸入到胚乳，在胚乳中淀粉酶吸附到淀粉顆粒上并結(jié)合。在提取淀粉酶離心處理過程中部分吸附到淀粉顆粒上的淀粉酶隨淀粉顆粒沉降，吸附到淀粉顆粒并隨淀粉顆粒沉降的淀粉酶，其酶活力無(wú)法檢出。因此，小麥浸泡后所測(cè)的淀粉酶活力下降。在麥芽培養(yǎng)過程前24 h，麥芽淀粉酶活力由5.0 U/mg蛋白增加至7.0 U/mg蛋白。在麥芽培養(yǎng)24 h～48 h時(shí)，淀粉酶活力增加至23.6 U/mg蛋白，這與艾志錄等[24]和王麗等[26]的研究結(jié)果相似。該結(jié)果表明種子萌發(fā)過程中淀粉酶大量合成。麥芽培養(yǎng)48 h后，淀粉酶活力增加不明顯。因此，選擇培養(yǎng)48 h的麥芽進(jìn)行糖化制備麥芽糖。

2.2 溫度對(duì)糖化過程的影響

已有研究指出，大麥芽中α-淀粉酶最適作用溫度為55℃～60℃，β-淀粉酶最適作用溫度為50℃～55℃[3]。同時(shí)，根據(jù)梁若楠等[27]和高熳熳等[28]對(duì)麥芽糖化工藝條件的研究，本研究選取48、54、60℃進(jìn)行糖化，研究溫度對(duì)糖化過程的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對(duì)糖化過程的影響Fig.2 The effect of temperature on mashing process

如圖2所示，溫度越高糖化速度越快，糖化過程在9 h內(nèi)快速進(jìn)行，還原糖含量快速增加，9 h后糖化速度變慢。糖化12h后，48、54、60℃條件下糖化物中還原糖含量（葡萄糖當(dāng)量）分別為104.5、121.6 g/kg和124.3 g/kg。同時(shí)，54℃和60℃糖化過程相近。48℃低于α-淀粉酶和β-淀粉酶最適催化溫度，因此糖化過程中還原糖含量增加速度較慢。54℃和60℃處于α-淀粉酶和β-淀粉酶最適催化溫度區(qū)間，因此糖化速度較快。9 h后糖化速度變慢，原因可能為1）淀粉酶能夠接觸到的底物淀粉基本被水解完全；2）保溫時(shí)間長(zhǎng)使淀粉酶失活；3）產(chǎn)物濃度過高抑制淀粉酶活性[3]。

2.3 低聚異麥芽糖合成

α-葡萄糖苷酶最適作用溫度為52℃～56℃，因此選擇54℃進(jìn)行糖化和低聚異麥芽糖合成。9 h后糖化物中麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖和3種低聚異麥芽糖的含量見圖3，3種低聚異麥芽糖（異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖）總量見圖4，糖化物中糖的組分分析見圖5。

圖3 糖化物中麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖和3種低聚異麥芽糖的含量Fig.3 The contents of maltose，glucose，maltotriose and three isomalto-oligosaccharides in mashing mixture

圖4 可檢測(cè)糖總量分析Fig.4 The total contents of detectable sugars

圖5 糖化物中糖的組分分析Fig.5 The composition of sugars in mashing mixture

由圖3、圖5可知，不添加α-葡萄糖苷酶的糖化過程產(chǎn)生麥芽糖、葡萄糖和麥芽三糖含量分別為157.5、11.0 g/kg和18.7 g/kg，無(wú)異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖3種低聚異麥芽糖產(chǎn)生（圖3、圖5A）。糖化過程中加入α-葡萄糖苷酶可使麥芽糖和麥芽三糖含量明顯下降，同時(shí)葡萄糖含量明顯增加（圖3、圖5B）。這是由于α-葡萄糖苷酶具有水解糖苷和轉(zhuǎn)糖苷雙重功能，可從α-葡萄糖苷、雙糖、低聚糖等的非還原性末端切開α-1，4糖苷鍵并釋放出葡萄糖，又可將葡萄糖以α-1，6糖苷鍵連接到另一個(gè)葡萄糖或麥芽糖類底物上生成低聚異麥芽糖[20-22]。因此，在麥芽糖、麥芽三糖存在情況下α-葡萄糖苷酶催化合成低聚異麥芽糖會(huì)不可避免地水解麥芽糖和麥芽三糖生成葡萄糖[15]。隨著α-葡萄糖苷酶添加量的增加，體系中低聚異麥芽糖總量逐漸增加，葡萄糖含量逐漸上升，麥芽糖和麥芽三糖的含量逐漸減少。添加 25 μL 和 30 μL α-葡萄糖苷酶低聚異麥芽糖總量相近，因此，50 g糖化混合物中添加25 μL α-葡萄糖苷酶能滿足低聚異麥芽糖合成需求。

不添加α-葡萄糖苷酶，體系中可檢測(cè)總糖量為187.2 g/kg。添加 25 μL α-葡萄糖苷酶后，體系中可檢測(cè)總糖量為165 g/kg，其中麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖總量為79.9 g/kg，異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖總量為85.1 g/kg（圖3）。添加α-葡萄糖苷酶后，體系中可檢測(cè)的糖總量有所下降（圖4）。推測(cè)原因是液相色譜對(duì)體系中的麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖和3種代表性低聚異麥芽糖（異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖）進(jìn)行檢測(cè)，但是在α-葡萄糖苷酶催化過程中也會(huì)產(chǎn)生其他低聚異麥芽糖如異麥芽四糖、異麥芽五糖等。與圖5A相比，圖5B顯示在異麥芽三糖檢測(cè)峰后（12 min～15 min）出現(xiàn)了其他檢測(cè)峰，這些檢測(cè)峰應(yīng)該代表更大分子量的異麥芽四糖、異麥芽五糖等，這部分低聚異麥芽糖含量沒有分析。因此，體系中可檢測(cè)糖總量有所下降[15]。

通過添加α-葡萄糖苷酶，糖化物中麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖總量從187.2 g/kg降至79.9 g/kg，降低57.3%。同時(shí)，糖化物中產(chǎn)生低聚異麥芽糖，其中異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖占可檢測(cè)糖總量的51.6%。該結(jié)果表明在傳統(tǒng)麥芽糖制備過程中引入α-葡萄糖苷酶，與麥芽中的淀粉酶協(xié)同催化，同時(shí)進(jìn)行糖化與轉(zhuǎn)苷作用，將傳統(tǒng)糖化過程產(chǎn)生的麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖等轉(zhuǎn)化成低聚異麥芽糖，可制備含低聚異麥芽糖的傳統(tǒng)麥芽糖食品。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)麥芽糖歷史悠久，至今仍在各地傳統(tǒng)美食中扮演重要角色。但是，傳統(tǒng)麥芽糖不能滿足目前人們對(duì)低糖、健康的飲食需求。本研究對(duì)麥芽中淀粉酶活性進(jìn)行分析，確定合適的發(fā)芽時(shí)間為48 h。結(jié)合糖化過程與α-葡萄糖苷酶適宜作用溫度，確定合適的糖化溫度為54℃。通過分析糖化物中麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖和低聚異麥芽糖含量，確定α-葡萄糖苷酶最優(yōu)添加量為每50 g糖化混合物添加25 μL。通過添加α-葡萄糖苷酶，糖化物中麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖總量從187.2g/kg降至79.9 g/kg，降低57.3%。同時(shí)，糖化物中產(chǎn)生低聚異麥芽糖，其中異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖總量為85.1 g/kg，占可檢測(cè)糖總量的51.6%。糖化物通過后續(xù)加工可制作出直接食用的含低聚異麥芽糖的麥芽糖食品。本研究首次在傳統(tǒng)麥芽糖制作糖化過程中添加α-葡萄糖苷酶，結(jié)果表明α-葡萄糖苷酶的添加可有效將傳統(tǒng)麥芽糖制作糖化過程中產(chǎn)生的可消化糖轉(zhuǎn)化成低聚異麥芽糖，明顯降低可消化糖含量，同時(shí)生成具有保健功能的低聚異麥芽糖。相比直接在傳統(tǒng)麥芽糖制作過程中添加商品化精制的低聚異麥芽糖產(chǎn)品來(lái)制備含低聚異麥芽糖的傳統(tǒng)麥芽糖食品，添加α-葡萄糖苷酶的方法具有低成本優(yōu)勢(shì)，而且添加α-葡萄糖苷酶既能降低可消化糖含量，也不會(huì)對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)成分產(chǎn)生影響，這為傳統(tǒng)食品利用現(xiàn)代生物技術(shù)提升健康功能提供了思路。