孫芹，徐學(xué)欣，鄧肖，劉帥，賈靖，孟繁港，郝天佳，趙長星

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/山東省旱作農(nóng)業(yè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109)

土壤鹽堿化是世界范圍內(nèi)影響植物生長和降低作物生產(chǎn)力的重要因素之一，在全球范圍內(nèi)鹽堿地面積有繼續(xù)擴(kuò)張趨勢[1]。全世界超過8億hm2的農(nóng)業(yè)用地遭受鹽脅迫的危害，我國鹽堿化土壤面積有0.99億hm2[2]。小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物，也是鹽堿地種植的主要作物之一[3]，鹽脅迫通過減少小麥水分吸收影響小麥生長導(dǎo)致產(chǎn)量降低[4]，因此篩選具有抗鹽能力的小麥品種，對(duì)于保證糧食可持續(xù)生產(chǎn)和糧食安全具有重要意義。鹽脅迫下，植物主要通過離子穩(wěn)態(tài)、氣孔調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)、激素平衡和抗氧化防御系統(tǒng)等來抵御鹽分對(duì)植物的傷害[5-6]。光合色素是光合作用中的重要組成部分，鹽脅迫影響葉綠素含量以及光能的吸收和轉(zhuǎn)換，從而抑制植物的光合作用，降低光合同化物積累，甚至?xí)?dǎo)致減產(chǎn)[7]。另外，為避免鹽脅迫下活性氧過量積累，植物形成了一套去除、中和及捕獲活性氧的防御機(jī)制，這種防御機(jī)制由抗氧化酶和非酶抗氧化劑組成[8]。清除活性氧最主要的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等[9]。前人在花生、玉米和蘿卜等研究中均表明，鹽脅迫下耐鹽性品種會(huì)增強(qiáng)抗氧化酶的活性以降低鹽傷害[10]。鹽脅迫下，植物體通過增加酚類和黃酮類等非酶物質(zhì)含量來降低活性氧水平[11]。盡管小麥耐鹽性已取得一些進(jìn)展，但對(duì)于不同小麥品種間抗氧化特性差異的相關(guān)研究還較少。本研究以前期篩選出的4個(gè)不同耐鹽性小麥品種為材料，研究不同NaCl濃度下小麥生長發(fā)育、光合色素、抗氧化酶活性、總酚和總黃酮含量的變化及差異，明確鹽脅迫下不同小麥品種抗氧化特性及耐鹽性相關(guān)機(jī)制，為小麥耐鹽品種的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為4個(gè)冬小麥品種(分別是‘冀麥32’‘泰農(nóng)18’‘德抗961’‘師欒02-1’)。試驗(yàn)于2019年9月至2020年3月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科研溫室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將均勻飽滿的小麥種子用體積分?jǐn)?shù)3% H2O2消毒15 min，再用蒸餾水沖洗3次，放置于培養(yǎng)皿中。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d后，選取長勢一致的幼苗移植于裝有霍格蘭氏(Hoagland)全營養(yǎng)液的塑料方盒中培養(yǎng)。材料培養(yǎng)在精控科研溫室中，相對(duì)濕度65%、光照周期為13 h/11 h(白天/夜晚)，白天溫度為25 ℃，光量子通量密度為400 μmol·s-1·m-2，夜晚溫度為12 °C。待小麥生長至三葉一心，對(duì)其進(jìn)行NaCl濃度為0(對(duì)照)、100、200 mmol·L-1(用霍格蘭氏營養(yǎng)液配置NaCl溶液)的鹽脅迫處理，每個(gè)處理6次重復(fù)，試驗(yàn)期間每3 d換一次處理液，脅迫7 d后進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.2.2 生長指標(biāo)的測定

于幼苗鹽脅迫處理后第7天，分別取幼苗莖葉部和根部，置于烘箱105 ℃下殺青30 min后，80 ℃烘干至恒重，稱量各部位干質(zhì)量。

1.2.3 葉綠素含量的測定

稱取0.1 g小麥幼苗新展開葉，用無水乙醇和丙酮(體積比為1∶1)混合溶液25 mL浸泡，避光浸提24 h。然后用分光光度計(jì)(Ultrospec 7000，美國GE)分別在波長647 nm和663 nm下測定吸光度值，參照Lichtenthaler等[12]的方法計(jì)算葉綠素a含量、葉綠素b含量、總?cè)~綠素含量和葉綠素a/b值。

1.2.4 抗氧化酶活性的測定

參照王愛國等[13]的方法測定SOD活性；采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性[14]；參照李忠光等[15]的方法測定CAT活性。

1.2.5 總酚和總黃酮含量的測定

總酚和總黃酮含量測定采用蘇州格銳思生物科技有限公司的試劑盒，稱取0.1 g小麥幼苗新展開葉，研磨均質(zhì)加入1.5 mL的體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，60 ℃振蕩提取2 h，25 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清，用60%乙醇定容至1.5 mL。取200 μL樣本，依次加入試劑混勻，靜置15 min，波長510 nm下測定吸光度值OD510；取40 μL樣本，依次加入試劑，混勻，靜置30 min，波長760 nm下測定吸光度值OD760。根據(jù)下列公式計(jì)算含量：

總酚含量(mg·g-1)=0.146 4×(OD760+0.002 5)×1.5/0.1；

總黃酮含量(mg·g-1)=0.4×(OD510+0.000 1)×1.5/0.1。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析；使用ORIGIN Pro9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl處理對(duì)小麥幼苗生長的影響

如圖1所示，隨著NaCl濃度的增加，各品種小麥的株高、根長、葉干質(zhì)量和根干質(zhì)量均呈下降趨勢，品種間下降幅度不同。兩個(gè)NaCl濃度處理下，‘泰農(nóng)18’的株高下降幅度均最小(2.1%和6.8%)，‘師欒02-1’下降幅度均最大(15%和17%)，且同一處理濃度不同品種之間株高有差異，‘德抗961’顯著高于‘泰農(nóng)18’和‘師欒02-1’(圖1A)。在200 mmol·L-1NaCl處理下，‘德抗961’的根長下降幅度最小(20.7%)，‘師欒02-1’的下降幅度最大(31.1%)，同一處理濃度不同品種之間根長有差異，‘德抗961’顯著高于‘冀麥32’和‘師欒02-1’(圖1B)。兩個(gè)NaCl濃度處理下，‘冀麥32’的葉干質(zhì)量和根干質(zhì)量下降幅度最小，‘師欒02-1’的下降幅度最大，且‘冀麥32’和‘德抗961’的葉干質(zhì)量顯著高于‘泰農(nóng)18’和‘師欒02-1’，‘德抗961’的根干質(zhì)量顯著高于‘冀麥32’和‘師欒02-1’(圖1C和圖1D)。

圖1 不同濃度NaCl處理下小麥苗期生長指標(biāo)變化

2.2 不同濃度NaCl處理對(duì)小麥幼苗葉綠素含量的影響

如圖2所示，隨著NaCl濃度的增加，各品種小麥的葉綠素a和總?cè)~綠素含量均呈下降趨勢。NaCl處理下‘冀麥32’的葉綠素a和總?cè)~綠素含量顯著高于‘泰農(nóng)18’和‘師欒02-1’，與對(duì)照相比，‘冀麥32’下降幅度均最小，‘師欒02-1’下降幅度均最大(圖2A和2C)。除‘泰農(nóng)18’的葉綠素b含量先下降后略升高，其他品種的葉綠素b含量均呈下降趨勢，而各品種的葉綠素a/b變化趨勢不明顯。NaCl處理下‘冀麥32’的葉綠素b含量顯著高于‘師欒02-1’，且與對(duì)照相比，‘冀麥32’下降幅度最小，‘師欒02-1’下降幅度最大(圖2B)。200 mmol·L-1NaCl處理下‘師欒02-1’的葉綠素a/b顯著高于‘泰農(nóng)18’，其他處理下各品種無顯著差異(圖2D)。

圖2 不同濃度NaCl處理下小麥幼苗葉綠素含量變化

2.3 不同濃度NaCl處理對(duì)小麥幼苗抗氧化酶活性的影響

如圖3所示，隨著NaCl濃度的增加，各品種小麥的SOD和CAT活性均呈上升趨勢，POD活性隨鹽濃度的增加呈先上升后下降趨勢，品種間變化幅度不同。NaCl處理下，‘冀麥32’的SOD活性顯著高于其他品種，‘冀麥32’和‘德抗961’的CAT活性與‘泰農(nóng)18’相比差異不顯著，但顯著高于‘師欒02-1’，‘冀麥32’的SOD和CAT活性上升幅度均最大，‘師欒02-1’上升幅度均最小(圖3A和圖3B)。NaCl處理下‘冀麥32’的POD活性與‘德抗961’差異不顯著，顯著高于‘師欒02-1’和‘泰農(nóng)18’；與對(duì)照相比，在100 mmol·L-1NaCl處理下，‘冀麥32’的POD活性上升幅度最大(181.6%)，在200 mmol·L-1NaCl處理下，‘德抗961’的POD活性上升幅度最大(133.7%)，NaCl處理下‘師欒02-1’的POD活性上升幅度均最小(142%和68.5%)(圖3C)。

2.4 不同濃度NaCl處理對(duì)小麥幼苗總酚和總黃酮含量的影響

如圖4所示，隨著NaCl濃度的增加，各品種小麥的總酚和總黃酮含量均呈上升趨勢，品種間上升幅度不同。對(duì)照組中，各品種總酚和總黃酮含量無顯著差異，NaCl處理下，‘冀麥32’和‘德抗961’的總酚和總黃酮含量顯著高于‘師欒02-1’。與對(duì)照相比，NaCl處理下，‘冀麥32’的總酚和總黃酮含量上升幅度均最大，在100 mmol·L-1NaCl處理下分別上升41.9%和32.2%，在200 mmol·L-1NaCl處理下分別上升76.6%和58.6%，‘師欒02-1’的總酚和總黃酮含量上升幅度均最小(圖4A和圖4B)。

圖3 不同濃度NaCl處理下小麥幼苗抗氧化酶活性變化

圖4 不同濃度NaCl處理下小麥幼苗總酚和總黃酮含量變化

3 討論與結(jié)論

鹽逆境能引起植物的滲透、氧化等脅迫反應(yīng)，并抑制植物的生長[16]。根長、株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量等指標(biāo)可以反映植物生長狀況[17]。本研究表明，鹽脅迫抑制幼苗的生長，導(dǎo)致小麥的株高、根長、根葉干質(zhì)量下降，不同品種間下降幅度不同，與翁亞偉等[18]研究一致。

植物光合色素在光合過程中起著捕獲光能、吸收光能的重要作用[19]。本研究中在NaCl脅迫下，各小麥品種的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量呈下降趨勢，說明鹽脅迫下小麥通過減少光吸收從而減少葉綠體產(chǎn)生的活性氧(ROS)量來避免氧化應(yīng)激[20]。Hamada等[21]研究表明，鹽脅迫導(dǎo)致葉綠素a、葉綠素b含量減少的程度取決于植物的耐鹽性。本試驗(yàn)中，‘冀麥32’和‘德抗961’的葉綠素a、葉綠素b含量比‘泰農(nóng)18’和‘師欒02-1’下降程度小，說明‘冀麥32’和‘德抗961’在光合方面比其他兩個(gè)品種具有更強(qiáng)的耐鹽能力。

研究表明鹽脅迫下ROS的積累使脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷[22]。植物體內(nèi)的抗氧化酶如SOD、CAT和POD等能夠通過清除ROS來減輕鹽脅迫下的氧化損傷，維持細(xì)胞膜的相對(duì)完整性和有序性，保持細(xì)胞代謝平衡[23]。前人對(duì)鹽脅迫下小麥幼苗抗氧化酶活性的影響進(jìn)行了研究，但結(jié)果不盡一致。Chen等[24]研究表明，在鹽脅迫下SOD、CAT和POD等抗氧化酶的活性增強(qiáng)；也有研究表明SOD、CAT和POD活性隨著鹽濃度增加先上升后下降[25]。趙遠(yuǎn)偉等[26]認(rèn)為耐鹽性強(qiáng)的品種通過提高SOD、POD等酶活性來適應(yīng)逆境。本研究中各品種SOD和CAT活性隨著鹽濃度增加而增強(qiáng)，POD活性隨著鹽濃度增加先上升后下降，鹽脅迫下‘冀麥32’和‘德抗961’的SOD、CAT和POD活性始終高于其他2個(gè)品種，說明‘冀麥32’和‘德抗961’鹽脅迫下能保持較高的抗氧化酶活性，提高清除ROS的能力，耐鹽性較強(qiáng)。酚類和黃酮類化合物等抗氧化劑代表了次級(jí)活性氧清除系統(tǒng)，在植物處于鹽脅迫或干旱逆境條件下發(fā)揮重要作用[27]。前人研究表明逆境脅迫誘導(dǎo)植物葉片中大量酚類和黃酮類的合成[28]，耐鹽品種能夠合成更多的酚類和黃酮類來清除過多的ROS，以維持細(xì)胞的正常代謝[29]。本研究中，隨著鹽濃度的升高，不同小麥品種的總酚和總黃酮含量也隨之升高，且‘冀麥32’和‘德抗961’的總酚和總黃酮含量高于‘泰農(nóng)18’和‘師欒02-1’，表明‘冀麥32’和‘德抗961’能夠通過合成更多的酚類和黃酮類來應(yīng)對(duì)鹽脅迫，這與Ma等[28]研究結(jié)果相似。

本研究中，‘冀麥32’和‘德抗961’相對(duì)于‘泰農(nóng)18’和‘師欒02-1’有更強(qiáng)的耐鹽性，可能是因?yàn)辂}脅迫下能夠具有較高的光合色素含量，較強(qiáng)的抗氧化酶活性，能夠積累更多的酚類和黃酮類來降低氧化脅迫的影響，有利于逆境條件下小麥的生長發(fā)育及物質(zhì)積累。