左心真，王蒙蒙，董曉

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266109)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，目前整個(gè)社會(huì)肥胖問題日益嚴(yán)重，糖尿病患病人數(shù)逐年遞增。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)最新發(fā)布的結(jié)果顯示，在全球范圍內(nèi)糖尿病患者平均增長率為51%，其中中國的糖尿病患者人數(shù)最多，約為1.164億人[1]。我國糖尿病患者以2型糖尿病為主，約占患病總?cè)藬?shù)的90%以上。糖尿病是一種自身葡萄糖代謝紊亂性疾病，現(xiàn)有的治療策略無法阻止該病和相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。糖尿病主要分為1型和2型兩種類型，區(qū)分這兩種糖尿病的關(guān)鍵在于有無胰島β細(xì)胞抗原的自身抗體，有自身抗體的是1型糖尿病(T1D),且確診時(shí)年齡較小，跟遺傳因素有關(guān)；無自身抗體的是2型糖尿病(T2D)[2]。T2D的發(fā)病機(jī)制是胰島功能缺陷和胰島素抵抗兩個(gè)方面。所謂胰島素抵抗是胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降，機(jī)體代償性地分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定。通常來說，2型糖尿病患者需要胰島β細(xì)胞分泌更多的胰島素來降低血糖的含量，但是β細(xì)胞并不能分泌過多的胰島素，從而出現(xiàn)胰島素分泌不足的現(xiàn)象，導(dǎo)致患者血糖偏高。2型糖尿病會(huì)出現(xiàn)頸動(dòng)脈粥樣硬化性病變、脂代謝異常、脂肪肝等一系列并發(fā)癥[3]，因此建立一種類似2型糖尿病患者的小鼠模型并進(jìn)行相關(guān)研究對臨床上治療糖尿病具有重大意義。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)是一種DNA烷基化試劑(氨基葡萄糖-亞硝基脲)，只對胰腺β細(xì)胞有高選擇的毒性作用。STZ通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glucose transport protein type 2，GLUT2)進(jìn)入胰島β細(xì)胞，破壞β細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，從而減少胰島素釋放，因此STZ是建立糖尿病模型較為常用的試劑。研究表明，高劑量STZ(100～200 mg/kg)并飼喂高熱量飲食可致胰島β細(xì)胞發(fā)生壞死，嚴(yán)重影響胰島功能，導(dǎo)致胰島素分泌不足，進(jìn)而造成1型糖尿病特征形成；而小劑量STZ對部分胰島β細(xì)胞選擇性輕微損傷，可促進(jìn)β細(xì)胞凋亡，能誘導(dǎo)形成T2D模型[4]。高糖高脂飲食與小劑量STZ(40 mg/kg)進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)而成的糖尿病模型屬于當(dāng)前比較理想的模型[5]。

利用高糖高脂飼料并搭配注射低劑量STZ誘導(dǎo)的小鼠動(dòng)物模型可以準(zhǔn)確模擬2型糖尿病患者體內(nèi)環(huán)境，從而為研究2型糖尿病發(fā)病機(jī)制和臨床治療提供了真實(shí)的動(dòng)物模型[4]。采用此方法完成造模后的小鼠血糖值大于200 mg/dL，存在胰島素抵抗和葡萄糖耐受差的情況，與臨床患者表現(xiàn)十分相似[6]。這一造模方法模擬了2型糖尿病的疾病發(fā)生過程，其代謝現(xiàn)象類似于2型糖尿病晚期患者，是目前應(yīng)用最為廣泛和成熟的造模方法[7]。肝臟是糖代謝的重要器官，肝細(xì)胞的葡萄糖攝取、糖原合成等過程都是通過胰島素介導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的。朱俊瑤等[8]認(rèn)為高脂飲食可引起小鼠皮下脂肪細(xì)胞形態(tài)和功能異常，不僅促進(jìn)糖異生，還導(dǎo)致胰島素信號通路受阻。2型糖尿病早期胰島素抵抗病理變化的客觀基礎(chǔ)之一在于脂肪組織在肝臟的沉積和肝臟胰島素受體的減少[9]。因此，本試驗(yàn)建立2型糖尿病小鼠模型并對其脂肪和肝臟組織進(jìn)行組織切片和蘇木精-伊紅染色 ( hematoxylin-eosin staining，HE染色)試驗(yàn)，以進(jìn)一步證明獲得的模型符合2型糖尿病模型要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠及飼料

C57 BL/6J小鼠80只，4周齡，雄性，SPF級，平均體質(zhì)量16～18 g，購買自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。高糖高脂飼料購買自江蘇省協(xié)同生物工程有限責(zé)任公司，配方為：維持基礎(chǔ)料40%+豬油28%+蔗糖10%+全脂奶粉10%+酪蛋白8%+預(yù)混料2%+磷酸氫鈣2%，真空包裝并于4 ℃儲(chǔ)存。正常對照組飼喂普通飼料，配方為：玉米粉27%，麩皮19%，大米16%，豆餅16%，魚粉13%，鈣粉3%，骨粉3%，酵母粉2.3%，食鹽0.5%，復(fù)合維生素0.1%，微量元素0.1%，于室溫下儲(chǔ)存。

1.1.2 試劑

STZ購買自北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司；葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸三鈉均購買自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰島素注射液購買自南京新百藥業(yè)有限公司；乙醇購買自煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器

血糖儀(愛奧樂科技北京有限公司);切片機(jī)(德國Leica RM 2235)；醫(yī)用型一次性無菌注射器[碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司]；精密天平SI-234[丹佛儀器(北京有限公司)]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 T2D小鼠模型的建立

對已購買小鼠進(jìn)行稱重，每3只為一籠分籠飼養(yǎng)于25 ℃恒溫動(dòng)物房。先用普通飼料飼養(yǎng)1周，使小鼠適應(yīng)新的環(huán)境，消除運(yùn)輸應(yīng)激造成的影響。1周后把小鼠隨機(jī)分成兩組，一組為2型糖尿病組(T2D)，60只；一組為正常對照組(CHOW)，20只。 T2D組用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，CHOW組則用普通飼料喂養(yǎng)，兩組小鼠除飼料喂養(yǎng)條件不同以外其他條件均相同。

小鼠分組后，每周二上午9：00對小鼠體質(zhì)量和血糖進(jìn)行測定記錄。小鼠飼養(yǎng)20周后，T2D組小鼠按40 mg/kg劑量(為體重劑量，下同)注射STZ，1 d 1次，連續(xù)3 d，處理結(jié)束后第3天開始尾靜脈采血檢測小鼠血糖，連續(xù)3次檢測血糖水平高于200 mg/dL，即可判定為2型糖尿病小鼠模型建成。

1.2.2 對小鼠進(jìn)行腹腔注射STZ

(1)當(dāng)飼喂小鼠20周后，檢測確定T2D組小鼠血糖水平明顯高于CHOW組并趨于穩(wěn)定，在其血糖水平達(dá)到170 mg/dL時(shí)，可以對小鼠進(jìn)行小劑量注射STZ誘導(dǎo)產(chǎn)生2型糖尿病，在注射之前對小鼠禁食12 h。

(2)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制：緩沖液分為A液和B液，須現(xiàn)配現(xiàn)用。A液：準(zhǔn)確稱量0.735 g檸檬酸鈉溶解在25 mL無菌超純水中；B液：準(zhǔn)確稱量0.525 g檸檬酸溶解在25 mL無菌超純水中。將充分溶解好的A液和B液等體積混勻，再將pH范圍調(diào)到4.2～4.5。

(3)STZ溶液配制：避光稱取0.003、0.004、0.005 g STZ分別溶解在1 mL的上述檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，放在冰上，輕輕混勻，配制濃度為3、4、5 mg/mL STZ溶液。

(4)為小鼠注射STZ。稱量小鼠體質(zhì)量，按照1 g體質(zhì)量分別注射濃度為3、4、5 mg/mL的STZ溶液0.01 mL，使小鼠STZ分別達(dá)到30、40 和50 mg/kg劑量，5 min內(nèi)完成小鼠腹腔注射。

1.2.3 葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐受試驗(yàn)

試驗(yàn)從下午5：00讓小鼠禁食16 h，根據(jù)小鼠的體質(zhì)量，按照2 g/kg的劑量給小鼠腹腔注射濃度為0.2 g/mL葡萄糖溶液，對小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)，在葡萄糖注射0、15、30、60、90、120 min后測血糖濃度；48 h后再次對小鼠禁食4 h進(jìn)行胰島素耐受試驗(yàn)，根據(jù)小鼠的體質(zhì)量，按照0.75 U/kg的劑量腹腔注射胰島素溶液，在注射后0、15、30、60、90、120 min后測血糖濃度。

1.2.4 肝臟和脂肪組織切片及HE染色

為了檢測T2D組小鼠的脂肪泡直徑大小，對兩組小鼠進(jìn)行組織切片和HE染色 。按照組織固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片的步驟依次進(jìn)行；之后進(jìn)行染色，染色前，將組織切片提前放置在60 ℃烘箱中烘片2 h，使石蠟熔化，將切片放入染色架中進(jìn)行染色；染色完成后，迅速在組織切片上滴一滴中性樹脂，用蓋玻片輕輕封片，避免滑片，放入通風(fēng)櫥吹干備用[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)采用GraphPad Prism 8.3和Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。兩組數(shù)據(jù)比較均采用t檢驗(yàn)法；*表示P<0.05水平上差異顯著，**表示P<0.01水平上差異極顯著，***表示P<0.001水平上差異極極顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 兩組小鼠體表特征的差異

2型糖尿病模型(T2D)的小鼠因飼喂高糖高脂飼料，體質(zhì)量比正常對照組(CHOW)小鼠增加得快。小鼠飲食高糖高脂飼料20周后，經(jīng)肉眼觀察，CHOW組小鼠(圖1A)比T2D組小鼠(圖1B)體型小得多，并且前者小鼠毛質(zhì)光滑順亮，而T2D組小鼠的毛緊貼皮膚有出油現(xiàn)象。

圖1 正常對照組(A)和2型糖尿病誘導(dǎo)組(B) 小鼠在體表特征上的比較

2.2 兩組小鼠體質(zhì)量、血糖水平的比較

在進(jìn)行高糖高脂飼料喂養(yǎng)之前，正常對照組和T2D組小鼠體質(zhì)量、血糖并無顯著性差異，用高糖高脂飼料喂養(yǎng)20周，T2D組小鼠的血糖和體質(zhì)量均顯著高于CHOW組小鼠(P<0.001)，見表1。

2.3 2型糖尿病小鼠成模率和死亡率的測定

分別用30、40 和50 mg/kg劑量的STZ對T2D組小鼠進(jìn)行腹腔注射。由圖2可看出，注射30 mg/kg劑量的STZ成模率為75%；注射50 mg/kg劑量的STZ死亡率為65%；注射40 mg/kg劑量的STZ死亡率僅為10%，且成模率也最高，為85%，各組死亡率差異性顯著。

2.4 葡萄糖耐量試驗(yàn)致兩組小鼠葡萄糖耐量能力比較

葡萄糖耐量試驗(yàn)通常作為確診糖尿病發(fā)生的一個(gè)重要依據(jù)，其機(jī)理是檢測自身對葡萄糖的負(fù)荷能力。兩組小鼠同時(shí)注射相同劑量葡萄糖溶液后，兩組小鼠血糖都有所上升，在30 min時(shí)達(dá)到最高，之后就開始降低，CHOW組2 h之內(nèi)恢復(fù)到注射前濃度，而T2D組小鼠在2 h內(nèi)未能恢復(fù)到注射前濃度，葡萄糖耐量降低(圖3A)。通過計(jì)算曲線下面積發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠葡萄糖耐量能力存在顯著差異(圖3B)。

表1 兩組小鼠體質(zhì)量、血糖水平的比較

圖2 注射不同劑量STZ 對 T2D小鼠成模率(A) 和死亡率(B) 的影響

2.5 胰島素耐受試驗(yàn)致兩組小鼠胰島素抵抗能力的比較

對兩組小鼠進(jìn)行胰島素溶液注射后，CHOW組小鼠的血糖濃度在30 min時(shí)達(dá)到最低值(圖4A)，之后快速恢復(fù)，在90 min時(shí)基本恢復(fù)到注射前血糖水平。T2D組小鼠注射胰島素溶液后，血糖濃度下降的速度明顯慢于CHOW組，在60 min左右達(dá)到最低，之后緩慢上升，在2 h之內(nèi)沒有恢復(fù)到初始血糖濃度，表示已經(jīng)發(fā)生胰島素抵抗現(xiàn)象。通過統(tǒng)計(jì)曲線上面積發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠胰島素耐受能力存在顯著差異，符合2型糖尿病模型要求(見圖4B)。

圖3 葡萄糖耐量試驗(yàn)致兩組小鼠葡萄糖耐量能力的比較

2.6 兩組小鼠脂肪和肝臟組織切片及HE染色結(jié)果比較

取兩組小鼠腹股溝脂肪，通過脂肪組織切片和HE染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T2D組小鼠(圖5A)脂肪組織的脂肪泡面積大于CHOW組小鼠(圖5B)，有顯著性差異(圖5C)。取兩組小鼠肝臟，通過肝臟組織切片和HE染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T2D組小鼠(圖5D)肝臟組織的脂肪泡面積大于CHOW組小鼠(圖5E)，并且脂肪泡的數(shù)量明顯多于CHOW組小鼠，有顯著性差異(圖5F)。

圖4 胰島素耐受試驗(yàn)致兩組小鼠胰島素抵抗能力的比較

A：T2D組脂肪組織HE染色；B: CHOW組脂肪組織HE染色；C: 兩組小鼠脂肪組織的脂肪泡直徑統(tǒng)計(jì)；D: T2D組肝臟組織HE染色; E: CHOW組肝臟組織HE染色; F: 兩組小鼠肝臟組織的脂肪泡直徑統(tǒng)計(jì)

3 討論

2型糖尿病的胰島素抵抗是一種病理狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，胰島素不能對正常的胰島素水平做出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。胰島素抵抗是胰島素依賴細(xì)胞(如脂肪細(xì)胞等)對胰島素不適當(dāng)反應(yīng)的復(fù)雜病理狀態(tài)，它是高血壓、血脂異常、糖耐量異常、冠心病、腦血管病等多種慢性病的基礎(chǔ)[11]。長期、過量高脂高糖食物的攝入會(huì)損傷胰島細(xì)胞，從而出現(xiàn)糖尿病。本研究利用以上原理，通過高糖高脂飼料飲食并與小劑量STZ聯(lián)合進(jìn)行誘導(dǎo)，構(gòu)建了肥胖相關(guān)的2型糖尿病小鼠模型。將小鼠高糖高脂喂養(yǎng)20周后，T2D組小鼠血糖水平明顯高于CHOW組，在血糖值達(dá)到170 mg/dL后連續(xù)3 d注射40 mg/kg劑量的STZ，使建立的糖尿病模型更接近于人類2型糖尿病患者[12]。有研究報(bào)道，使用STZ劑量為30 mg/kg進(jìn)行誘導(dǎo)，可以成功地建立T2D動(dòng)物模型[13]；另有研究表明，持續(xù)高糖高脂飲食12周能夠誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)糖調(diào)節(jié)受損、胰島分泌功能減退以及脂代謝紊亂，且高脂聯(lián)合注射30 mg/kg劑量的STZ后，糖尿病大鼠的上述受損幅度明顯加大[14]。也有研究采用4周齡SPF級SD大鼠(斯普拉格-杜勒鼠)高糖高脂飼料喂養(yǎng)1個(gè)月, 按30 mg/kg劑量一次性腹腔注射STZ，從而建立穩(wěn)定的具有高血脂和胰島素抵抗特征的2型糖尿病動(dòng)物模型，但此文章未明確表述2型糖尿病動(dòng)物模型的成模率和存活率[15]。以上報(bào)道與本試驗(yàn)所用STZ劑量不一致，可能與STZ的注射頻率不一樣，或與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系不同等有關(guān)。綜上所述，本試驗(yàn)通過高糖高脂飼料喂養(yǎng)并與注射小劑量STZ(40 mg/kg)聯(lián)合進(jìn)行誘導(dǎo)建立的2型糖尿病小鼠造模方法具有實(shí)驗(yàn)周期短、方法簡便、相對可靠穩(wěn)定、造模成本低等優(yōu)點(diǎn)。

本研究中葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐受試驗(yàn)結(jié)果顯示，T2D組小鼠在注射葡萄糖后血糖迅速上升，達(dá)到最高之后緩慢下降，在2 h內(nèi)未能恢復(fù)到注射前濃度，葡萄糖耐量降低；T2D組小鼠注射胰島素溶液后，血糖下降速度較CHOW組慢，在達(dá)到最低之后緩慢上升，在2 h之內(nèi)沒有恢復(fù)到注射胰島素溶液前血糖濃度，發(fā)生了胰島素抵抗現(xiàn)象，這說明2型糖尿病小鼠模型建立成功[12]。劉麗萍等[16]用高糖飼料喂養(yǎng)SD雄性大鼠6周后，對其進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐受試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)處理組在50 min時(shí)血糖濃度最低，90 min 后血糖未能恢復(fù)，說明高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠6周后會(huì)出現(xiàn)糖耐量、胰島素耐受異常，即具有胰島素抵抗的特征，這和本試驗(yàn)結(jié)果一致。進(jìn)一步對兩組小鼠脂肪和肝臟進(jìn)行組織切片及HE染色分析，發(fā)現(xiàn)T2D組小鼠的脂肪和肝臟中的脂肪泡面積明顯大于CHOW組小鼠，存在顯著性差異。薛萊等[17]經(jīng)過高脂飼料聯(lián)合多次小劑量STZ誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型形成4周后，通過 HE染色發(fā)現(xiàn)T2D小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯、肝索排列混亂、肝細(xì)胞出現(xiàn)大量脂肪空泡，說明2型糖尿病(非酒精性)脂肪肝模型建立成功，這與本試驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上所述，4周齡C57BL/6雄性小鼠用高糖高脂飼料喂養(yǎng)20周后，再腹腔注射40 mg/kg體重劑量的STZ，能形成穩(wěn)定的2型糖尿病模型，并且操作簡單，成模率和存活率達(dá)80%以上。本試驗(yàn)為日后治療和研究2型糖尿病提供了一種建立動(dòng)物模型的方法。