邵家起，李康昱，肖軍霞，仇宏偉

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報編輯部，山東青島 266109)

在一定條件下，兩種帶相反電荷的聚電解質(zhì)之間相互作用能夠形成聚電解質(zhì)復(fù)合物。聚電解質(zhì)相互作用所形成的復(fù)合物沉淀可以顯著提高物質(zhì)的黏性與界面彈性，但因相互作用過程中通常還伴有疏水相互作用、氫鍵、范德華力等非共價相互作用力，導(dǎo)致反應(yīng)過程復(fù)雜，并受pH值、溫度、混合比例、離子強度等諸多因素影響[1]。據(jù)報道，聚電解質(zhì)復(fù)合物在微囊化、Pickering乳液制備、可食性薄膜制備和藥物靶向遞送等方面均有廣泛應(yīng)用[2-3]。在這些報道中，與傳統(tǒng)的復(fù)凝聚法制備微膠囊的方式相比，用聚電解質(zhì)復(fù)合物制備Pickering乳液可以更好地解決常規(guī)乳化劑乳化能力低的問題。特別是近幾年，蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物作為最具潛力的有機Pickering乳液穩(wěn)定劑得到越來越多人的關(guān)注[4]。卵清蛋白-海藻酸鈉復(fù)合物、殼聚糖-阿拉伯膠復(fù)合物、乳清分離蛋白-果膠復(fù)合物已被證明具備穩(wěn)定Pickering乳液的能力[5-7]，蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物的穩(wěn)定性、流變學(xué)性質(zhì)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)等因素對Pickering乳液的穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用。

卵清蛋白(ovalbumin，OVA)是雞蛋清的主要蛋白成分，約占雞蛋清質(zhì)量的65%，分子量44.5 kDa，等電點約4.5，是一種由386個氨基酸組成的球狀蛋白[8]。由于OVA來源廣泛，是食品工業(yè)中常用的一種乳化劑。阿拉伯膠(gum arabic，GA)提取于金合歡樹的滲出物，帶負電荷，是一種呈中性或微酸性且混有鈣、鎂、鉀等陽離子的支鏈雜多糖，具有較高的水溶性、較低的黏度，在水中的溶解度可達50%[9]。由于GA具有乳化、增稠、粘合、起泡等功能性質(zhì)，常被用于煉乳、口香糖、冰淇淋、糖漿等食品配方中。

聚電解質(zhì)相互作用是兩種帶相反電荷聚電解質(zhì)在靜電相互作用下發(fā)生相分離而產(chǎn)生沉淀的現(xiàn)象。目前已有關(guān)于OVA-GA聚電解質(zhì)相互作用的報道：Niu等[10]首先觀察到OVA與GA在一定條件下共存時可以形成可溶性復(fù)合物，也可發(fā)生相分離并生成不可溶性復(fù)合物；隨后，他所在團隊發(fā)現(xiàn)在總生物聚合物濃度為6 g/L、pH=7.0時，OVA與GA間的靜電相互作用對復(fù)合物穩(wěn)定的常規(guī)乳液的pH穩(wěn)定性不利[11]。但目前關(guān)于利用OVA和GA的相互作用制備聚電解質(zhì)復(fù)合物納米顆粒并用來穩(wěn)定Pickering乳液的研究暫未見報道。

為探究OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物納米顆粒穩(wěn)定Pickering乳液的能力，本文研究了OVA與GA質(zhì)量比、溫度、離子強度、靜置時間等條件對OVA與GA相互作用的影響，確定形成OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物的最適條件，觀察復(fù)合物靜置不同時間后的外觀和濁度變化，通過檢測復(fù)合物粒徑和ζ電勢來評價復(fù)合物的穩(wěn)定性，利用光學(xué)法微流變儀研究復(fù)合物的黏彈性，以探討復(fù)合物的界面性質(zhì)。本文研究結(jié)果可為OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物納米顆粒應(yīng)用于穩(wěn)定O/W型Pickering乳液提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

OVA，生物試劑，購自上海瑞永生物科技有限公司；GA，生物試劑，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；紫蘇籽油，食品級試劑，購自河南家豐植物油有限公司；其他試劑均購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-2000紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；FDU-1200冷凍干燥機，上海愛朗儀器有限公司；Nano ZS90馬爾文動態(tài)光散射儀，英國馬爾文儀器有限公司；DSA100光學(xué)接觸角測定儀，德國KRüSS公司；Rheolaser Master光學(xué)法微流變儀，法國Formulaction儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 OVA-GA復(fù)合物制備條件的優(yōu)化

分別稱取一定量OVA和GA粉末溶解于去離子水中，室溫磁力攪拌8 h至完全溶解，配制1 g/L的OVA溶液和GA溶液。作者前期的研究表明，OVA與GA形成復(fù)合物的最適pH值為3.5，因此，混合前使用0.1 mol/L HCl溶液分別調(diào)節(jié)OVA溶液和GA溶液的pH值至3.5。參考Zhang等[12]的方法，將OVA與GA溶液按一定體積混合，使兩者的質(zhì)量比分別達到4∶1、3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3或1∶4，添加一定濃度的NaCl溶液，使NaCl濃度分別達到0 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L，然后在25 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃或80 ℃不同溫度下反應(yīng)20 min，即得OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物。用數(shù)碼相機拍攝反應(yīng)體系的外觀，用紫外可見分光光度計測定復(fù)合物溶液在波長600 nm處吸光值(OD600值)。

1.2.2 OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物的表征

1.2.2.1 穩(wěn)定性的測定

將在最適條件下制備的OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物懸浮液靜置0 min、1 min、3 min、5 min、10 min，觀察外觀，測定OD600值，并使用馬爾文動態(tài)光散射儀測定復(fù)合物的粒徑和ζ電勢。

1.2.2.2 黏彈性的測定

取4 mL在最適條件下新制備的OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物溶液，排凈氣泡，添加到光學(xué)法微流變儀樣品瓶后立即放入樣品室中。設(shè)定測量時間700 s，測量溫度25 ℃，測量模式Gelation。利用軟件Rheolaser Master 1.4.0.0計算復(fù)合物溶液彈性指數(shù)和宏觀黏度指數(shù)。

1.2.2.3 三相接觸角的測定

參考Wang等[13]的方法并稍作修改。將OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物溶液在25 ℃以6 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取沉淀凍干。使用紅外壓片機將凍干粉末壓制成厚度1 mm、直徑10 mm的光滑薄片后，浸入盛有紫蘇籽油的方形透明玻璃器皿中。使用高精度注射器將2 μL去離子水滴加在薄片表面，平衡后，使用高速攝像機拍攝液滴圖像，并利用LaPlace-Young方程擬合液滴輪廓，計算三相接觸角。

1.2.2.4 界面張力的測定

使用光學(xué)接觸角測量儀，采用懸滴法測定OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物溶液與紫蘇籽油之間的界面張力。當1滴OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物溶液從注射器尖端浸入到方形透明玻璃器皿上的紫蘇籽油中時，形成油水界面?；谳S對稱液滴形狀分析，采用LaPlace-Young方程擬合并計算界面張力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤差”形式表示。利用軟件SPSS Statistics 25的單因素方差分析法評估平均值之間的差異，P<0.05表示存在顯著性差異。利用軟件Origin 2019和軟件Visio 2019進行圖表繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 OVA與GA質(zhì)量比對OVA-GA復(fù)合物形成的影響

由圖1可知，OVA與GA質(zhì)量比對兩者混合溶液的分散狀態(tài)有重要影響。OVA與GA質(zhì)量比分別為4∶1、3∶1、2∶1時，OVA-GA復(fù)合物溶液在靜置后逐漸由渾濁變?yōu)槌吻?，靜置20 min時，樣品瓶底部出現(xiàn)大量有較高黏度的沉淀。OVA與GA質(zhì)量比為3∶2時，反應(yīng)體系有部分沉淀生成，濁度仍然較高，說明還有大量的復(fù)合物處于懸浮狀態(tài)。OVA與GA質(zhì)量比為1∶1或2∶3時，反應(yīng)體系穩(wěn)定，復(fù)合物顆粒處于懸浮狀態(tài)，這與Niu等[10]的研究結(jié)果一致。由圖1還可以看出，隨著反應(yīng)體系中GA占比的升高，溶液濁度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在OVA與GA質(zhì)量比為3∶2時溶液濁度升至最大，而在OVA與GA質(zhì)量比為1∶2、1∶3、1∶4時溶液濁度幾乎降為0。溶液濁度的變化與復(fù)合物外觀的變化相對應(yīng)，這說明當體系中的GA達到飽和后，過量的GA抑制了OVA與GA相互作用，這與豌豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物溶液的濁度隨殼聚糖濃度的升高而降低的趨勢一致[14]。因此，選擇OVA與GA質(zhì)量比為1∶1和3∶2的體系進行后續(xù)研究。

圖1 OVA與GA質(zhì)量比對OVA-GA復(fù)合物外觀(A)和

2.2 溫度對OVA-GA復(fù)合物形成的影響

OVA與GA質(zhì)量比為3∶2和1∶1時，溫度對OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物的影響結(jié)果見圖2。溫度從25 ℃升至50 ℃，2個質(zhì)量比條件下制備的OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物的外觀與溶液濁度均沒有顯著變化，但隨著溫度的進一步升高，復(fù)合物溶液的濁度均略有升高。Zhang等[12]在研究OVA和高甲氧基果膠的相互作用時也觀察到類似現(xiàn)象：25 ℃和35 ℃ 2個溫度條件下，OVA-高甲氧基果膠復(fù)合物溶液的濁度差異不顯著，但隨著溫度繼續(xù)升高，差異顯著增加，75 ℃時濁度達到最大。除靜電相互作用之外，OVA與GA之間還有疏水相互作用、范德華力和氫鍵等。通常疏水相互作用需要較高的溫度，因此，溫度升高到80 ℃時OVA-GA復(fù)合物溶液濁度增加，可能是因為OVA與GA之間的疏水相互作用增強。此外，高溫會引起OVA熱變性：Zou等[15]的研究結(jié)果顯示，OVA在60 ℃時開始變性，變性溫度為81.92 ℃。熱變性會引起蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)的改變以及疏水基團的暴露，從而降低OVA的溶解度[16]，這也可能影響復(fù)合物溶液的濁度。綜上所述，考慮到高溫下OVA蛋白可能發(fā)生變性，后續(xù)試驗選擇在25 ℃條件下進行。

圖2 溫度對OVA-GA復(fù)合物外觀(A)和

2.3 離子強度對OVA-GA復(fù)合物形成的影響

由圖3可知，OVA與GA質(zhì)量比為3∶2和1∶1時，隨著NaCl濃度的增加，復(fù)合物溶液外觀逐漸澄清，濁度減小，這是因為體系中的鹽離子對蛋白質(zhì)和多糖分子上的電荷產(chǎn)生屏蔽作用，明顯影響了聚電解質(zhì)復(fù)合物的形成[17]。這一結(jié)果可證實靜電相互作用是OVA和GA之間的主要作用。此外，該結(jié)果還與Ru等[18]在牛血清白蛋白-果膠復(fù)合物體系中觀察到的結(jié)果一致：在與帶負電荷的果膠相互作用時，隨著鹽離子濃度的增加，牛血清白蛋白攜帶的正電荷越多，它與果膠形成復(fù)合物的趨勢就越弱。綜上所述，鹽離子的存在能抑制OVA和GA之間的相互作用，后續(xù)試驗不再添加NaCl。

圖3 離子強度對OVA-GA復(fù)合物外觀(A)和

2.4 OVA-GA復(fù)合物的貯藏穩(wěn)定性分析

圖4為靜置0～20 min，OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物溶液的外觀、濁度、粒徑、ζ電勢的變化結(jié)果。由圖4A、圖4B可知，隨著靜置時間的延長，OVA與GA質(zhì)量比為3∶2的復(fù)合物溶液濁度呈逐漸下降趨勢，靜置10 min時穩(wěn)定。這與孫燕婷等[19]的研究結(jié)果一致。由圖4C、圖4D可知，隨著靜置時間的延長，OVA與GA質(zhì)量比為3∶2的復(fù)合物粒徑逐漸增大，ζ電勢的絕對值逐漸減小。這說明復(fù)合物正在不斷聚集，且在靜置10 min后達到飽和。而OVA與GA質(zhì)量比為1∶1的復(fù)合物溶液外觀、濁度、粒徑和ζ電勢在靜置20 min內(nèi)均沒有顯著性變化，說明OVA與GA質(zhì)量比為1∶1時體系較為穩(wěn)定。這是因為OVA與GA質(zhì)量比為1∶1時，體系的ζ電勢絕對值較高，粒子間的靜電斥力較大，不易發(fā)生聚集。另外，OVA與GA質(zhì)量比為1∶1時，聚電解質(zhì)相互作用程度較低，體系中生成的OVA-GA復(fù)合物較少。根據(jù)圖4C，OVA與GA質(zhì)量比為1∶1的復(fù)合物粒徑為367 nm，遠低于質(zhì)量比為3∶2的復(fù)合物粒徑(1 067 nm)，而粒徑較小的復(fù)合物可以增加顆粒在油水界面吸附的比表面積，穩(wěn)定Pickering乳液的能力更強[20]。

圖4 靜置時間對OVA-GA復(fù)合物外觀(A)、濁度(B)、粒徑(C)、ζ電勢(D)的影響

2.5 黏彈性分析

與傳統(tǒng)的剪切流變學(xué)技術(shù)相比，光學(xué)法微流變技術(shù)可以在保持膠體體系靜止狀態(tài)時，通過測量復(fù)合物彈性指數(shù)和宏觀黏度指數(shù)來表征和量化復(fù)合物的微觀彈性和表觀黏度[21]。根據(jù)OVA與GA質(zhì)量比為1∶1和3∶2時復(fù)合物彈性指數(shù)和宏觀黏度指數(shù)的測量結(jié)果(圖5)可知，復(fù)合物的彈性指數(shù)遠高于OVA或GA的彈性指數(shù)，表明OVA與GA之間的相互作用有助于提高復(fù)合物的微觀彈性。Li等[22]也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。此外，相較于質(zhì)量比為3∶2的OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物，質(zhì)量比為1∶1的復(fù)合物具有更高的彈性指數(shù)，說明復(fù)合物具有更突出的固體屬性。這種現(xiàn)象可能與復(fù)合物的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)：多糖占比較大時，顆粒表面會形成較厚的界面層，阻止復(fù)合物顆粒聚集。這有助于復(fù)合物穩(wěn)定Pickering乳液并形成更致密的彈性界面。

由圖5還可以看出，OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物溶液的黏度高于OVA或GA溶液的黏度。這是因為OVA與GA的相互作用形成一種具有凝膠性質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[21]。另外，OVA與GA質(zhì)量比為3∶2的OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物的黏度更高，而且隨著時間的延長，復(fù)合物黏度還會進一步升高，這是因為OVA與GA質(zhì)量比為3∶2時，體系的相互作用較強，且這種相互作用能使復(fù)合物發(fā)生聚集，形成更加致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)。

圖5 彈性指數(shù)(A)和宏觀黏度指數(shù)(B)

2.6 三相接觸角分析

三相接觸角可以反映固體顆粒的親水性和疏水性，三相接觸角接近90°，表明固體顆粒穩(wěn)定Pickering乳液的能力較強。由圖6可知，OVA與GA質(zhì)量比為1∶1和3∶2的復(fù)合物三相接觸角均小于90°，說明復(fù)合物具有穩(wěn)定O/W型Pickering乳液的能力。其中質(zhì)量比為1∶1的復(fù)合物接觸角(81.3°)遠大于質(zhì)量比為3∶2的復(fù)合物，說明質(zhì)量比為1∶1的復(fù)合物穩(wěn)定Pickering乳液的能力更強。另外，OVA與GA質(zhì)量比為1∶1的復(fù)合物的三相接觸角大于杏仁膠-乳清蛋白復(fù)合物的(58°)[23]，大于乳清蛋白-低甲氧基果膠復(fù)合物的(59.8°)[24]，大于花生多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的(65.1°)[25]。因此，質(zhì)量比為1∶1的OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物具有穩(wěn)定Pickering乳液的潛力。

A. OVA；B. GA；C. OVA與GA質(zhì)量比1∶1；D. OVA與GA質(zhì)量比3∶2。

2.7 界面張力分析

OVA-GA復(fù)合物溶液與油相之間的界面張力可以反映復(fù)合物制備Pickering乳液的穩(wěn)定性。根據(jù)不可逆吸附理論，固體顆粒分散體系與油滴之間的界面張力越大，形成的Pickering乳液破乳所需的解析能越大，即Pickering乳液越穩(wěn)定[26]。由圖7可知，與OVA溶液或GA溶液相比，OVA-GA復(fù)合物溶液與油滴之間的界面張力較大，說明固體顆粒的形成加劇了油滴的收縮。OVA與GA的質(zhì)量比對體系與油滴之間的界面張力有顯著影響，質(zhì)量比為1∶1時復(fù)合物溶液與油滴之間的界面張力更大，這進一步說明OVA與GA質(zhì)量比為1∶1的復(fù)合物更適合作為Pickering乳液的乳化劑，這與Zhou等[27]的結(jié)論一致，即玉米醇溶蛋白和果膠之間的相互作用影響玉米醇溶蛋白-果膠復(fù)合物顆粒在界面的吸附行為和界面結(jié)構(gòu)的形成。

A. OVA；B. GA；C. OVA與GA質(zhì)量比1∶1；D. OVA與GA質(zhì)量比3∶2。

3 結(jié)論

探究了OVA與GA相互作用規(guī)律，并對制備的OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物納米顆粒的穩(wěn)定性、黏彈性和界面性質(zhì)進行了表征。結(jié)果表明，OVA與GA的靜電相互作用有效提高了OVA或GA的黏彈性和乳化能力。OVA與GA質(zhì)量比為3∶2的體系具有更強的相互作用，而OVA與GA質(zhì)量比為1∶1時能形成聚電解質(zhì)復(fù)合物納米顆粒，具備更高的彈性和更大的界面張力，三相接觸角接近90°，能構(gòu)成更穩(wěn)定的OVA-GA體系，穩(wěn)定Pickering乳液的能力更強。因此，OVA-GA聚電解質(zhì)復(fù)合物納米顆粒是一種有潛力的Pickering乳液穩(wěn)定劑，研究結(jié)果為開發(fā)新型食品基料、拓展OVA的應(yīng)用領(lǐng)域開辟了新途徑。