王英磊，王策，劉耀臣，孫豐寶，李敏

(1.煙臺市農(nóng)業(yè)技術推廣中心，山東煙臺 264000; 2.青島農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山東青島 266109)

連作障礙已成為制約我國設施蔬菜生產(chǎn)的嚴重問題，土傳病害是造成蔬菜連作障礙的最重要因素，嚴重制約了蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。防治土傳病害常采用的高溫悶棚等物理防治措施對溫度要求苛刻[1]；藥物熏蒸等化學防治措施存在食品與環(huán)境安全問題[2]；微生物菌劑等生物防治措施成本較高且效果不穩(wěn)定，因此，尋求新的綠色土壤滅菌方法十分必要。日本、荷蘭科學工作者[3-4]受水稻輪作種植的啟發(fā)，在21世紀初提出了一種強還原土壤滅菌法(reductive soil disinfestation, RSD)，也稱生物土壤滅菌法(biological soil disinfestation, BSD)。Momma等[5]利用麥麩發(fā)酵后所產(chǎn)生的乙醇成分進行土壤消毒，發(fā)現(xiàn)乙醇能起到消滅菌蟲的作用；而后進一步確定低濃度乙醇可以起到土壤消毒的作用，消毒功效與傳統(tǒng)化學方法相當[6]，并發(fā)現(xiàn)土壤微生物參與消毒過程，于是在日本全國范圍內(nèi)開展了利用低濃度乙醇作為碳源的強還原土壤消毒工作[7]。我國學者向土壤中施加不同種類、不同比例的有機物料，發(fā)現(xiàn)RSD法可以顯著抑制土壤病原菌[8-9]。施加固體有機物料可以顯著抑制土壤病原物，但相較于液體物料，固體物料需要借助機械施加且不易被施加到深層土壤中[5]。施用低濃度乙醇進行土壤滅菌可以顯著抑制再植蘋果樹病原物[10]、番茄尖孢鐮刀菌[5]和草莓大麗輪枝菌[11]。

本研究基于RSD法的特點，針對我國設施蔬菜傳統(tǒng)的栽培模式，以綠色無害化防控設施蔬菜土傳病蟲害為目標，探究低濃度乙醇強還原土壤滅菌法(Et-RSD)對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為實現(xiàn)減肥、減藥、增效，無害化防控設施蔬菜土傳病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤取自山東省海陽市趙疃鎮(zhèn)東村莊(36°44′N，120°55′E) 連作5年番茄的日光溫室。采用五點取樣法取樣，剔除雜物后運回實驗室備用。土壤基礎理化性質(zhì)如下：全氮含量1.3 g·kg-1，堿解氮含量150 mg·kg-1，全磷含量4.2 g·kg-1，速效磷含量114 mg·kg-1，全鉀含量26 g·kg-1，速效鉀含量263 mg·kg-1，pH值6.51，土壤電導率(EC)值 487 μS·cm-1。

1.2 試驗設計

試驗在恒溫培養(yǎng)箱中進行。取連作土壤，揀除大石塊和根系等雜物，過篩，晾干后裝入20 cm ×30 cm的透明密封袋內(nèi)，每袋裝入連作土壤1 kg。每袋分別加入不同濃度(0、0.5%、1%、2%、4%)的乙醇溶液(乙醇濃度均為體積分數(shù)，0為純凈水，即對照)150 mL混合均勻，密封，放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱，黑暗培養(yǎng)，恒溫30 ℃。分別于10 d、15 d、20 d分批取出測定各項指標。共15個處理，每個處理設置3次重復。

1.3 試驗方法

1.3.1 微生物及線蟲培養(yǎng)和計數(shù)

真菌采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)；細菌采用NA培養(yǎng)基培養(yǎng)；放線菌采用高氏1號培養(yǎng)基培養(yǎng)；尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法，用尖孢鐮刀菌專性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)[12]；疫霉菌(Phytophthora)采用選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)[13]。

微生物數(shù)量均采用平板稀釋計數(shù)法[14]。土壤中線蟲的分離和計數(shù)：采用淘洗-過篩法和過篩-貝曼漏斗法對混合土樣中的孢囊和二齡幼蟲進行定量分離，在解剖鏡下對孢囊和殺死固定的二齡幼蟲進行觀察并計數(shù)[15]。

1.3.2 土壤理化指標測定

參照魯如坤[16]的方法：MP523-01型pH計(上海三信)按水土質(zhì)量比2∶1測定土壤pH值；采用DDS-307型電導儀(上海儀電科學儀器股份有限公司)按水土質(zhì)量比2∶1測定土壤EC值；用1260 Infinity 高效液相色譜儀(Agilent，德國)測定土壤乙酸含量。土壤氧化還原電位采用FJA-6氧化還原電位儀(南京傳滴儀器設備有限公司)測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用DPS v7.05軟件將數(shù)據(jù)進行整合分析，用LSD法進行多重比較分析，顯著水平P<0.05，圖表采用Microsoft Excel 2019制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度乙醇和處理時間對番茄連作土壤微生物數(shù)量的影響

當相同乙醇濃度處理下，隨著處理時間的延長，連作番茄土壤可培養(yǎng)真菌的數(shù)量逐漸降低(圖1A)，可培養(yǎng)細菌(圖1B)和可培養(yǎng)放線菌(圖1C)數(shù)量逐漸升高。當處理10 d時，1%處理土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量顯著低于對照，其余濃度與對照差異不顯著；處理時間為15 d和20 d的趨勢相同，2%和4%乙醇處理的可培養(yǎng)真菌數(shù)量顯著低于對照，4%乙醇處理20 d的土壤中可培養(yǎng)真菌數(shù)量最低，與2%乙醇處理20 d差異不顯著，二者分別比 10 d對照處理降低了59.8%和56.0%。

當處理10 d時，除0.5%乙醇外，其他濃度處理細菌數(shù)量顯著高于對照；處理15 d和20 d的土壤細菌數(shù)量與10 d的趨勢相似，其中4%乙醇處理20 d的土壤中可培養(yǎng)細菌數(shù)量最高，且與2%濃度處理20 d和4%乙醇處理15 d差異不顯著，三者分別比10 d對照處理增加了380.4%、328.6%和276.8%。

當處理10 d時，隨乙醇濃度的增加，放線菌數(shù)量逐漸增加，且2%和4 %乙醇放線菌數(shù)量顯著高于對照；處理15 d和20 d的土壤放線菌數(shù)量與10 d的趨勢相同，其中4%乙醇處理15 d的土壤中放線菌數(shù)量最高，比10 d對照處理增加了618.2%。

以上結(jié)果表明低濃度乙醇強還原處理可以減少土壤中真菌的數(shù)量，增加土壤中細菌和放線菌的數(shù)量。

圖1 不同濃度乙醇和不同處理時間對番茄連作土壤微生物數(shù)量的影響

2.2 不同濃度乙醇和處理時間對番茄連作土壤病原菌數(shù)量的影響

除對照外，當相同乙醇濃度處理時，隨著處理時間的延長，番茄連作土壤中尖孢鐮刀菌(圖2A)和疫霉菌(圖2B)數(shù)量逐漸降低。當處理時間相同時，隨著乙醇濃度的增大，尖孢鐮刀菌和疫霉菌數(shù)量逐漸降低；4%乙醇處理20 d的病原菌數(shù)量最低，二者分別比10 d對照處理降低87.5%和92.0%，2%乙醇處理20 d和4%乙醇處理15 d差異不顯著。表明低濃度乙醇強還原處理可以減少土壤中尖孢鐮刀菌和疫霉菌數(shù)量。

圖2 不同濃度乙醇和處理時間對番茄連作土壤尖孢鐮刀菌和疫霉菌數(shù)量的影響

2.3 不同濃度乙醇和處理時間對番茄連作土壤根結(jié)線蟲繁殖體數(shù)量的影響

當處理時間相同時，隨著乙醇濃度的增大，連作番茄土壤中根結(jié)線蟲二齡幼蟲(圖3A)和卵囊(圖3B)數(shù)量呈下降趨勢；相同濃度條件下，隨處理時間的增加，土壤二齡幼蟲和卵囊數(shù)量逐漸下降。不同處理時間下，乙醇處理的土壤中二齡幼蟲和卵囊數(shù)量都顯著低于對照，其中4%乙醇處理的土壤中二齡幼蟲和卵囊數(shù)量最低。處理時間為20 d時，4%乙醇處理的土壤中二齡幼蟲和卵囊數(shù)量最低，且與2%乙醇處理差異不顯著，兩個處理濃度下二齡幼蟲數(shù)分別比10 d對照處理降低86%和79.8%，卵囊數(shù)分別降低75.6%和85.0%。表明低濃度乙醇強還原處理可以顯著減少土壤中的根結(jié)線蟲二齡幼蟲和卵囊數(shù)量。

圖3 不同濃度乙醇和處理時間對番茄連作土壤根結(jié)線蟲二齡幼蟲和卵囊數(shù)量的影響

2.4 不同乙醇濃度和處理時間對番茄連作土壤可培養(yǎng)微生物比例的影響

由表1可知，低濃度乙醇處理以后番茄連作土壤細菌/真菌(B/F)、放線菌/真菌(A/F)數(shù)量比在相同處理時間下，隨著乙醇濃度的升高逐漸升高。處理時間為10 d時，4%乙醇處理B/F顯著高于對照和0.5%處理，但與1%和2%乙醇間差異不顯著；4%乙醇處理A/F與2%處理間差異不顯著，但顯著高于其他濃度處理。當處理時間為15 d時，4%乙醇處理的B/F和A/F顯著高于其他處理，其他處理間的B/F和A/F均不存在顯著差異。當處理時間為20 d時，2%和4%乙醇處理的B/F顯著高于其他處理；1%、2%和4%乙醇處理A/F顯著高于對照和0.5%處理。其中4%乙醇處理15 d和20 d及2%乙醇處理20 d三個處理B/F和A/F顯著高于其他處理。說明乙醇強還原處理可以將土壤從“真菌型”土壤轉(zhuǎn)變?yōu)椤凹毦汀蓖寥馈?/p>

表1 不同濃度乙醇和不同處理時間對番茄連作土壤微生物結(jié)構(gòu)的影響

2.5 不同濃度乙醇和處理時間對番茄連作土壤理化性質(zhì)的影響

低濃度乙醇強還原處理對土壤pH、EC等理化指標有一定影響(表2)，在相同處理濃度下，隨時間的增加，pH先降低再升高；當處理20 d時，4%乙醇處理的pH顯著高于對照。相同處理時間內(nèi)，不同濃度乙醇處理均能有效降低土壤電導率，4%乙醇處理20 d以后土壤電導率為162 μS·cm-1。在相同處理濃度下，隨著處理時間增加，低濃度乙醇處理土壤氧化還原電位顯著降低；相同處理時間內(nèi)乙醇處理土壤氧化還原電位顯著低于對照。隨處理時間和乙醇濃度的增加，土壤中乙酸含量均有不同程度提高(表2)。

表2 不同濃度乙醇和不同處理時間對番茄連作土壤某些理化指標的影響

3 討論

已有研究表明[4,7]，RSD法的滅菌機理可能與厭氧狀態(tài)、有毒有機酸、還原性產(chǎn)物以及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變有關。本試驗中，隨著乙醇濃度和處理時間的增加，土壤pH先降低后升高，氧化還原電位逐漸降低，乙酸含量逐漸增加。這是由于在厭氧條件下長時間的土壤強還原過程中產(chǎn)生大量OH-可以中和酸性土壤，調(diào)節(jié)土壤pH值，使土壤pH值升高，氧化還原電位降低[17-18]，乙醇在土壤厭氧微生物的作用下發(fā)生氧化還原反應轉(zhuǎn)變成乙酸[19-20]。研究表明，強還原過程中產(chǎn)生的某些有機酸，如乙酸和丁酸對鐮刀菌具有很強的抑制作用[21-22]，本試驗中尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著下降，且乙醇濃度越高尖孢鐮刀菌數(shù)量下降速度越快，可能與乙醇形成的有機酸相關。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對土壤理化性質(zhì)和植物生長至關重要，是衡量土壤微生物多樣性和肥力的一個重要指標[23]。RSD處理對番茄根際土壤細菌群落組成影響較大[24], 土壤微生物中細菌和放線菌多為促進植物生長的有益菌，如芽孢桿菌和假單胞菌等[25-26]，而植物病害則多是由真菌引起的[27]。本試驗表明，隨著乙醇濃度和處理時間的增加土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的改變，細菌和放線菌數(shù)量增加，真菌數(shù)量減少，逐漸向“細菌型”土壤轉(zhuǎn)變，且土壤中的尖孢鐮刀菌、疫霉菌和根結(jié)線蟲數(shù)量均顯著降低。這是因為強還原處理過程產(chǎn)生的有益菌利用易降解有機碳源大量繁殖，這些有益微生物的拮抗作用、競爭作用及寄生作用能較好地抑制病原菌[8,20,28]。Blok等[4]指出采用固體有機物料的RSD法操作煩瑣，Momma等[5]人研究表明低濃度乙醇進行土壤滅菌與有機物料滅菌效果相當。本試驗表明2%～4%乙醇溶液處理15～20 d對番茄連作土壤病原物鐮刀菌、疫霉菌和根結(jié)線蟲的抑制作用顯著，而2%乙醇處理成本低，因此認為2%乙醇溶液處理20 d為最佳組合。