謝佳惠 任悅冉 尹恝

缺血性卒中（ischemic stroke,IS）發(fā)病后，小膠質細胞激活，外周固有免疫細胞（如單核-巨噬細胞）和適應性免疫細胞（如B細胞、T細胞）被大量募集至缺血半球，不利于IS預后[1-4]。研究證實被募集至缺血半球的免疫細胞中部分起源于腸道[5]，且受腸道菌群影響[6]。腸道菌群是人體內(nèi)的龐大生物群體，與免疫系統(tǒng)顯著相關[7]。IS這一急性應激改變了腸道菌群的構成、豐度、代謝產(chǎn)物水平[8-11]。調控腸道菌群及其代謝產(chǎn)物水平可影響IS后的免疫狀態(tài)，影響IS預后[6,12]。在此就腸道菌群影響IS免疫狀態(tài)的臨床和基礎研究做一綜述，旨在為腸道菌群影響IS預后的機制研究提供理論基礎，為改善IS預后提供調控腸道菌群這一新思路。

1 IS后腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的變化

1.1 腸道菌群構成和多樣性的變化 在生理情況下，健康成人腸道菌群保持動態(tài)平衡，最富有的菌群是厭氧菌和瘤胃梭菌[10,13]。疾病可改變腸道菌群構成和多樣性，研究發(fā)現(xiàn)曾患重大疾病的非健康老齡化人群腸道鏈球菌屬豐度顯著高于健康老齡化人群[14]。發(fā)生IS后，患者和實驗動物的腸道菌群構成顯著改變、物種多樣性顯著降低。HAAK等[15]發(fā)現(xiàn)與對照組相比，IS患者腸道菌群α多樣性和β多樣性降低，變形菌門、腸桿菌科、大腸桿菌屬豐度顯著升高。在IS動物模型中，腸道菌群的多樣性、變形菌門和腸桿菌科的豐度變化都與IS患者相似[11,16-18]。XU等[8]證實，在IS后腸道菌群的諸多變化中，改變最明顯的是變形菌門腸桿菌科，其豐度在IS急性期顯著升高。綜上所述，IS后腸道菌群組成和多樣性發(fā)生顯著改變。不論在人還是實驗動物中，IS都能降低腸道菌群多樣性、升高變形菌門腸桿菌科豐度。分析原因可能是IS這一急性應激誘導腸道缺血，缺血的腸道發(fā)生自由基反應產(chǎn)生大量硝酸鹽，從而利于變形菌門腸桿菌科這一進行硝酸鹽呼吸的菌群生長，進而加重炎癥反應，不利于IS預后[8]。

1.2 腸道菌群代謝產(chǎn)物水平的變化 腸道菌群代謝產(chǎn)物包括氧化三甲胺（trimethylamine oxide,TMAO）、短鏈脂肪酸（short chain fatty acids,SCFAs）等物質水平也受IS影響。

飲食中的營養(yǎng)素如膽堿等可由腸道菌群特異加工產(chǎn)生三甲胺（trimethylamine,TMA），TMA由腸道吸收后在肝臟單加氧酶作用下轉化為TMAO[19]。發(fā)生IS后，患者血漿TMAO水平呈現(xiàn)在急性期先升高后降低，在慢性期升高的動態(tài)變化[9]。以美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評分等于6分為界劃定的中重度IS患者血漿TMAO水平顯著高于輕度IS患者，并且在急性期升高的血漿TMAO水平與梗死體積增加相關[20]。血漿高TMAO水平不僅與梗死體積、IS嚴重度相關，還能增加IS復發(fā)及心血管事件風險[21]。發(fā)生IS后患者腸道菌群中產(chǎn)TMA細菌屬豐度升高可解釋血漿高TMAO水平這一現(xiàn)象，而產(chǎn)丁酸菌豐度降低也提示IS后SCFAs水平的變化[15-16]。

SCFAs由腸道菌群代謝不可消化纖維產(chǎn)生，包括醋酸、丁酸、丙酸等，可通過多種途徑發(fā)揮穩(wěn)定腸道作用，且近期已被證實可通過血腦屏障[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生IS后，患者和實驗動物的糞便SCFAs水平顯著降低[10,24]，實驗動物血漿SCFAs水平也顯著降低[23]。不論是人群研究還是動物實驗，IS后糞便SCFAs水平與神經(jīng)系統(tǒng)評分和腦梗死體積負相關[10,24]。不僅如此，糞便SCFAs水平還與IS患者長期功能預后評分負相關[10]。上述結果提示直接調控菌群代謝產(chǎn)物水平如TMAO、SCFAs，或能成為促進IS預后的方法之一。

2 腸道菌群影響IS后固有免疫

固有免疫的激活能顯著影響IS發(fā)展及預后。在IS超急性期腦實質小膠質細胞胞漿內(nèi)鈣超載引發(fā)白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18等促炎因子釋放，加重缺血性腦損傷[4,25]。IS后24 h可見大量與腦血管相關的單核細胞浸潤腦實質且在第3天達高峰[2,26]。IS后浸潤腦組織的巨噬細胞與循環(huán)血液巨噬細胞相比其識別與吞噬凋亡細胞的基因上調，如TREM1、JAK/STAT等信號轉導通路相關基因；在IS亞急性期連同小膠質細胞吞噬清除死亡神經(jīng)元[27]。浸潤缺血腦組織和損傷區(qū)域血管內(nèi)的中性粒細胞吞噬功能下降，表達高水平活性氧，加重缺血性腦損傷[28-30]。

IS發(fā)生后，浸潤腦組織的固有免疫細胞可來自腸道[5]。BREA等[5]利用光轉化技術發(fā)現(xiàn)腸道免疫細胞向周圍的轉移具有時間和空間的區(qū)別。在IS第3天，相較于免疫器官，腸源性CD11c+細胞更傾向轉移至腦組織、腦膜。特殊的情況是，腸源性CD11c+細胞的遷移呈現(xiàn)出組織特異性，表現(xiàn)為從腸道轉移至腦膜的CD11c+細胞主要為巨噬細胞，而從腸道轉移至腦組織的CD11c+細胞包含巨噬細胞和樹突狀細胞。在IS第14天，急性炎癥反應消退后，腸道免疫細胞向外周轉移的空間差異性消失。

通過調控腸道菌群及其代謝產(chǎn)物水平可影響IS后的免疫狀態(tài)。獲得性腸道菌群定植無菌小鼠與無菌小鼠相比，其缺血半球小膠質細胞、巨噬細胞數(shù)量增加且大量激活，促炎因子如IL-1β、腫瘤壞死因子-α轉錄上調[6]。通過飲食干預提高血漿TMAO水平可升高小鼠血液中促炎型單核細胞（Ly6Chigh）水平，清除腸道菌群后則作用消失[21]。但是補充SCFAs可顯著降低小鼠大腦小膠質細胞總數(shù)，并使其呈現(xiàn)分支增多、球形減少的低激活形態(tài)[23]。由此可見，需要有選擇性地調控腸道菌群和代謝產(chǎn)物水平。

3 腸道菌群影響IS后適應性免疫

IS發(fā)生后，T細胞浸潤缺血大腦半球。SELVARAJ等[1]發(fā)現(xiàn)在第14、30天小鼠缺血半球CD4+T、CD8+T細胞數(shù)量顯著升高，與更差的功能預后相關。但抗CD4+T細胞治療對小鼠梗死灶形成和死亡率無明顯影響[3]，削減IS慢性期CD8+T細胞數(shù)量卻能改善IS功能預后[1]。

IS發(fā)生后，外周適應性免疫細胞水平呈動態(tài)變化，且T細胞的變化與IS嚴重度和預后相關。LI等[32]發(fā)現(xiàn)IS患者血液B細胞占淋巴細胞百分比、CD8+T細胞占淋巴細胞百分比都表現(xiàn)為先升高后維持高水平的狀態(tài)，而CD4+T細胞百分比表現(xiàn)為先升高后恢復的動態(tài)改變。特別的是，CD4+調節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）百分比在入院、出院、發(fā)病1個月、發(fā)病3個月時表現(xiàn)為降低、升高、恢復、再升高的動態(tài)變化[32]。其中入院時CD4+Tregs水平降低與IS患者入院時更差的神經(jīng)功能、出院時更差的NIHSS評分和mRS評分相關，并能良好預測發(fā)病3個月時的mRS評分[32]。XIA等[33]證實，對小鼠進行特異性干預后，CD4+Tregs細胞數(shù)量的擴增可減少小鼠大腦梗死體積和神經(jīng)元死亡，并有利于長期預后。由此可見CD4+Tregs細胞的重要性，而B細胞對IS的作用則有待進一步研究。

綜上，動物實驗提示IS后腦組織浸潤CD4+T細胞數(shù)量增加與卒中不良預后相關，但抗CD4+T細胞并不能改善梗死的嚴重程度。而人群隊列的結果提示外周循環(huán)中CD4+Tregs數(shù)量下降與IS預后不良相關。多項研究的矛盾結果提示CD4+T細胞在IS過程中的復雜性，其中CD4+T細胞的另一個亞群輔助性T細胞（T helper cells,Th）17細胞也逐漸得到關注。發(fā)生IS后，盡管腦組織和循環(huán)血液中CD4+T細胞數(shù)量都有所增加，但Tregs/Th17比例都降低，伴隨促炎因子IL-17A水平升高、抑炎因子轉化生長因子-β水平降低[34-35]。而恢復腦組織和循環(huán)血液中的Tregs/Th17比例與IS后腦梗死體積減小以及長期功能預后相關[35]。因此，IS后CD4+T細胞、Tregs細胞、Th17細胞對IS預后所起作用需要綜合考量，仍需進一步研究。

腸道菌群及其代謝產(chǎn)物影響IS后外周適應性免疫。發(fā)生IS后，獲得性腸道菌群定植無菌小鼠與無菌小鼠相比脾臟T細胞、B細胞計數(shù)增加[6]，而增加的T細胞、B細胞部分來自腸道[5]。腸道中T細胞的數(shù)量變化與腸道菌群相關。IS后獲得性腸道菌群定植無菌小鼠與無菌小鼠相比，腸道派氏節(jié)中Th細胞、極化Tregs、Th17細胞計數(shù)增加，同時缺血大腦中上述T細胞的mRNA水平也相應升高[6]。有趣的是，補充SCFAs可顯著減少缺血腦組織的淋巴細胞數(shù)量和脾臟T細胞數(shù)量[23]。ASARAT等[36]證實SCFAs特別是丁酸鹽能升高Tregs百分比，增加IL-10表達量，并降低Th17細胞百分比。SCHWARZ等[37]同樣證實SCFAs能恢復循環(huán)血液中Tregs數(shù)量和IL-10、FOXP3表達量，恢復其免疫抑制功能。這些結果再次提示對菌群及代謝產(chǎn)物的調控需要有選擇性。

4 IS后調控腸道菌群的價值

如前所述，IS改變腸道菌群構成、代謝產(chǎn)物水平，這兩者可影響IS后的免疫狀態(tài)，并與IS預后相關。臨床研究證實IS后腸道菌群的改變?nèi)缒c桿菌科豐度升高加重IS嚴重度[8]。國內(nèi)一持續(xù)關注腸道菌群的研究團隊在2018年發(fā)表的研究中提出IS患者腸道菌群構成發(fā)生顯著改變后[38]，繼續(xù)進行前瞻性隊列研究證實IS后神經(jīng)危重癥患者腸道菌群中變形菌門腸桿菌科豐度升高與患者180 d死亡率相關[39]，該團隊進行兩個臨床隊列研究捕捉IS后腸道菌群的動態(tài)改變及其與IS預后的關系，并建立IS動物模型進一步闡釋了相關機制，提出腦缺血迅速誘導腸道缺血并通過自由基反應產(chǎn)生過量硝酸鹽導致腸道生態(tài)失調伴隨腸桿菌科擴增，通過促進全身炎癥加重腦梗死[8]。

通過調整腸道菌群可減輕小鼠缺血性腦損傷和神經(jīng)功能缺陷、減小梗死體積，減輕腦水腫[24,40-41]。獲得性腸道菌群定植無菌小鼠與無菌小鼠相比腦梗死體積減小[6]，但發(fā)生IS后，使用聯(lián)合抗生素清除腸道菌群的小鼠腦梗死體積也減少。而接受萬古霉素、氨芐西林單一處理的小鼠腸道擬桿菌S24-7豐度降低；疣微菌科、乳酸桿菌科、伯克氏菌科、鏈球菌科等豐度增加，都分別與大腦梗死體積降低有關[40]。這些結果提示進行菌群調控時要區(qū)分清除有害菌為主的異常菌群還是恢復有益菌為主的正常菌群。

腸道菌群代謝產(chǎn)物也可影響IS預后。急性IS患者糞便SCFAs水平下降，與IS不良功能預后相關[10]。在動物實驗中補充丁酸鹽、乙酸鹽都能恢復腸道菌群的多樣性和豐度，減小梗死體積，改善功能預后[12,24]。分析可能原因為補充SCFAs后，外周免疫器官及浸潤中樞神經(jīng)系統(tǒng)的淋巴細胞數(shù)量降低，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質細胞形態(tài)、數(shù)量、釋放細胞因子的變化提示其處于未激活狀態(tài)。進一步通過干預淋巴細胞缺陷型Rag1-/-小鼠闡明循環(huán)中的淋巴細胞介導了SCFAs對小膠質細胞的作用[23]。上述結果提示補充SCFAs能通過循環(huán)中的淋巴細胞調節(jié)小膠質細胞激活狀態(tài)發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

IS發(fā)生后，腸道菌群構成及代謝產(chǎn)物水平顯著改變，如腸桿菌科豐度升高、急性期TMAO水平升高、SCFAs水平降低等。多項研究都指出IS后腸桿菌科豐度升高，與IS嚴重度和預后相關，其中機制之一為IS后腸桿菌科豐度升高可促進全身炎癥反應。動物實驗已證實，調控腸道菌群及其代謝產(chǎn)物可降低小膠質細胞激活狀態(tài)、影響IS后的固有免疫、獲得性免疫，可改善IS預后。然而，在動物實驗中所得成果尚缺乏臨床數(shù)據(jù)支持和機制解釋。雖然已有團隊逐步探明，IS引起腸缺血后造成腸桿菌科擴增，通過促進炎癥反應影響IS預后，但關于IS影響腸道菌群的機制以及腸道菌群影響IS預后的機制研究仍然欠缺。腸桿菌科、SCFAs和免疫系統(tǒng)特別是CD4+Tregs細胞的參與都是重要的因素之一。