王璐，范伊琳，王子朝,3，郭佳源，王琦，牛夢，師怡寧

1.河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.華商國際工程有限公司，北京 100069；3.河南工業(yè)大學 國家工程實驗室/省重點實驗室，河南 鄭州 450001；4.河南工業(yè)大學 國際教育學院，河南 鄭州 450001

0 引言

腸道微生物對宿主的健康至關重要，在營養(yǎng)、發(fā)育、代謝、病原體抗性、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用[1]。黃酮是主要由2個苯環(huán)(A環(huán)和B環(huán))與3個碳原子橋連接形成的具有C6—C3—C6結構，且廣泛存在于植物根、葉、花和種子中的化合物[2-3]。作為酚類化合物，黃酮不僅具有抗氧化、抗菌和抗癌活性[4]，還能夠與腸道微生物相互作用[5]。已有研究[6]證實，黃酮可通過調(diào)節(jié)細胞因子改變腸道微生物區(qū)系進而調(diào)節(jié)腸道免疫功能。李明等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物可調(diào)節(jié)炎癥性腸病患者腸道菌群，促進腸道微生態(tài)平衡。B.Chen等[8]證實，在小鼠日糧中添加天然黃酮衍生物可顯著減輕右旋糖酐硫酸鈉誘導小鼠結腸炎的嚴重程度。白利琴[9]研究發(fā)現(xiàn)，多糖、黃酮復配物能夠抑制大鼠腸道中有害菌繁殖并促進有益菌增長。此外，近年來不斷有學者發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物對體重也有一定的調(diào)控作用，如E.F.Hoek-van den Hil等[10]研究發(fā)現(xiàn)，所有黃酮類化合物均可顯著抑制小鼠因高脂飲食誘導的體重增加；V.Panda等[11]研究也表明，富含黃酮的菠菜葉提取物能夠增強大鼠飽腹感從而降低其食欲，進一步達到減輕大鼠體重的效果。

隨著生活水平的提高和生活方式的改變，不合理飲食結構成為影響人們身體健康的重要因素。腸道菌群是寄居在人體腸道內(nèi)的微生物群落，參與人體的營養(yǎng)、代謝、免疫調(diào)節(jié)等過程，與多種代謝性疾病、免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，在膳食與人類健康中發(fā)揮著重要的橋梁作用。因此，從人們生活中不可替代的飲食入手，通過提高飲食的功能屬性，可為提升人體健康和預防疾病的發(fā)生發(fā)展做出重要貢獻。課題組前期研究[12]中，通過對絞股藍內(nèi)生真菌CGMCC 6882(C.globosumCGMCC 6882)進行發(fā)酵獲得了一種黃酮類化合物，但該黃酮類化合物的安全性及生物活性卻并不明確?；诖?，本研究擬對小鼠灌喂C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物，檢測小鼠體重及肝臟、蛋白代謝、腎臟等血清生化指標，并分析小鼠腸道菌群物種組成和多樣性、代謝物短鏈脂肪酸(SCFAs)種類和含量變化，研究該黃酮類化合物對小鼠生長和腸道菌群的影響，以期為黃酮類化合物通過腸道菌群影響機體營養(yǎng)與健康的機理研究提供指導或參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

黃酮類化合物，其生產(chǎn)、制備、分離、純化等均參照付乾振等[12]的方法進行。SPF級昆明小鼠60只(批準號SCXK：2017-0002，體重(20±1)g，雄性)，購于鄭州大學實驗動物中心。H2SO4、乙醚等，均為分析純，購于天津市科密歐化學試劑公司。

1.2 主要儀器與設備

AU5800型全自動生化分析儀，美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)；7890A型高效氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)；XFH-50CA型電熱式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)；TGL-16gR型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產(chǎn)；YP10002型電子天平，余姚市金諾天平儀器有限公司產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 急性毒性動物實驗將SPF級昆明小鼠在溫度(24±1)℃、濕度(60±5)%條件下，正常飼養(yǎng)7 d(每天分別于光照和黑暗中各培養(yǎng)12 h)進行小鼠適應性生長；挑選42只生長活潑、無異樣且體重相近的小鼠，根據(jù)實驗天數(shù)，將空白對照組分成4組(CON1，CON7，CON14，CON21)，將C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物組(即實驗組)分成3組(TES7，TES14，TES21)，共7組，每組6只，實驗前12 h禁食不禁水；給實驗組小鼠每1 g體重灌服5 mgC.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物溶液，給空白對照組小鼠灌喂等量質(zhì)量濃度為0.9%的生理鹽水，實驗組和空白對照組均隔天灌喂1次。

1.3.2 小鼠血清及腸道菌群的采集在實驗的第1 d、7 d、14 d、21 d對小鼠逐只稱重，而后采用摘眼球法收集血液用于小鼠血液生化指標檢測。取血后，采用頸椎脫臼法殺死小鼠并進行解剖，無菌條件下取小鼠盲腸內(nèi)容物于滅菌的1.5 mL EP管中并標記。同時，將裝有盲腸內(nèi)容物的EP管用封口膜密封并放于冰箱中，于-20 ℃冷藏，用以檢測腸道菌群。

1.3.3 小鼠血清指標的檢測小鼠血液樣品在4 ℃、3500 r/min條件下離心10 min，收集上層血清并用全自動生化分析儀檢測總蛋白、白蛋白、球蛋白、尿酸、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶等指標。

1.3.4 糞便細菌DNA提取與生物信息分析將盲腸內(nèi)容物放于燒杯中，加入4 mL去離子水并攪拌，用細菌DNA試劑盒提取小鼠糞便中的細菌總DNA，并對提取的DNA樣本進行質(zhì)檢，檢驗合格的樣本用于后續(xù)分析。以16 S rDNA“V3+V4”高變區(qū)序列設計引物，進行腸道菌群DNA的PCR擴增，引物序列為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。將PCR擴增產(chǎn)物純化后測序，無誤則采用FLASH(v1.2.8)軟件將序列拼接成高質(zhì)量Tags，并將序列建庫引入的Barcode和引物序列去除，然后采用Vsearch(v2.3.4)軟件過濾嵌合體。將相似度大于97%的序列聚類為操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)，而后進行OTU聚類分析和物種分類學分析。

1.3.5SCFAs含量測定將0.1 g盲腸內(nèi)容物懸浮于500 μL飽和NaCl溶液中，加入20 μL 體積分數(shù)為10%的H2SO4溶液進行酸化；加入1.2 mL乙醚后，將混合物在4 ℃、8000 r/min條件下離心10 min，取有機上清液，加入0.25 g Na2SO4混合5 min以除去水分；用0.22 μm有機濾膜過濾上清液并用高效氣相色譜儀進行測定。

色譜條件：載氣N2；分流比20∶1，流速1.5 mL/min；色譜柱HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，溫度由60 ℃提高到190 ℃，維持4 min；注射溫度200 ℃，電離溫度250 ℃；進樣量5 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)結果以(平均值±標準差)表示。采用SPSS18.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，*代表差異顯著(P<0.05),**代表差異極顯著(P<0.01)。利用Origin 2017繪圖。

2 結果與分析

2.1 黃酮類化合物的生物安全性評價分析

黃酮作為一種天然活性物質(zhì)，其安全性已得到學者們的普遍認可。B.Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，柑橘黃酮衍生物對小鼠沒有明顯的毒性，不會造成小鼠不良反應；王偉等[13]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素黃酮類化合物對人源巨噬細胞THP-1無細胞毒性作用。本研究中，筆者對C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物的安全性進行研究發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠生長狀態(tài)良好，無明顯不良反應，無死亡情況，初步證明該黃酮類化合物對小鼠安全無毒。同時，筆者對不同生長時期各組小鼠血清的生理生化指標進行了檢測，結果見表1，其中，不同小寫字母代表組間差異顯著(P<0.05)，下同。由表1可知，灌喂C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物后，小鼠肝功能(谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、谷氨酰轉肽酶)、蛋白代謝(總蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比)、腎功能(尿素、肌酐、尿酸)等生理生化指標均在正常范圍內(nèi)，這進一步證明C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物安全無毒。

2.2 黃酮類化合物對小鼠體重的影響分析

肥胖可引起高血壓、高血脂、高血糖、心腦血管等疾病，除加強運動及控制飲食之外，還可通過調(diào)整飲食結構或改善食物的健康性預防和控制肥胖[14]。黃酮類活性物質(zhì)的體重調(diào)控作用已逐漸得到學者們認可，如周敬凱等[15]研究發(fā)現(xiàn)，地菍總黃酮能夠抑制高脂飲食的轉化與吸收，控制小鼠體重的增長；馬欣雨等[16]研究發(fā)現(xiàn)，王不留行黃酮苷能夠顯著降低動脈粥樣硬化小鼠體重。本研究各組小鼠體重變化見表1。由表1可知，空白對照組與實驗組小鼠體重均隨飼養(yǎng)時間的延長而增加，但實驗組小鼠體重增加速率低于空白對照組。飼養(yǎng)21 d后，空白對照組小鼠凈增體重為9.5 g，而實驗組小鼠凈增體重為7.2 g，說明C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物有抑制小鼠體重增加的效果，與上述其他學者的研究結果一致。

表1 各組小鼠的血清生理生化指標檢測結果及體重變化Table 1 Results of serum physiological and biochemical indexes and weight changes of mice in each group

2.3 黃酮類化合物對小鼠腸道菌群Alpha多樣性的影響分析

腸道菌群在肥胖發(fā)生發(fā)展中的作用已得到學者廣泛認同，R.Q.Duan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，全谷燕麥類黃酮能夠顯著降低高脂飲食小鼠的體重和脂質(zhì)沉積。腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)可衡量物種的豐度和多樣性。Ace指數(shù)的數(shù)值越大，表示該環(huán)境的物種越豐富，各物種分配越均勻；Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)的數(shù)值越高，表示生物多樣性越豐富；Simpson指數(shù)的數(shù)值越高，則表示生物多樣性越稀少[18]。各組小鼠腸道菌群Alpha多樣性見表2，其中，*代表差異顯著(P<0.05)，**代表差異極顯著(P<0.01)，下同。由表2可知，飼養(yǎng)21 d后，空白對照組的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)分別由401.419、404.967、3.844上升至416.060、426.884、4.302，實驗組的Ace指數(shù)指數(shù)、Chao1和Shannon指數(shù)分別由435.613、411.362、4.103上升至489.964、437.074、4.557；空白對照組的Simpson指數(shù)由0.074降至0.043，而實驗組的Simpson指數(shù)由0.048降至0.026。這表明C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物可顯著增加小鼠腸道菌群Alpha多樣性。王方杰等[19]研究也發(fā)現(xiàn)，對高脂飲食誘導的肥胖小鼠灌喂胡柚黃酮8周后，與對照組相比，其Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著上升，Simpson指數(shù)顯著下降，腸道菌群多樣性逐漸增加并達到最大值，該結果與本研究結果一致。

各組小鼠腸道菌群的韋恩(Venn)圖如圖1所示。由圖1可知，空白對照組與實驗組在第1 d、7 d、14 d和21 d共有的OTU數(shù)為272個；空白對照組在第7 d、14 d和21 d單獨具有的OTU數(shù)分別為5個、0個和3個；實驗組在第7 d、14 d和21 d單獨具有的OTU數(shù)分別為0個、4個和4個。同時，空白對照組在第1 d、7 d、14 d和21 d的OUT總數(shù)分別為426個、435個、452個和468個，而實驗組在第7 d、14 d和21 d的OUT總數(shù)分別為484個、499個和507個。飼養(yǎng)時間相同時，實驗組的OUT數(shù)均高于空白對照組，表明C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物可增加小鼠腸道菌群豐度。

表2 各組小鼠腸道菌群Alpha多樣性Table 2 Alpha diversity in gut microbiota of mouse in each group

圖1 各組小鼠腸道菌群的Veen圖Fig.1 Veen diagram of mice gut microbiota in each group

綜上所述，C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物可能通過提高小鼠腸道菌群豐度和多樣性以減輕小鼠體重。

2.4 黃酮類化合物對小鼠腸道菌群門水平上Firmicutes/Bacteroidetes(F/B)值的影響分析

肥胖人群和動物的腸道菌群與厚壁菌門(Firmicutes)水平升高和擬桿菌門(Bacteroidetes)水平降低有關，即這兩類菌在肥胖發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用[20]。各組小鼠腸道菌群門水平上的組成如圖2所示。由圖2可知，空白對照組與實驗組小鼠腸道中主要檢測出厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、藍細菌門(Cyanobacteria)，其中厚壁菌門與擬桿菌門占細菌總數(shù)的95%以上。各組小鼠腸道菌群門水平上F/B值變化趨勢如圖3所示。由圖3可知，飼養(yǎng)第7 d、14 d、21 d，空白對照組小鼠腸道內(nèi)的F/B值分別為0.771 6、0.768 9和0.745 8，實驗組小鼠腸道內(nèi)的F/B值則為0.413 3、0.365 8和0.354 7，表明C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物能夠降低小鼠腸道中的F/B值。A.Koliada等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，隨著人體重指數(shù)增加，厚壁菌門總數(shù)逐漸增加，擬桿菌門總數(shù)逐漸減少，F(xiàn)/B值隨體重增加而增加；R.E.Ley等[22]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠盲腸微生物區(qū)系厚壁菌門的占比顯著增加，而擬桿菌門占比相較于瘦小小鼠減少了50%。但也有研究表明，F(xiàn)/B值與肥胖無關，如R.Y.Gao等[23]研究發(fā)現(xiàn)，表皮黑棘皮癥組和無表皮黑棘皮癥組間的F/B值無顯著差異，而表皮黑棘皮癥是胰島素抵抗肥胖者最常見的皮膚病表現(xiàn)。本研究中，C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物組小鼠體重的降低可能與其腸道中F/B值降低相關。

圖2 各組小鼠腸道菌群門水平上的組成Fig.2 Composition of mice gut microbiota at phylum level in each group

圖3 各組小鼠腸道菌群門水平上F/B值變化趨勢圖Fig.3 Trend of F/B values at phylum level of mice gut microbiota in each group

2.5 黃酮類化合物對小鼠腸道菌群SCFAs的影響分析

SCFAs來源于腸道微生物對難消化食物的發(fā)酵，其具有重要代謝功能，對腸道健康至關重要，可作為腸道微生物與宿主間的重要分子信號，或作為調(diào)節(jié)宿主細胞代謝的新陳代謝基質(zhì)[24]。各組小鼠腸道菌群的SCFAs變化如圖4所示。由圖4可知，空白對照組小鼠腸道內(nèi)乙酸、丙酸、丁酸和總酸含量在飼養(yǎng)期間無顯著變化，均值分別為19.0 μmol/g、8.0 μmol/g、6.9 μmol/g和33.9 μmol/g。實驗組小鼠 腸道內(nèi)乙酸、丙酸、丁酸和總酸含量則分別由22.1 μmol/g、9.3 μmol/g、8.1 μmol/g和39.5 μmol/g上升至29.3 μmol/g、15.2 μmol/g、9.5 μmol/g和54.0 μmol/g，表明C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物可增加小鼠腸道菌群中的SCFAs含量。Y.Y.Lu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs可通過抑制米色脂肪生成及促進甘油三酯與游離脂肪酸水解而降低高脂飲食誘導的小鼠體重增加；此外，SCFAs還能通過增加飽腹感影響食物攝入量[26]。本研究中C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物降低小鼠體重的原因可能與上述2個機理相關，但其具體調(diào)控機制還需要深入研究和探討。

3 結論

本實驗通過灌喂小鼠C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物，檢測了小鼠體重及肝臟、蛋白代謝、腎臟等血清生化指標，分析了小鼠腸道菌群物種組成和多樣性、代謝物SCFAs種類和含量變化，研究了C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物對小鼠生長和腸道菌群的影響。發(fā)現(xiàn)C.globosumCGMCC 6882發(fā)酵所產(chǎn)黃酮類化合物對小鼠安全無毒，可有效減輕小鼠體重，提高小鼠腸道菌群多樣性和豐度，增加腸道菌群門水平上F/B值，同時，在代謝水平上可增加小鼠腸道菌群中的SCFAs含量。本研究結果對黃酮類化合物能夠減輕小鼠體重具有一定的借鑒意義。

圖4 各組小鼠腸道菌群的SCFAs變化
Fig.4 Changes of SCFAs of mice gut microbiota in each group

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