梁 燕，崔馨戈，訾苗苗，汪 杰，劉 艷，王 茜,2,3,4，彭 燦,2,3,4

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；3. 藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；4. 安徽省中醫(yī)藥研究院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012)

在藥物代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮著不可替代的作用，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能可以被藥物改變。OATP1B3隸屬于攝取型陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion transporting polypeptides，OATPs)家族，其特異性表達(dá)在肝臟基底膜，在藥物體內(nèi)吸收、分布、排泄、相互作用中具有重要作用。臨床上，有很多藥物和內(nèi)源性物質(zhì)均為OATP1B3的底物，如他汀類藥物[1-2]、利福平[3]、替米沙坦[4]、八肽膽囊收縮素[5]，同時(shí)利福平也為OATP1B3的抑制劑。黃芩-黃連藥對(duì)是臨床上常用的組方，2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》記載已有50多種方劑中伍用黃連-黃芩，兩者合用具有廣泛的藥理作用[6-7]，并且在抗炎、治療高血糖等方面協(xié)同發(fā)揮治療作用。研究表明，黃芩黃酮類主要成分黃芩苷和漢黃芩苷為OATP1B3的底物[8-9]，黃連中主要成分小檗堿亦為其底物[10]，黃芩苷、漢黃芩苷與小檗堿之間可能存在OATP1B3轉(zhuǎn)運(yùn)體底物的相互作用。同時(shí)，黃連可引起黃芩苷、漢黃芩苷的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)特征改變[11-12]。由此推測(cè)，黃連使黃芩黃酮體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)特征改變的機(jī)制是由于黃連中主要成分引起OATP1B3對(duì)黃芩主要成分黃芩苷和漢黃芩苷的轉(zhuǎn)運(yùn)功能改變。因此，本實(shí)驗(yàn)從OATP1B3轉(zhuǎn)運(yùn)體角度，驗(yàn)證黃連生物堿對(duì)OATP1B3介導(dǎo)的黃芩苷、漢黃芩苷轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，旨在為黃芩黃酮的肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)過程機(jī)制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；AB SCIEX 4500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)ABSCIEX公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)heidolph公司；超聲波清洗儀：常豐市萬(wàn)豐儀器制造有限公司；BT25S型電子分析天平：德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；渦旋混勻機(jī)、減壓干燥箱：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；-80 ℃冰箱：日本Sanyo/合肥美菱公司；Centrifuge 5430R 4 ℃離心機(jī)：上海迪圖生物科技有限公司；Bioprep-24生物樣品均質(zhì)儀：杭州奧盛儀器有限公司；垂直電泳系統(tǒng)：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 材料及試藥 黃芩苷(批號(hào) P20A9F59353)、漢黃芩苷(批號(hào) R31M9F62605)、利膽酚(批號(hào) J10M8Y35798)、小檗堿(批號(hào) P02A7F12369)、鹽酸巴馬汀(批號(hào) Z16J10X79792)、藥根堿 (批號(hào) P01A9F67139)、黃連堿(批號(hào) Z22A10X94861)：上海源葉科技有限公司；黃連藥材(批號(hào) 180919)：蘇州市天靈中藥飲片有限公司；黃芩藥材(批號(hào) 180710)：南通三越中藥飲片有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、胰酶、T25培養(yǎng)瓶：Gibco；HBSS緩沖液：索萊寶；甲酸、乙腈、甲醇(LC/MS級(jí))：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；超純水：由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室Millipore超純水系統(tǒng)生成。

1.3 細(xì)胞株 HEK293-OATP1B3細(xì)胞購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因有限公司。

2 方法

2.1 主要工作液的配制

2.1.1 細(xì)胞用儲(chǔ)備液的配制 精密稱定黃芩苷、漢黃芩苷適量，加入二甲基亞砜溶解，配制成濃度為50 mmol/L的母液，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。精密稱定小檗堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀、黃連堿適量，加入二甲基亞砜溶解，配制終濃度為30 mmol/L的母液，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 定量用儲(chǔ)備液的配制 精密稱定黃芩苷、漢黃芩苷適量，加入甲醇溶解，配制成濃度為1 mg/mL的母液，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo GOLD色譜柱(2.1 mm×100 mm, 3 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.2 mL/min。洗脫條件：0～4 min, 60%～30% A; 4～4.5 min, 30%～60% A; 4.5～5 min,60% A。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧電離源(electron spray ionization, ESI)；掃描方式：多反應(yīng)離子檢測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)模式，正離子模式下測(cè)定；離子化電壓為5 500 V；離子源溫度:400 ℃；去溶劑化溫度：500 ℃；毛細(xì)管電壓：3 600 V。內(nèi)標(biāo)物為利膽酚。各化合物離子對(duì)、去簇電壓、碰撞電壓參數(shù)見表1。

表1 黃芩苷、漢黃芩苷和利膽酚的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 細(xì)胞毒性 采用MTS法對(duì)不同濃度藥物給藥后的HEK293-OATP1B3細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。取生長(zhǎng)良好的HEK293-OATP1B3細(xì)胞，細(xì)胞濃度為每毫升 5×105個(gè)，接種于 96 孔板中，設(shè)置空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組(小檗堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀、黃連堿濃度梯度均為200、160、120、100、80、60、40、30、20、10、5 μmol/L)，每組6個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 24 h后取出，每孔加入 20 μL 的 MTS 溶液，隨后放回培養(yǎng)箱中溫孵 1 h，最后用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng) 490 nm)檢測(cè)各孔的吸光度值(absorbance，A)，根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組- A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

2.4 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(正常培養(yǎng)的目的細(xì)胞HEK-293加陰性對(duì)照病毒感染)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組(正常培養(yǎng)的目的細(xì)胞HEK-293加目的基因過表達(dá)病毒感染)，抑制劑組(陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別給予不同濃度的小檗堿、黃連堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀)。抑制劑組細(xì)胞操作如下：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，細(xì)胞密度為每毫升5×105個(gè)，每孔1 mL，接種于24孔板中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。吸棄24孔板中舊培養(yǎng)基，加入37 ℃預(yù)熱的HBSS緩沖液，反復(fù)清洗細(xì)胞2～3次，然后加入200 μL 37 ℃預(yù)熱的HBSS緩沖液預(yù)孵育10 min。預(yù)孵育結(jié)束后，取出24孔板，每孔加入0.2 mL含藥HBSS溶液(底物濃度：黃芩苷5 μmol/L、漢黃芩苷5 μmol/L；抑制劑濃度：小檗堿10、30、100 μmol)，藥根堿10、30、100 μmol/L，鹽酸巴馬汀10、30、100 μmol/L，黃連堿10、30、100 μmol/L)進(jìn)行攝取實(shí)驗(yàn)，孵育時(shí)間為15 min。待攝取結(jié)束后，吸棄孔中液體，加入預(yù)冷的HBSS緩沖液終止攝取，并清洗細(xì)胞2～3遍，最后吸盡孔中液體，每個(gè)孔中加入200 μL 無(wú)菌水，放置-80 ℃冰箱反復(fù)凍融3次。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)操作同上(底物濃度：黃芩苷5 μmol/L、漢黃芩苷5 μmol/L，孵育時(shí)間為15 min)。

2.5 細(xì)胞樣品處理 取細(xì)胞破碎液100 μL，加入100 μL含內(nèi)標(biāo)甲醇，渦旋震蕩2 min，在4 ℃下15 000 r/min離心15 min，取上清液，于0.22 μm微孔濾膜過濾備用。取細(xì)胞破碎液適量用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，測(cè)定蛋白含量。

2.6 樣品含量測(cè)定 取“2.5”項(xiàng)下制備的細(xì)胞樣品，按“2.2”項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣,測(cè)定細(xì)胞破碎液中黃芩苷、漢黃芩苷的含量。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察 在本實(shí)驗(yàn)分析條件下[8,13]，細(xì)胞樣品中黃芩苷、漢黃芩苷、內(nèi)標(biāo)利膽酚色譜分離良好，通道中無(wú)雜質(zhì)峰干擾，專屬性良好。見圖2。

精密吸取100 μL空白細(xì)胞破碎液，加入100 μL系列濃度甲醇混標(biāo)溶液(含內(nèi)標(biāo))，前處理后進(jìn)樣LC-MS/MS?？v坐標(biāo)為黃芩苷、漢黃芩苷峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，橫坐標(biāo)為濃度，采用1/(X2)加權(quán)方法，求得的直線回歸方程見表2。

表2 細(xì)胞中黃芩苷、漢黃芩苷的線性方程

細(xì)胞樣品低、中、高濃度的各質(zhì)量控制樣品精密度的RSD為1.37%～7.28%；準(zhǔn)確度為-4.00% ～ 10.24%；提取回收率為93.37%～103.05%；24 h內(nèi)穩(wěn)定性的RSD為2.26%～4.68%。結(jié)果表明該方法對(duì)于細(xì)胞樣品的精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率良好，并且樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，滿足測(cè)定要求。

3.2 細(xì)胞毒性 小檗堿、藥根堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性結(jié)果見圖2。當(dāng)4種生物堿濃度在0～100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率均保持在90%以上，因此本實(shí)驗(yàn)選擇0～100 μmol/L作為給藥區(qū)間。

3.3 細(xì)胞攝取 陽(yáng)性底物替米沙坦攝取結(jié)果顯示，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞攝取量為7.14 nmol/mg,陰性對(duì)照組細(xì)胞攝取量為0.42 nmol/mg，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞攝取量約為陰性對(duì)照組細(xì)胞的16倍，表明陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞攝取功能良好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)選取了黃連中4種主要生物堿成分作為抑制劑，每種生物堿設(shè)置了3個(gè)濃度梯度進(jìn)行考察。陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組對(duì)黃芩苷和漢黃芩苷的攝取量遠(yuǎn)高于陰性對(duì)照組，表明黃芩苷和漢黃芩苷均為OATP1B3的底物。抑制劑組的黃芩苷、漢黃芩苷攝取量遠(yuǎn)低于陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組，表明4種生物堿均可顯著抑制HEK293-OATP1B3細(xì)胞對(duì)黃芩苷和漢黃芩苷的攝取(P<0.05)。見圖3。

注：1.利膽酚；2.黃芩苷；3.漢黃芩苷

注：A.小檗堿；B.藥根堿；C.黃連堿；D.鹽酸巴馬汀

注：A.陰性對(duì)照組；B.陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組；C. 10 μmol/L小檗堿組；D. 30 μmol/L小檗堿組；E. 100 μmol/L小檗堿組；F. 10 μmol/L黃連堿組；G. 30 μmol/L黃連堿組；H. 100 μmol/L黃連堿組；I. 10 μmol/L藥根堿組；J. 30 μmol/L藥根堿組；K. 100 μmol/L藥根堿組；L. 10 μmol/L鹽酸巴馬汀組；M. 30 μmol/L鹽酸巴馬汀組；N. 100 μmol/L鹽酸巴馬汀組

4 討論

黃芩主要活性成分是黃酮類化合物，如黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素[14-15]，黃芩中黃酮類化合物具有多種藥理活性，可用于治療糖尿病、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等。小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、黃連堿、表小檗堿等生物堿是黃連主要活性成分[16]，常用于治療腹瀉，并被證實(shí)具有顯著的廣譜抗菌和抗炎活性。黃芩-黃連作為藥對(duì)配伍使用，是瀉心湯等眾多復(fù)方重要組方成分，常用于治療陽(yáng)明熱病[6]；在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中，常用于治療2型糖尿病[7]。目前，對(duì)于黃芩黃酮的腸道吸收機(jī)制已有研究[11,17]，但是并不足以說明黃芩、黃連合用后藥理學(xué)和治療效果發(fā)生改變的潛在機(jī)制，因此黃芩、黃連的配伍機(jī)制仍具有較高的研究?jī)r(jià)值。

動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)雖然能準(zhǔn)確地反映黃芩-黃連聯(lián)合給藥后的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)變化,但很難從細(xì)胞或分子水平上闡明二者之間相互作用的影響機(jī)制。HEK293細(xì)胞是一種細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用工具細(xì)胞，具有轉(zhuǎn)染效率高、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染OATP1B3的HEK293細(xì)胞常用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)功能的考察[8,18]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇HEK293-OATP1B3細(xì)胞用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)功能的考察，選擇OATP1B3的特異性陽(yáng)性底物替米沙坦[4]進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能的驗(yàn)證，結(jié)果表明該細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能良好，適合用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

課題組的前期研究已經(jīng)證實(shí)，黃芩黃酮的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程受OATP1B3轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控，并且黃芩苷和漢黃芩苷為OATP1B3轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物[8,11]，同時(shí)已有報(bào)道[10]證明，黃連主要成分小檗堿也為該轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物。但是在常用藥對(duì)黃芩-黃連配伍中，黃連對(duì)OATP1B3轉(zhuǎn)運(yùn)黃芩苷和漢黃芩苷功能的影響尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃連生物堿影響OATP1B3轉(zhuǎn)運(yùn)黃芩苷和漢黃芩苷的功能進(jìn)行驗(yàn)證。在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，黃芩苷、漢黃芩苷的攝取條件參考課題組前期的細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果[8]，然后選用黃連中含量較多的生物堿成分作為抑制劑，發(fā)現(xiàn)黃連主要生物堿成分均具有抑制OATP1B3轉(zhuǎn)運(yùn)黃芩苷和漢黃芩苷的功能。

綜上所述，黃連生物堿可抑制OATP1B3對(duì)黃芩苷和漢黃芩苷的轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，推測(cè)黃連改變黃芩黃酮體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)特征的機(jī)制與黃連抑制OATP1B3對(duì)黃芩苷和漢黃芩苷的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，但其體內(nèi)變化的具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。