尹竺晟，梁新軍

0 引言

熱療作為一種綠色安全的腫瘤治療手段，目前在臨床上常作為放化療的輔助療法，其與抗腫瘤免疫機(jī)制的基礎(chǔ)研究越來越受到重視。近年來，隨著眾多熱療技術(shù)包括射頻消融、磁熱療、聚焦超聲熱療、腹腔熱灌注治療、納米顆粒介導(dǎo)的熱療等發(fā)展，熱療在臨床上的應(yīng)用也越來越廣闊?，F(xiàn)將腫瘤熱療與抗腫瘤免疫之間的研究進(jìn)展作一綜述。

1 熱療抗腫瘤機(jī)制

熱療是根據(jù)腫瘤組織與正常組織對溫度的差異應(yīng)激，對病變部位進(jìn)行加熱，以殺死腫瘤細(xì)胞或阻止其生長的一種治療方法。腫瘤代謝水平普遍較正常組織高，腫瘤血管的異常發(fā)育讓大多數(shù)實體腫瘤組織存在乏氧的情況，在熱療過程中，癌旁組織血流量增加導(dǎo)致腫瘤組織血液供應(yīng)進(jìn)一步減少，從而減少了腫瘤所獲得的氧以及營養(yǎng)物質(zhì)，在短時間內(nèi)提高腫瘤糖酵解代謝水平，使酸性代謝產(chǎn)物大量堆積，從而引起腫瘤細(xì)胞自噬[1]。根據(jù)溫度高低，熱療可分為發(fā)熱范圍溫度熱療（39℃～40℃）、中溫?zé)岑煟嵝菘藴囟龋?1℃～43℃）和熱消融（細(xì)胞毒性溫度，＞43℃）。發(fā)熱范圍溫度熱療會增加血流量，從而減少缺氧，而更高的溫度則會導(dǎo)致血管損傷，加劇缺氧，也會誘導(dǎo)更直接的腫瘤細(xì)胞殺傷[2]。隨著技術(shù)的進(jìn)步，目前新開發(fā)的熱療手段還包括磁性納米粒子熱療、低溫?zé)岑熀凸鉄岑煼ā?/p>

熱療也可以直接或間接殺死缺氧細(xì)胞。直接殺傷細(xì)胞強(qiáng)烈依賴于加熱溫度和加熱時間；溫度越高，加熱時間越長，效果越顯著。一般而言，低于42℃的溫度對細(xì)胞幾乎沒有殺傷作用，除非暴露時間較長[3]。如果細(xì)胞保持在缺氧或低pH值狀態(tài)下，則若溫度高于42℃，熱療產(chǎn)生的細(xì)胞殺傷效果會更加明顯[4]。當(dāng)溫度低于43℃時，細(xì)胞凋亡似乎占主導(dǎo)地位，溫度更高則以細(xì)胞壞死居多。高溫可引起DNA雙鏈斷裂，這是由于熱修復(fù)蛋白（如DNA聚合酶）的變性和功能障礙，或變性蛋白沉淀在核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)上，阻止修復(fù)酶到達(dá)損傷部位[5]。熱療誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性也可改變多種依賴核基質(zhì)的功能（如DNA復(fù)制、DNA轉(zhuǎn)錄、信使核糖核酸（mRNA）加工和DNA修復(fù)）；因此，由熱療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，通過不同的機(jī)制，可以促進(jìn)抗原的呈遞或釋放，增加將免疫細(xì)胞吸引到腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）的信號分子[6]。

2 熱療對免疫微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞的交互影響

熱療可以提高機(jī)體自身抗腫瘤免疫水平，其效果不僅可以直接殺死腫瘤細(xì)胞，還可以直接或間接激活機(jī)體免疫系統(tǒng)。然而，熱療引起抗腫瘤免疫的具體機(jī)制尚不完全清楚，國內(nèi)外已經(jīng)開展了大量研究，并嘗試著從各種視角探討熱療促進(jìn)免疫反應(yīng)的可能機(jī)制。

2.1 改變腫瘤細(xì)胞免疫原性及能量代謝

有數(shù)據(jù)支持大多數(shù)細(xì)胞抑制療法在癌癥患者中誘發(fā)繼發(fā)性壞死的觀點，大多數(shù)化療藥物和放射線引起癌細(xì)胞凋亡而不是原發(fā)性壞死[7]。而經(jīng)熱療后，大量腫瘤細(xì)胞壞死，暴露出新的腫瘤相關(guān)抗原，刺激免疫系統(tǒng)，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞的凋亡和繼發(fā)性壞死。微環(huán)境中“能量元件”的成分改變也能影響腫瘤免疫原性的改變。有研究表明高水平的細(xì)胞外ATP在腫瘤部位積聚，TME中這些高水平的細(xì)胞外ATP通過P2X7受體抑制腫瘤生長，即通過P2X7-NLRP3炎性小體激活以及在腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮P2X7定向的細(xì)胞毒性來刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)。熱療能增加細(xì)胞膜的膜脂流動性，增加P2X7活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，增加腫瘤免疫原性，有利于細(xì)胞免疫殺傷腫瘤細(xì)胞[8]。

2.2 刺激腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生熱休克蛋白

腫瘤局部熱療誘導(dǎo)并過表達(dá)多種熱休克蛋白（heat shock protein,HSPs），隨后激活免疫系統(tǒng)來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)。熱療時腫瘤被加熱至39℃～43℃，高溫可通過增強(qiáng)周圍TME的氧合和增加腫瘤的血流量，改變腫瘤細(xì)胞的病理生理環(huán)境。HSPs在樹突狀細(xì)胞的抗原識別中發(fā)揮積極作用，將HSPs結(jié)合的抗原多肽轉(zhuǎn)運到主要組織相容性復(fù)合物-1（major histocompatibility complex,MHC-I）分子，觸發(fā)抗原特異性T細(xì)胞活化[9]。HSP60（伴侶蛋白）參與抗原依賴的T細(xì)胞激活，刺激干擾素-γ分泌和T細(xì)胞激活[10]。HSPs在細(xì)胞內(nèi)攜帶多種多肽物質(zhì)，可形成HSP-抗原復(fù)合物，能被細(xì)胞毒性T細(xì)胞所識別，并引起特異性免疫反應(yīng)[11]。

2.3 促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌

熱療刺激促炎因子的分泌（如白細(xì)胞介素-1、干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α等），可直接殺死腫瘤細(xì)胞或進(jìn)一步活化抗原提呈細(xì)胞，并趨化至腫瘤部位[12]。研究表明，發(fā)熱可以控制淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)運，在小鼠或癌癥患者的核心體溫升高到約39.5℃后，體溫范圍內(nèi)的全身熱療法會導(dǎo)致循環(huán)T細(xì)胞短暫下降，白細(xì)胞介素-6作為一種熱敏轉(zhuǎn)運效應(yīng)因子，控制淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。熱療通過白細(xì)胞介素-6傳遞信號直接作用于淋巴細(xì)胞，刺激MEK1-ERK1/ERK2信號通路，促進(jìn)L-選擇素粘附，以及肌動蛋白基礎(chǔ)的細(xì)胞骨架、α-肌動蛋白和L-選擇素胞漿尾部之間的分子間相互作用，從而增強(qiáng)L-選擇素非依賴性淋巴細(xì)胞的黏附和運輸[13]。

2.4 清除體內(nèi)腫瘤免疫抑制因子

癌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞分泌的VEGF-D和VEGF-C促進(jìn)TME淋巴管的發(fā)育，促進(jìn)腫瘤在遠(yuǎn)端器官的轉(zhuǎn)移性增殖[14]，熱療可抑制VEGF-C/D的分泌釋放，并誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為M1型巨噬細(xì)胞，促進(jìn)炎性反應(yīng)因子的形成[15]，給NK細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞提供合適的微環(huán)境。

3 熱療對TME中關(guān)鍵免疫細(xì)胞的影響

研究表明，適宜溫度的熱療能增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫功能，促進(jìn)白細(xì)胞介素-2和腫瘤壞死因子產(chǎn)生，增加局部淋巴細(xì)胞的浸潤[16]，激活NK細(xì)胞及T細(xì)胞。

3.1 熱療與NK細(xì)胞

據(jù)報道，免疫細(xì)胞暴露在高溫下對各種免疫細(xì)胞功能既有刺激作用，也有抑制作用[17]。在40℃以上的溫度下（高于通常在發(fā)熱或運動時達(dá)到的生理體溫），NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性同時具有活性增強(qiáng)和抑制的作用[18]。在發(fā)熱范圍內(nèi)的熱應(yīng)激（39.5℃）增強(qiáng)了人NK細(xì)胞對腫瘤靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性，這種作用要求NK細(xì)胞的NKG2D受體發(fā)揮功能，當(dāng)NK和腫瘤細(xì)胞靶點都激活時，NK細(xì)胞的殺傷能力最強(qiáng)[19]。熱誘導(dǎo)的NK細(xì)胞變化導(dǎo)致細(xì)胞毒性改變的性質(zhì)尚不清楚。但根據(jù)Milani等的研究，它至少是獨立于MHC-I類/肽復(fù)合物的[20]。在經(jīng)IL-2增強(qiáng)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性過程中，NK細(xì)胞與靶細(xì)胞之間形成偶聯(lián)物時，激活受體NKG2D聚集在靶細(xì)胞接觸部位[21]。為此，Ostberg等研究了溫和的熱應(yīng)力對NK細(xì)胞表面NKG2D定位的影響：NKG2D在NK細(xì)胞表面的表達(dá)沒有變化，但NKG2D在NK細(xì)胞表面的聚集有明顯的短暫增加，NKG2D受體與抗NKG2D抗體交聯(lián)或IL-2激活NK細(xì)胞導(dǎo)致類似的聚集[22]。然而NK細(xì)胞的激活狀態(tài)可能會影響其對熱應(yīng)激的敏感度，因為在39.5℃下，IL-2激活的NK細(xì)胞沒有表現(xiàn)出熱增強(qiáng)的細(xì)胞毒性[23]。激活受體NKG2D的聚集可能與NK細(xì)胞的激活狀態(tài)有關(guān)，IL-2激活NK細(xì)胞后，NKG2D聚集增強(qiáng)，熱療溫度卻不能進(jìn)一步升高。因此，高溫不會影響IL-2活化的NK細(xì)胞[24]。另外，在40℃以上的溫度下觀察到，與未處理的NK細(xì)胞相比，多聚胞苷酸激活的NK細(xì)胞具有更高的耐熱性[25]。因此，根據(jù)NK細(xì)胞的狀態(tài)和不同的激活途徑，它們可能對熱應(yīng)激有不同的敏感度。

3.2 熱療與T細(xì)胞亞群

熱療可誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡，導(dǎo)致新抗原的釋放。因此，熱療可以提高CD8+T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷能力。此外，熱療可以通過促進(jìn)趨化因子的釋放，將效應(yīng)T細(xì)胞吸引到TME，通過突破血管屏障，也促進(jìn)了T細(xì)胞的浸潤[26]。另外，全身熱水浴減少了外周血B和T細(xì)胞的總數(shù)，而CD8+T細(xì)胞顯著增加。這表明熱療可以提高身體細(xì)胞免疫功能[27]。有體內(nèi)研究顯示，動物暴露于中等溫度熱療極大地增加了L-選擇素和α4β7整合素依賴性淋巴細(xì)胞向次級淋巴組織的轉(zhuǎn)運[28]，導(dǎo)致全身熱療后數(shù)小時淋巴結(jié)內(nèi)T細(xì)胞數(shù)量增加，這表明合適溫度的熱療可刺激T細(xì)胞增殖和募集。另外，T細(xì)胞對熱療的反應(yīng)也取決于不同的微環(huán)境，其調(diào)節(jié)機(jī)制極為復(fù)雜，體內(nèi)發(fā)熱溫度可能會通過Th2誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，但這一結(jié)果可能會被微環(huán)境中IL-12的存在和濃度進(jìn)一步調(diào)節(jié)[29]。同時，在接受全身熱療的患者中，表達(dá)α4β7整合素的T細(xì)胞減少比外周表達(dá)CD5的T細(xì)胞數(shù)量減少的程度要小得多，而且只持續(xù)了很短的一段時間[30]，這也表明熱療可抑制T細(xì)胞與整合素細(xì)胞黏附分子-1相結(jié)合，有利于T淋巴細(xì)胞在TME的募集，而對成熟的T細(xì)胞的功能性影響不大。

4 熱療與免疫治療聯(lián)合的探索

通常情況下，熱消融手術(shù)等局部熱療是針對單發(fā)或少發(fā)轉(zhuǎn)移性疾病的患者進(jìn)行的。但目前免疫檢查點的發(fā)現(xiàn)以及免疫檢查點抑制劑的開發(fā)為局部進(jìn)展的腫瘤患者提供了新的視角，越來越多研究表明局部腫瘤治療可以產(chǎn)生全身性的免疫治療療效。根據(jù)TME的免疫狀態(tài)，腫瘤可分為“冷”型和“熱”型，即免疫沙漠表型和免疫炎癥型腫瘤。免疫炎癥型腫瘤，也稱為“熱腫瘤”，其特點是高T細(xì)胞浸潤、增加的干擾素-γ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、程序性死亡受體配體 1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）表達(dá)和高腫瘤突變負(fù)荷[31]。在免疫沙漠型腫瘤中，腫瘤及其周圍CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤少，“冷腫瘤”還具有低突變負(fù)荷、低MHC-I類表達(dá)和低PD-L1表達(dá)的特征，而富集免疫抑制細(xì)胞群（包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、T調(diào)節(jié)細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞）。其中“冷”型腫瘤對程序性死亡受體-1（programmed death-1,PD-1）/PD-L1抑制劑的應(yīng)答率往往較低，原因是T細(xì)胞浸潤少，PD-L1表達(dá)少，在驅(qū)使T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤的過程中，有許多因素可以影響T細(xì)胞啟動和T細(xì)胞歸巢至腫瘤附近，導(dǎo)致抗腫瘤免疫失敗[32]。冷腫瘤由于免疫原性低而對免疫檢查點抑制劑不敏感。熱療通過提供熱休克蛋白的危險信號以及隨后的免疫系統(tǒng)激活來調(diào)節(jié)TME的免疫狀態(tài)。這種免疫調(diào)節(jié)作用不僅使熱療成為一種能夠干預(yù)癌癥的治療方法，而且使熱療成為一種可靠的治療方法，它可以創(chuàng)造一個Ⅰ型腫瘤微環(huán)境[33]，即PD-L1的過度表達(dá)和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的富集的腫瘤微環(huán)境，作為對免疫檢查點抑制劑增強(qiáng)的補充。另外血清細(xì)胞因子分析顯示，在41℃高熱30分鐘可誘導(dǎo)瘤內(nèi)炎性細(xì)胞因子和趨化因子增加，增強(qiáng)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)運，有利于淋巴細(xì)胞浸潤到腫瘤微環(huán)境并攻擊免疫級聯(lián)反應(yīng)中的實體瘤[34]。熱療可能在局部進(jìn)展或廣泛轉(zhuǎn)移的腫瘤患者中提高免疫治療療效以及改善預(yù)后。

有研究發(fā)現(xiàn)不同熱療方式聯(lián)合其他療法可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫效果。目前已有使用酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼聯(lián)合射頻消融治療肝細(xì)胞癌的研究。射頻消融導(dǎo)致腫瘤特異性抗原原位釋放且引起T淋巴細(xì)胞中PD-1表達(dá)上調(diào)，這與CD8+T淋巴細(xì)胞的耗竭有關(guān)。舒尼替尼通過抑制肝細(xì)胞生長因子抑制腫瘤T淋巴細(xì)胞中PD-1表達(dá)的上調(diào)。舒尼替尼對VEGF的抑制也促進(jìn)了樹突狀細(xì)胞活化并抑制了腫瘤血管生成。聯(lián)合治療最終導(dǎo)致CD8+T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞顯著增加以及T調(diào)節(jié)細(xì)胞減少，從而克服了單一療法的缺點，舒尼替尼聯(lián)合射頻消融通過觸發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)來治療肝細(xì)胞癌[35]。Duffy等的一項研究也顯示[36]，在射頻消融和CTLA-4阻斷劑聯(lián)合應(yīng)用治療晚期肝細(xì)胞癌的患者中發(fā)現(xiàn)，將伊匹木單抗與熱療相結(jié)合的治療方案是可行的，且在消融或栓塞區(qū)域之外產(chǎn)生了客觀的腫瘤反應(yīng)，表現(xiàn)為腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的積累和T細(xì)胞的克隆性降低。在另一項射頻消融聯(lián)合PD-1抑制劑治療復(fù)發(fā)性肝癌時也顯示出了良好的安全性[37]，結(jié)果顯示PD-1抑制劑與射頻消融聯(lián)合治療可改善復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的1年P(guān)FS和OS。

另外，納米粒子介導(dǎo)的光熱療法（photothermal therapy,PTT）已開發(fā)為一種新的癌癥治療策略，它利用腫瘤中積累的光吸收劑吸收的光能產(chǎn)生的熱量來消融腫瘤。Chen等的研究發(fā)現(xiàn)，在免疫佐劑納米粒子存在下，PTT治療后腫瘤消融在原位產(chǎn)生的腫瘤相關(guān)抗原可以顯示出類似疫苗的功能，結(jié)合檢查點阻斷顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤作用[38]。還有研究者更是開發(fā)了一種光熱輔助免疫治療（symbiotic mild photothermal-assisted immunotherapy,SMPAI）策略，將近紅外（NIR）光熱劑IR820和程序性死亡配體1抗體（anti-PD-L1）加載到具有凝膠—溶膠（熱可逆）相變特性的脂質(zhì)凝膠庫中：通過控制凝膠強(qiáng)度實現(xiàn)讓納米材料在不同腫瘤中停留時間一致；可以通過調(diào)整載藥量來控制暴露劑量，以保持最低有效劑量的焦點濃度；可通過控制凝膠-溶膠相變來調(diào)節(jié)藥物釋放量和釋放時間，實現(xiàn)持續(xù)的抗腫瘤作用。并在小鼠模型中驗證了SMPAI策略可放大T細(xì)胞免疫反應(yīng)并使TIL水平相對較低的“冷”腫瘤的對免疫治療敏感，同時誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞分化為CD8+T細(xì)胞，有助于抑制遠(yuǎn)處腫瘤的生長并防止腫瘤轉(zhuǎn)移[39]。

磁熱療（MHT）因具有良好的療效、無創(chuàng)性、對正常組織的損傷最小、成本低、組織滲透性好，受到越來越多的關(guān)注。在過去的20年中，已經(jīng)成功地對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和前列腺癌患者進(jìn)行了向瘤內(nèi)富集磁性納米顆粒的第一階段和第二階段臨床研究[40-41]。對前列腺癌患者的Ⅰ期臨床研究證明了磁熱療的可行性，但在腫瘤中實現(xiàn)和維持熱療的場強(qiáng)和頻率并非易事，磁熱療后雖然PSA下降，但單一療法的療效范圍和持續(xù)時間有限。由于熱療的療效在很大程度上受到所達(dá)到的溫度和保持時間的影響，未來的研究必須通過密切檢測腫瘤溫度來確保熱療有效。

目前的研究中，精確控制溫和的PTT溫度不僅對調(diào)節(jié)藥物釋放很重要，而且對免疫缺陷腫瘤的致敏性以及增強(qiáng)抗PD-L1治療的作用也至關(guān)重要。因此，在未來的研究中，必須在體內(nèi)建立更完整的溫度-效應(yīng)關(guān)系以優(yōu)化治療效果。

5 總結(jié)和展望

本文簡述了熱療引起腫瘤患者免疫系統(tǒng)改變的主要途徑，并對抗腫瘤免疫的主要組成部分NK細(xì)胞和T細(xì)胞群的研究進(jìn)展及免疫治療跟熱療聯(lián)合的基礎(chǔ)理論和部分臨床應(yīng)用做了簡要的總結(jié)。

目前，熱療已廣泛應(yīng)用于臨床實踐，在多種惡性腫瘤的臨床試驗中取得了良好的療效。許多研究者傾向于探索熱療與其他療法的聯(lián)合治療。未來熱療與其他療法相結(jié)合時，應(yīng)當(dāng)關(guān)注最佳溫度、持續(xù)時間、順序和時間間隔等更精確的知識；利用通過增加更多抗癌治療提供的交叉協(xié)同作用，以獲得新的多模態(tài)治療組合；開發(fā)能夠更精確溫度控制的新加熱策略，使熱療得到最佳利用。熱療聯(lián)合免疫治療是一種值得關(guān)注的新治療模式，未來需要更多的探索。