王 穎，吳紅芬，張 穎，汪劉浩，那 威，吳科榜

（海南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，海口 570228）

文昌雞是海南優(yōu)質(zhì)肉雞品種，具有覓食能力強(qiáng)、耐粗飼、耐熱、早熟等特點(diǎn)[1]，作為海南四大名菜之一，其皮薄滑爽，肉質(zhì)肥美，暢銷于全國(guó)各地及東南亞地區(qū)，深受廣大生產(chǎn)者和消費(fèi)者喜愛。但文昌雞存在腹脂沉積過(guò)多的問(wèn)題，腹脂沉積過(guò)多會(huì)降低雞的屠宰率和飼料轉(zhuǎn)化率[2]，還影響產(chǎn)蛋率及誘發(fā)疾病[3]，并影響人類健康，同時(shí)廢棄的腹脂也給環(huán)境造成污染，因此，如何降低腹脂過(guò)度沉積是文昌雞育種需要解決的問(wèn)題。

脂聯(lián)素是一種脂肪細(xì)胞因子，由成熟脂肪細(xì)胞大量分泌，其通過(guò)與受體結(jié)合，激活下游通路[4]在糖脂代謝、葡萄糖的攝取、脂肪酸氧化等過(guò)程中發(fā)揮作用[5]。脂聯(lián)素能夠調(diào)控生物體的脂肪代謝，是至今發(fā)現(xiàn)的唯一與肥胖呈負(fù)相關(guān)的脂肪細(xì)胞特異性蛋白[6]。脂聯(lián)素受體包括脂聯(lián)素受體R1和脂聯(lián)素受體R2、T-鈣粘蛋白（CDH13）[7]。由于CDH13可以和六聚體及高分子量的脂聯(lián)素結(jié)合而被認(rèn)為是脂聯(lián)素的第三類受體[8]。CDH13與血漿脂聯(lián)素水平、心血管風(fēng)險(xiǎn)、糖尿病和脂肪肝[9]等肥胖因素有關(guān)，但關(guān)于其在雞脂質(zhì)代謝中的功能研究還未見報(bào)道。因此，本研究利用 RT-qPCR的方法檢測(cè)CDH13基因和脂聯(lián)素基因在文昌雞不同組織中及不同時(shí)期文昌雞腹部脂肪組織中的表達(dá)情況，旨在為后續(xù)深入研究CDH13的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物文昌雞雌雞，由海南省文昌市潭牛文昌雞股份有限公司提供，參照《DB 46/T44—2011，文昌雞飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)程》[10]，實(shí)施規(guī)范的飼養(yǎng)管理，執(zhí)行正常的免疫程序。從105日齡開始籠養(yǎng)育肥。

1.1.2 組織樣的采取選取27日齡、52日齡、79日齡、105日齡和籠養(yǎng)育肥2周齡、4周齡、6周齡、8周齡8個(gè)飼養(yǎng)階段的各6只文昌雌雞，采集腹部脂肪組織裝入5 mL凍存管中，迅速放入液氮中速凍后置于?80 ℃冰箱中待用；采集育肥8周齡的3只（隨機(jī)選取3只）文昌雌雞的16種組織，每只個(gè)體每種組織分別采樣裝入5 mL凍存管中，迅速放入液氮中速凍后置于?80 ℃中保存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德股份公司，Centrifuge 5 418 R），常規(guī)離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司，D1008E），微量移液器（德國(guó)艾本德股份公司，Research? plus 系列），微量分光光度計(jì)（杭州奧盛儀器有限公司，Nano-100），熒光定量 PCR 儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，Q1000），電泳儀、電泳槽（美國(guó)伯樂(lè)有限公司，PowerPac 系列），超低溫冰箱（松下電器有限公司，MDF-682）。

TransZol Up（北京全式金生物技術(shù)有限公司）、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（南京諾唯贊生物科技有限公司）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixR（南京諾唯贊生物科技有限公司）、氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇、DEPC水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成利用Trizol法提取各種組織的總RNA，測(cè)定其濃度，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。質(zhì)檢合格的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于 ?20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)雞NCBI上脂 聯(lián) 素 基 因mRNA 序 列（NM_206 991），CDH13mRNA序列（NM_001001760.2）設(shè)計(jì)表達(dá)引物ADIPOQ-F/R、CDH13-F/R。內(nèi)參基因?yàn)門BP、HMBS[11]。引物堿基序列見表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)使用SYBR Green熒光染料法，反應(yīng)體系（10 μL）：2 ×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL、上下游引物各0.2 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)；熔解反應(yīng)95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析利用SAS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05差異顯著；用Graphpad Prism 8.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1CDH13及脂聯(lián)素基因定性表達(dá)規(guī)律分析以籠養(yǎng)育肥8周齡文昌雌雞（隨機(jī)選取3只）的16種組織為實(shí)驗(yàn)材料，每只個(gè)體每種組織分別提取總RNA后，每種組織按照等量RNA進(jìn)行混合，得到該種組織的混合總RNA樣品后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CDH13基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，在心臟（H）、回腸（I）、肌胃周圍脂肪（GF）、嗉囊周圍脂肪（CF）、皮下脂肪（SF）、小腦（Cr）、腹部脂肪組織（AF）及肌胃（G）中表達(dá)量較高（圖1）。

圖1 CDH13基因在文昌雞16種組織中的表達(dá)情況

脂聯(lián)素基因在空腸（J）、心臟（H）、回腸（I）、肌胃周圍脂肪（GF）、嗉囊周圍脂肪（CF）、皮下脂肪（SF）、腹部脂肪組織（AF）、及肌胃（G）中表達(dá)量較高（圖2），與CDH13定性表達(dá)結(jié)果相似。

圖2 脂聯(lián)素基因在文昌雞16種組織中的表達(dá)情況

2.2CDH13及脂聯(lián)素在文昌雞腹部脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律檢測(cè)27日齡、52日齡、79日齡、105日齡和籠養(yǎng)育肥2周齡、4周齡、6周齡、8周齡每個(gè)時(shí)期隨機(jī)選取6只文昌雌雞，采取腹部脂肪組織提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，CDH13在文昌雞腹部脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)時(shí)期中均穩(wěn)定高表達(dá)，并育肥4周齡時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最高。

圖3 CDH13和脂聯(lián)素基因在各個(gè)時(shí)期文昌雞腹部脂肪組織中的表達(dá)情況

3 討 論

脂肪組織作為一種內(nèi)分泌器官，能夠分泌多種細(xì)胞因子。脂聯(lián)素是機(jī)體的脂質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)節(jié)因子。CDH13是脂聯(lián)素的受體之一。CDH13和脂聯(lián)素基因定性表達(dá)結(jié)果顯示，CDH13基因在文昌雞各個(gè)組織中廣泛表達(dá)；其在心臟、回腸、小腦、脂肪組織及肌胃中表達(dá)量較高。脂聯(lián)素在空腸、心臟、回腸、脂肪組織及肌胃中表達(dá)量較高，這與前人的研究結(jié)果一致。YUAN等[12]的研究結(jié)果顯示脂聯(lián)素在脂肪組織、胃、皮膚和心臟中高度表達(dá)。鵝脂聯(lián)素在脂肪、心臟和肌胃中高度表達(dá)，在小腸、腺胃、腎等組織中度表達(dá)，而在肝臟、脾臟和卵巢等組織低表達(dá)[13]。MADDINENI等[14]研究發(fā)現(xiàn)雞脂聯(lián)素在脂肪組織、肝臟、垂體前葉、間腦、骨骼肌、腎臟、卵巢和脾臟均表達(dá)，并在脂肪組織中表達(dá)最高，其次是肝臟、間腦、腎和骨骼肌。

本研究中CDH13和脂聯(lián)素基因定量表達(dá)結(jié)果顯示，脂聯(lián)素在育肥后文昌雞腹部脂肪組織中的表達(dá)量均低于育肥前。在人、猴子、小鼠中，脂肪組織脂聯(lián)素基因表達(dá)量隨脂肪過(guò)度沉積而下降，隨體重下降而上升[15]。育肥期是文昌雞脂肪快速沉積的時(shí)期，育肥期的脂肪含量顯著高于育肥前，這可能也是育肥后腹部脂肪組織中脂聯(lián)素的表達(dá)量低于育肥前的原因。CDH13是脂聯(lián)素的受體，CDH13定量表達(dá)結(jié)果和脂聯(lián)素相似，均在脂肪組織中高表達(dá)，暗示在脂肪組織中，CDH13基因可能發(fā)揮一定的作用，但作用機(jī)制尚不明確，有待深入研究。目前關(guān)于CDH13的研究較少，因此本研究檢測(cè)CDH13在文昌雞多種組織和腹部脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況，可為今后CDH13基因的深入研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

脂聯(lián)素受體CDH13在文昌雞各個(gè)組織中均有表達(dá)，在心臟、回腸、脂肪組織、小腦及肌胃組織中高度表達(dá)。在文昌雞腹部脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，CDH13持續(xù)高表達(dá)。