宋文杰,李慧帆,姜俊羽,劉欣欣,付冬梅

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連,116034)

啤酒花(HumuluslupulusL.)是?？迫劜輰俣嗄晟p繞植物,雌雄異株,又名蛇麻花、忽布、唐草花[1-2]。啤酒花的雌性球穗花序通常被稱為啤酒花,具有釀造價值,被譽為“啤酒的靈魂”[3-5]。啤酒花中的樹脂類、揮發(fā)油、黃酮類等重要成分主要來源于雌花的蛇麻腺[6],其中黃腐酚作為啤酒花特有的天然異戊烯基黃酮類化合物而備受關(guān)注[7-8]。此外,由于啤酒花具有抑菌、抗炎、抗氧化、雌激素樣作用等功效[9-10],在制藥、制糖、食品防腐等領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用[2,11-12]。本文所指的啤酒花,是沿用人們的慣稱,為啤酒花植物的雌性球穗花序。

指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的鑒定方法[13],近年來已應(yīng)用于啤酒花的質(zhì)量評價,如董志敏等[1]、劉曉燕等[14]在358 nm下建立了單一波長的啤酒花反相高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)指紋圖譜分析方法,對啤酒花中的中等極性、弱極性成分進行了分離,但對啤酒花強極性成分的研究還有待完善。此外,有機酸類物質(zhì)是啤酒中重要的風(fēng)味和口味物質(zhì),啤酒花作為啤酒的“靈魂”,其中強極性物質(zhì)如有機酸的研究鮮有報道,目前僅有SNCHEZ-MATA等[15]對未開花的啤酒花枝葉進行了有機酸研究。強極性物質(zhì)在常規(guī)的C18反相色譜柱上很難實現(xiàn)分離,因為在100%水作為流動相的條件下易發(fā)生色譜填料的塌陷[16-17]。前期的研究發(fā)現(xiàn)XAqua C18反相色譜柱的填料由于鍵合了3-氯丙基極性官能團,可以用純水做為流動相,成功用于異麥芽酮糖酶解液的預(yù)處理[18]。受此啟發(fā),本文采用XAqua C18色譜柱,對啤酒花強極性、中等極性及弱極性成分同時進行分離,完善對啤酒花強極性成分的研究。利用紫外檢測器,雙波長切換法,于215、360 nm下建立了啤酒花指紋圖譜的HPLC分析方法,0～12 min,215 nm下分離有機酸等強極性物質(zhì);12～66 min,360 nm下分離酚酸、黃酮等中等極性和弱極性物質(zhì),對14批啤酒花進行指紋圖譜分析。由于對啤酒花中的強極性物質(zhì)進行了有效分離,首次發(fā)現(xiàn)啤酒花中含有蘋果酸。測定了啤酒花中蘋果酸、黃腐酚的含量,結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對啤酒花進行鑒別分析。本文建立的啤酒花HPLC指紋圖譜分析方法可以更全面、綜合地反映啤酒花的品質(zhì),為啤酒花的質(zhì)量鑒定提供一種科學(xué)的評價方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品、色譜級乙醇,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;黃腐酚標(biāo)準(zhǔn)品,上海源葉生物科技有限公司;色譜級乙腈、色譜級甲醇,安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?色譜級磷酸,北京伊諾凱科技有限公司。水為超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜系統(tǒng)(包括泵、二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱恒溫系統(tǒng)、Chemostation色譜工作站)、Agilent 1290 Infinity LC/6545 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(包括電噴霧離子源、二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱恒溫系統(tǒng)、Agilent Mass Hunter軟件),美國安捷倫科技公司;XAqua C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),華譜科儀(大連)科技有限公司;KQ520DE數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;AB204-N電子分析天平,梅特勒-托利多(上海)有限公司;H1750R臺式高速冷凍離心機,湖南湘儀集團;Milli-Q超純水凈化系統(tǒng),美國Millipore公司。

1.1.3 供試品

供試樣品為啤酒花雌性球穗花序制品,共14批,S1～S9為真空密封、避光保存的新鮮酒花(新鮮組),由新疆三寶樂農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供,S10～S14為露天存放的酒花(氧化組),購自河北安國中藥材市場。14批啤酒花的品種、產(chǎn)地、生產(chǎn)時間詳見表1。

表1 十四批啤酒花樣品信息Table 1 Sample information of 14 batches of Humulus lupulus L.

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

1.2.1.1 啤酒花提取液的制備

將啤酒花粉碎后過40～60目篩備用。稱取0.500 g過篩后的樣品于50 mL具塞錐形瓶中,精密加入50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇25 mL,密塞,稱重,超聲(200 W,40 kHz)提取30 min,冷卻至室溫,再稱重,用50%乙醇補足損失的重量,搖勻,上清液過0.22 μm有機濾膜,備用。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精確稱取150 mg的蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品,加入75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇制成3.000 mg/mL的母液。精確稱取6 mg黃腐酚標(biāo)準(zhǔn)品,加入75%(體積分?jǐn)?shù))甲醇制成0.120 mg/mL的母液備用。稀釋母液,得到一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2 色譜條件

1.2.2.1 液相色譜條件

流動相:A相為水(含0.03%磷酸,體積分?jǐn)?shù)),B相為乙腈(含0.03%磷酸,體積分?jǐn)?shù)),梯度洗脫:0～12 min,0% B;12～13 min,0%～20% B;13～23 min,20 %～30% B;23～41 min,30%～63% B;41～45 min,63% B;45～60 min,63%～80% B;60～61 min,80%～90% B;61～66 min,90% B。流速1 mL/min;進樣量10 μL;柱溫30 ℃;檢測波長:0～12 min,215 nm;12～66 min,360 nm。

1.2.2.2 液質(zhì)聯(lián)用條件

流動相:A相為水(含0.1%甲酸,體積分?jǐn)?shù)),B相為乙腈(含0.1%甲酸,體積分?jǐn)?shù)),XAqua C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,5 μm),華譜科儀(大連)科技有限公司,柱溫30 ℃,流速0.2 mL/min,進樣量2 μL,梯度洗脫:0～10 min,0% B;10～30 min,100% B。Dual AJS ESI離子源,負(fù)離子模式,氣簾氣20 psi,溫度325 ℃,干燥氣流速5 L/min,毛細(xì)管電壓 3 500 V,噴嘴電壓2 000 V,全掃描范圍m/z50～1 700。

1.2.3 啤酒花指紋圖譜的相似度分析

將啤酒花提取液按照1.2.2.1的液相色譜分離條件進行液相色譜分析,得到不同批次啤酒花的指紋圖譜。將圖譜導(dǎo)入2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”,將S3設(shè)定為參照圖譜,采用中位數(shù)法,時間窗寬度設(shè)定0.1 min進行自動匹配,得到啤酒花的對照圖譜,并進行相似度分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用Agilent Chemostation色譜工作站提取色譜數(shù)據(jù),利用SIMCA 14.1進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least square discriminant analysis,OPLS-DA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的建立及相似度評價

利用2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”對各批次啤酒花指紋圖譜進行分析,14批啤酒花的指紋圖譜如圖1所示。從14批啤酒花指紋圖譜中共確定了31個共有峰。進一步計算14批啤酒花的相似度,如表2所示,14批啤酒花的相似度>0.890,除S5外,其他13批不同產(chǎn)地、不同年份以及不同保存形式的啤酒花相似度均>0.978,說明各批次啤酒花之間化學(xué)成分差異較小,而S5與其他批次之間的相似度偏低,說明馬克波羅(S5)與其他品種的啤酒花間存在一定的差異。

圖1 十四批啤酒花HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 14 batches of Humulus lupulus L.

表2 十四批啤酒花相似度Table 2 Similarity evaluation result of 14 batches of Humulus lupulus L.

通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”對14批啤酒花指紋圖譜進行分析,得到啤酒花的對照指紋圖譜如圖2所示,本研究所建立的啤酒花指紋圖譜可以將啤酒花的組成明顯分為幾個組分:0～10 min的1～7號共有峰為以純水(含0.03% H3PO4,體積分?jǐn)?shù))做流動相進行分離的強極性組分,15～45 min的8～26號共有峰為中等極性組分,45～66 min的27～31號共有峰為極性較弱的組分。與之前報道的啤酒花指紋圖譜相比[1，14],本研究所建立的啤酒花指紋圖譜分析方法可以將啤酒花中的成分進行更好地分離,獲得更多的色譜峰,降低了因色譜峰重疊而產(chǎn)生的對啤酒花質(zhì)量評價的影響。

采用高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜對啤酒花的化學(xué)組成進行定性分析,通過與對照品比對、一級精確相對分子質(zhì)量比對,鑒定得到2號峰為蘋果酸([M-H]-:133.013 0),26號峰為黃腐酚([M-H]-:353.088 7),保留時間分別為4.11、44.37 min。由于采用了極性反相C18色譜柱,對啤酒花中的強極性成分進行了較好的分離,首次從啤酒花中鑒定到蘋果酸。

2.2 定量分析

2.2.1 線性關(guān)系

取一系列濃度梯度的蘋果酸與黃腐酚的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,進行色譜分析,得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液對應(yīng)的峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(x),對應(yīng)濃度的峰面積為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明在0.015 0～3.000 mg/mL的蘋果酸的濃度與峰面積呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y=577.03x+9.713,R2為0.999 6;在0.000 120～0.120 mg/mL的黃腐酚的質(zhì)量濃度與峰面積呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y=52 863x+4.655 1,R2為1。

2.2.2 十四批啤酒花蘋果酸、黃腐酚含量測定

對14批啤酒花中的蘋果酸、黃腐酚含量進行測定,結(jié)果如表3所示。14批啤酒花的蘋果酸含量為2.42 1～12.248 g/kg,黃腐酚的含量為0.092 0～4.73 4 g/kg。由表3中密封保存酒花的蘋果酸含量可以看出,香花(S4、S9)的蘋果酸含量最高,苦香兼?zhèn)湫途苹?S1～S3、S6～S8)次之,苦型花(S5)的蘋果酸含量最低。

a-啤酒花對照指紋圖譜3～6 min局部放大圖;b-啤酒花對照指紋圖譜19～25 min局部放大圖;c-啤酒花對照指紋圖譜34～43 min局部放大圖圖2 啤酒花對照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint of Humulus lupulus L.

表3 十四批酒花的蘋果酸、黃腐酚含量 單位:g/kg

啤酒花的新鮮程度對黃腐酚的含量影響較大,密封保存組(新鮮組)啤酒花的黃腐酚含量普遍大于露天保存組(氧化組)。PRENCIPE等[19]對啤酒花中的黃腐酚進行了含量測定,其含量為0.8～5 g/kg,與本文中新鮮組酒花的黃腐酚含量一致。進一步從表3中的數(shù)據(jù)可知,除新鮮程度外,黃腐酚的含量還受到啤酒花的香型以及壓制類型的影響。同種壓制類型,香花品種(S4、S9)的黃腐酚含量要低于苦香兼?zhèn)湫途苹?S1～S3、S6～S8)或苦型酒花(S5),苦型酒花(S5)的黃腐酚含量最高。除壓縮馬克波羅(S5)、壓縮薩斯特3號(S8)外,酒花顆粒(S1～S4)的黃腐酚含量均高于壓縮啤酒花(S6、S7、S9～S14),由此可見,啤酒花以酒花顆粒形式可以更好地進行保存。

2.3 化學(xué)模式識別研究

2.3.1 PCA

以14批啤酒花的共有峰峰面積為變量,使用SIMCA14.1軟件進行無監(jiān)督的主成分分析,得到PCA得分圖,如圖3所示。其中模型參數(shù)R2X代表了模型擬合的程度,數(shù)值即為對模型的解釋率,Q2表示模型預(yù)測數(shù)據(jù)的效果,Q2>0.5表示模型具有良好的預(yù)測性[20-21]。本研究所構(gòu)建的模型R2X=0.985,Q2=0.562,說明該模型可以解釋98.5%的樣本信息,且具有良好的預(yù)測性。

通過PCA得分圖可以看出,14批啤酒花可按新鮮程度明顯區(qū)分,聚為兩類。其中新鮮組的S1～S9聚為一類,S5因其品種為苦型花,故在散點圖中距離其他新鮮酒花較遠(yuǎn),氧化組的S10～S14聚為一類。說明酒花的新鮮程度差異可以通過指紋圖譜的差異進行表征。

圖3 十四批啤酒花PCA得分圖Fig.3 PCA scatter plot for 14 batches of Humulus lupulus L.

2.3.2 OPLS-DA

將14批啤酒花共有峰峰面積數(shù)據(jù)及分組信息導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中繼續(xù)進行有監(jiān)督的OPLS-DA,得到OPLS-DA得分圖,如圖4所示。模型參數(shù)R2X=0.610、R2Y=0.962、Q2=0.882,說明模型穩(wěn)定可靠[22]。由圖4可知,14批啤酒花明顯分為兩類,與PCA結(jié)果相一致。

由建立的OPLS-DA模型得到14批啤酒花的31個共有峰的變量投影值(variable importance for the projection,VIP),以VIP>1為條件[23]篩選出可區(qū)分啤酒花新鮮程度的差異性化合物,如圖5所示。按差異性化合物貢獻程度進行排序:4號峰(VIP=1.236)>1號峰(VIP=1.171)>15號峰(VIP=1.142)>14號峰(VIP=1.137)>21號峰(VIP=1.134)>13號峰(VIP=1.104)>20號峰(VIP=1.088)>26號峰(VIP=1.085)>27號峰(VIP=1.070)>18號峰(VIP=1.060)>28號峰(VIP=1.053)>29號峰(VIP=1.035)>2號峰(VIP=1.006)。這13個色譜峰可作為評價啤酒花新鮮程度的標(biāo)志性指紋譜峰。

圖4 十四批啤酒花OPLS-DA得分圖Fig.4 OPLS-DA scores plot for 14 batches of Humulus lupulus L.

圖5 啤酒花樣品的VIP值預(yù)測圖(VIP >1)Fig.5 VIP predicted values plot of Humulus lupulus L.(VIP>1)

3 結(jié)論

本實驗采用鍵合有極性官能團的反相C18色譜柱建立了啤酒花的切換波長HPLC指紋圖譜分析方法,實現(xiàn)了同時對啤酒花強極性、中等極性及弱極性物質(zhì)的分離。對14批啤酒花進行指紋圖譜分析,共確定31個共有峰,相似度>0.890,表明不同產(chǎn)地、不同品種、不同壓縮方式及保存方式的啤酒花樣品間差異不大。首次基于HPLC技術(shù)確認(rèn)啤酒花中存在蘋果酸,為2號指紋譜峰,同時指認(rèn)出26號指紋譜峰為黃腐酚。測定了14批啤酒花中蘋果酸和黃腐酚的含量,蘋果酸的含量為2.421～12.248 g/kg,黃腐酚的含量為0.092 0～4.734 g/kg,表明不同樣品間存在一定的差異。PCA和OPLS-DA結(jié)果表明,14批啤酒花可按新鮮程度分為新鮮酒花和氧化酒花,并確定了1號、2號、4號、13～15號、18號、20號、21號、26～29 號這13個色譜峰可作為啤酒花質(zhì)量控制的標(biāo)志性指紋譜峰。綜上所述,本研究發(fā)展的HPLC指紋圖譜分析方法為啤酒花的質(zhì)量評價提供了有效的方法依據(jù)。

在后續(xù)的實驗中,可通過多維液相色譜分離分析,聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)對啤酒花中的未知化學(xué)成分進行指認(rèn),以期對啤酒花有更加深入的了解。