劉龍祥,張克穎,趙紅玉,宋煒鈺

1(濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院,山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心,山東 濱州,256600) 2(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院,陜西 楊凌,712100)

蘋果酸乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation, MLF)可以將葡萄汁中尖銳的二元羧酸蘋果酸轉(zhuǎn)化為柔和的一元羧酸乳酸和二氧化碳,是葡萄酒釀造中一個(gè)重要的過程[1]。MLF的順利進(jìn)行使葡萄酒的酸度降低,隨著碳源的消耗微生物穩(wěn)定性得以提高,此外,MLF會改變葡萄酒的香氣結(jié)構(gòu),增加葡萄酒的果香味,豐富葡萄酒的結(jié)構(gòu)感等。因此被認(rèn)為是釀造優(yōu)質(zhì)紅葡萄酒必需的步驟[2]。

酒酒球菌(Oenococcusoeni)作為蘋果酸乳酸發(fā)酵的主要啟動者,其生長繁殖和蘋果酸乳酸發(fā)酵的進(jìn)行都會受到葡萄酒多種生理生化特性的抑制[3]。葡萄酒中影響蘋果酸乳酸發(fā)酵進(jìn)行的4種主要因素分別為乙醇(10%～16%,體積分?jǐn)?shù))、低pH(3.0～3.5)、SO2(超過10 mg/L)和低溫(可能低于12 ℃)[4]。在這些脅迫因素中,低pH是限制微生物在葡萄酒中生長的關(guān)鍵因素。目前許多研究都集中在酒酒球菌脅迫應(yīng)答機(jī)制方面,提出了多種相關(guān)機(jī)制,例如膜成分和流動性、pH內(nèi)外平衡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA和蛋白質(zhì)損傷修復(fù)機(jī)制[5]。但酒酒球菌脅迫適應(yīng)性的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本文主要從酒酒球菌酸脅迫應(yīng)答機(jī)制及提高酒酒球菌抗脅迫能力的方法進(jìn)行綜述。

1 酒酒球菌脅迫應(yīng)答與防御機(jī)制

1.1 阻隔氫離子

在脅迫條件下微生物需要維持細(xì)胞膜的主要功能,以控制離子通透性,調(diào)節(jié)細(xì)胞與外界環(huán)境間的物質(zhì)交換。酒酒球菌是革蘭氏陽性細(xì)菌,沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu),直接由細(xì)胞膜包被,所以細(xì)胞膜是其抵御不良環(huán)境的第一道屏障。酒酒球菌主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動性和組成成分來阻隔外界脅迫環(huán)境中的氫離子。

pH作為影響微生物生長的重要因素之一,也是影響MLF順利進(jìn)行的重要因素。在較高pH處理(pH 3.2)酸脅迫瞬時(shí)處理后,細(xì)胞膜軸向流動性發(fā)生微弱的增大,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞膜流動性會逐漸恢復(fù)[6]。較低pH處理(pH 3.0)后,會引發(fā)細(xì)胞膜軸向擴(kuò)散速率降低,隨著pH的降低這種影響越顯著,當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境pH恢復(fù)正常時(shí),這種狀態(tài)不會恢復(fù),這說明酸脅迫對細(xì)胞膜的影響是不可逆的[7-8]。

細(xì)胞質(zhì)膜脂肪酸組成的修飾是微生物對逆境最重要的適應(yīng)性反應(yīng)之一,其中細(xì)菌的反應(yīng)包括飽和度、碳鏈長度、分支位置、順式/反式異構(gòu)化,以及不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為環(huán)狀脂肪酸等[9]。pH 3.5和pH 3.2處理對細(xì)胞生物量的影響不大,但可以明顯提高細(xì)胞的接種活力和冷凍干燥活力,隨著pH的降低,不飽和脂肪酸(C18∶1)轉(zhuǎn)化為環(huán)狀脂肪酸(C19cyc11),短時(shí)間酸脅迫處理會顯著降低不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比值,但長時(shí)間的酸脅迫培養(yǎng)會增加細(xì)胞膜脂中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值,這說明細(xì)胞在應(yīng)對短時(shí)間與長時(shí)間酸脅迫處理時(shí)會采用不同的應(yīng)對策略,短時(shí)間通過降低細(xì)胞膜流動性阻止胞外氫離子對細(xì)胞的侵害,隨著酸脅迫處理時(shí)間的延長,細(xì)胞通過調(diào)整胞內(nèi)生化反應(yīng)狀態(tài),逐漸適應(yīng)低pH侵害,細(xì)胞膜流動性恢復(fù),加速胞內(nèi)外物質(zhì)交換[10-11]。

近期有研究表明,在脅迫環(huán)境中,酒酒球菌的細(xì)胞壁合成相關(guān)的基因的表達(dá)和蛋白含量也有顯著的變化,說明細(xì)胞壁可能同樣具有阻礙環(huán)境脅迫的屏障作用[12]。

1.2 排出氫離子

通常微生物調(diào)控胞內(nèi)pH的方式有:(1)轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子的ATP酶；(2)胞內(nèi)生成堿；(3)消耗胞內(nèi)質(zhì)子等[13-14]。其中,H+-ATP酶在維持胞內(nèi)pH穩(wěn)定方面起著最為重要的作用,它通過消耗ATP將胞內(nèi)的H+泵出胞外。H+-ATP酶是酒酒球菌脅迫適應(yīng)性機(jī)制研究的一個(gè)重要方面。研究發(fā)現(xiàn),ATP酶的缺失會導(dǎo)致蘋果酸-乳酸操縱子也不發(fā)生轉(zhuǎn)錄,使細(xì)胞無法進(jìn)行MLF[15],且在低pH條件下,H+-ATP酶活性會顯著提高[16],在酸脅迫處理1 h時(shí),H+-ATP酶活性顯著低于對照組,在脅迫處理3 h后,酸脅迫處理組H+-ATP酶活性與對照組無顯著差異,說明在酸脅迫處理較短時(shí)間內(nèi),H+-ATP酶的活性可以恢復(fù)到正常水平[8],這一機(jī)制可以在短時(shí)間內(nèi)通過消耗能量的方式將大量氫離子排出胞外,從而使細(xì)胞內(nèi)pH穩(wěn)定在較高水平,降低氫離子對細(xì)胞內(nèi)酶與DNA等分子及生化反應(yīng)的影響,維持細(xì)胞的正常功能,為細(xì)胞做出脅迫響應(yīng)爭取時(shí)間。

與生理數(shù)據(jù)報(bào)道相比,關(guān)于轉(zhuǎn)運(yùn)基因的報(bào)道要多一些。在O.oeni的酸脅迫轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)了121個(gè)與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)差異表達(dá)基因,說明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮了重要作用[4]。ATP酶基因在酸脅迫處理1 h和3 h時(shí)均發(fā)生上調(diào)表達(dá),但在模擬酒環(huán)境中,該基因呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,在長時(shí)間模擬酒環(huán)境下,隨著蘋果酸的消耗,ATP酶基因表達(dá)逐漸被激活[12]。

1.3 中和氫離子

另一種抵抗酸脅迫的方法是細(xì)胞質(zhì)堿化。在酒酒球菌中消耗氫離子的代謝途徑主要有氨基酸合成和代謝、蘋果酸乳酸發(fā)酵、檸檬酸代謝等途徑。蘋果酸乳酸發(fā)酵是酒酒球菌維持細(xì)胞內(nèi)外pH穩(wěn)定的重要途徑,蘋果酸乳酸發(fā)酵主要由蘋果酸滲透酶和蘋果酸乳酸酶完成,蘋果酸滲透酶負(fù)責(zé)將胞外的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞,二元羧酸蘋果酸在蘋果酸乳酸酶的催化作用下轉(zhuǎn)換成一元酸乳酸,這一過程可以降低胞外氫離子含量。在酸脅迫耐受酒酒球菌突變菌株中,發(fā)現(xiàn)在酸脅迫培養(yǎng)條件下,蘋果酸乳酸酶基因發(fā)生突變且呈現(xiàn)出高表達(dá)趨勢,說明該基因在酒酒球菌脅迫耐受性中的重要作用[17]。與培養(yǎng)條件下不同的是,酸脅迫瞬時(shí)處理時(shí),蘋果酸乳酸酶基因發(fā)生下調(diào),而蘋果酸脫氫酶基因顯著上調(diào),使蘋果酸更多的轉(zhuǎn)化為丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA),產(chǎn)生能量,而不是乳酸[8]。這與模擬酒和葡萄酒環(huán)境下(酸和乙醇脅迫同時(shí)存在)酒酒球菌的表現(xiàn)類似,在模擬酒瞬時(shí)脅迫處理8 h過程中,蘋果酸滲透酶和蘋果酸脫氫酶基因均上調(diào)表達(dá)[12],葡萄酒環(huán)境中,酒酒球菌也上調(diào)了蘋果酸滲透酶和蘋果酸脫氫酶基因表達(dá)量[18]。

檸檬酸裂解酶是檸檬酸代謝的關(guān)鍵酶,在檸檬酸裂解酶的催化作用下,檸檬酸裂解形成草酰乙酸、乙酰輔酶A和磷酸鹽,并產(chǎn)生ADP。檸檬酸代謝會誘導(dǎo)香氣揮發(fā)物的產(chǎn)生,如雙乙酰和乙氨酸。酸脅迫處理幾乎不影響檸檬酸裂解酶基因的表達(dá)量,而在乙醇脅迫、模擬酒和葡萄酒環(huán)境下,檸檬酸裂解酶基因會大幅度上調(diào)表達(dá)[4， 12， 19],說明檸檬酸途徑基因的表達(dá)主要受乙醇的影響,pH的影響較小[20]。

氨基酸作為葡萄酒風(fēng)味成分的重要前體,其合成代謝不僅對葡萄酒香氣改善,而且對細(xì)胞生長繁殖具有重要作用。在酸脅迫(pH 3.0)處理1 h和3 h時(shí),與精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、賴氨酸生物合成關(guān)鍵酶均保持較高表達(dá)水平,精氨酸代謝途徑的3個(gè)關(guān)鍵酶(精氨酸脫亞胺酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲?；负桶被姿峒っ?保持正常表達(dá)水平,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解途徑的關(guān)鍵酶上調(diào)表達(dá),這些過程上調(diào)表達(dá)可以代謝產(chǎn)生ATP,供細(xì)胞利用[8， 14， 17]。

1.4 修復(fù)DNA和蛋白質(zhì)損傷

酸脅迫對細(xì)胞帶來的損傷很大程度上是通過破壞或影響DNA和蛋白質(zhì)活性產(chǎn)生的,細(xì)菌常見應(yīng)對DNA和蛋白質(zhì)損傷的機(jī)制是錯(cuò)配修復(fù)和伴侶蛋白的合成。在酒酒球菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)19個(gè)與基因錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)的基因(表1),這些基因在酸脅迫瞬時(shí)處理?xiàng)l件下,大部分未表現(xiàn)出差異表達(dá),少數(shù)基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)[8],這些基因的正常表達(dá)可以降低在基因復(fù)制過程中出現(xiàn)堿基突變的概率。除了錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制外,分子伴侶蛋白可以促進(jìn)脅迫環(huán)境下微生物蛋白質(zhì)的正確合成,降低發(fā)生錯(cuò)誤的幾率,從而增強(qiáng)微生物脅迫耐受性[21]。在酸脅迫瞬時(shí)處理?xiàng)l件下,O.oeniSD-2a大部分分子伴侶蛋白基因都在1 h時(shí)呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá),且在3 h時(shí)這些基因的表達(dá)量均顯著增加,說明分子伴侶蛋白在應(yīng)對酸脅迫瞬時(shí)處理時(shí)持續(xù)發(fā)揮著關(guān)鍵作用,且hsp20和groES在O.oeniSD-2a酸脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的響應(yīng)時(shí)間要早于其他分子伴侶蛋白(表2)。

表1 與酒酒球菌DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因Table 1 Genes associated with DNA damage repair in O. oeni

表2 酒酒球菌中分子伴侶蛋白基因Table 2 Genes encoded molecular chaperones in O. oeni

1.5 能量產(chǎn)生

在蘋果酸乳酸發(fā)酵過程中,酒酒球菌除了要抵御脅迫造成的損傷,還要從營養(yǎng)匱乏的葡萄酒生境中獲得能量。由于營養(yǎng)物質(zhì)匱乏,酒酒球菌難以直接利用碳源產(chǎn)生能量,其獲得能量來源主要依靠細(xì)胞跨膜pH梯度(ΔpH)和電位差Δψ這兩種質(zhì)子推動力,在質(zhì)子推動力的作用下,細(xì)胞膜H+-ATP酶可以合成ATP[22]。細(xì)胞跨膜pH梯度在蘋果酸乳酸發(fā)酵早期增大,隨著蘋果酸的消耗,逐漸降低直至內(nèi)外電位平衡,細(xì)胞內(nèi)pH逐漸降低至等于培養(yǎng)基pH值。這說明ΔpH越大,O.oeni的蘋果酸乳酸發(fā)酵過程越短[22]。

此外,蘋果酸和檸檬酸代謝也與質(zhì)子的消耗、跨膜電位和跨膜pH梯度的形成有關(guān),因此可以促進(jìn)胞內(nèi)和胞外ATP的合成[20]。在酸脅迫瞬時(shí)處理過程中,ATP酶的4個(gè)亞基(α、β、γ和ε)基因均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá),而糖酵解和TCA循環(huán)的關(guān)鍵基因均未出現(xiàn)差異表達(dá),說明在酸脅迫條件下,酒酒球菌可以快速啟動蘋果酸乳酸發(fā)酵,其主要能量來源于跨膜質(zhì)子推動力[4]。在模擬酒環(huán)境中,ATP酶基因亞基均呈現(xiàn)出下調(diào)表達(dá),直至蘋果酸乳酸發(fā)酵開始才有所回升,說明在酸和乙醇脅迫同時(shí)存在的情況下,蘋果酸乳酸發(fā)酵的啟動時(shí)間會延遲[12]。

2 提高酒酒球菌抗脅迫能力的方法

2.1 預(yù)適應(yīng)和交叉保護(hù)

預(yù)適應(yīng)是將菌株暴露到致命或亞致死劑量的脅迫條件下一定時(shí)間,它可以強(qiáng)化菌株再次暴露于脅迫條件下的適應(yīng)與恢復(fù)能力。有研究表明,低強(qiáng)度的脅迫預(yù)適應(yīng)可以提高酒酒球菌在復(fù)合脅迫條件下的耐受性,且酒酒球菌存在著脅迫交叉保護(hù)現(xiàn)象,經(jīng)酸脅迫預(yù)培養(yǎng)的菌體細(xì)胞接種到葡萄酒后,可以增強(qiáng)對其他脅迫的耐受性[23]。酸性條件下預(yù)培養(yǎng)可以提高酒酒球菌在高濃度SO2存在條件下或冷凍干燥后細(xì)胞的恢復(fù)與存活能力,且對SO2的脅迫應(yīng)答會啟動pH內(nèi)外穩(wěn)定及脅迫應(yīng)答蛋白合成等機(jī)制,以此消除脅迫帶來的影響[24-25]。除了酸脅迫預(yù)培養(yǎng)外,培養(yǎng)時(shí)加入低濃度乙醇(體積分?jǐn)?shù)為10%)可以顯著提高細(xì)胞冷凍干燥后的存活率[26]。此外,在脅迫預(yù)培養(yǎng)階段添加谷胱甘肽,可以顯著提高細(xì)胞在模擬酒環(huán)境(乙醇體積分?jǐn)?shù)12%,pH 3.4)下的生存能力,并且MLF速率比未添加谷胱甘肽預(yù)培養(yǎng)的菌株高[27]。

2.2 外源添加物

已有報(bào)道表明,通過外源添加一些物質(zhì),提高乳酸菌的抗脅迫能力。其中還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione, GSH)可以促進(jìn)O.oeniSD-2a在酸脅迫(pH 3.4)和乙醇脅迫(乙醇體積分?jǐn)?shù)12%)環(huán)境中的生長能力,且不同的添加濃度可以刺激不同脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá), 顯著提高蘋果酸乳酸發(fā)酵速率[27]。MARGALEF-CATAL等[28]也有相似的發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)時(shí)加入谷胱甘肽可以增加細(xì)胞膜環(huán)丙烷脂肪酸含量,從而提高酒酒球菌在高乙醇(體積分?jǐn)?shù)為14%)和其他條件下(pH 4、pH 3.4和體積分?jǐn)?shù)為6%的乙醇)的生存能力和生長速度。此外,在研究乳酸菌脅迫應(yīng)答過程中,發(fā)現(xiàn)添加一些外源氨基酸可以提高乳酸菌酸脅迫耐受性,例如添加亮氨酸可以顯著提高菌體酸脅迫后的存活率[29],顯著提高了其酸脅迫耐受性。此外,也有添加谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和瓜氨酸提高細(xì)菌酸脅迫耐受性的報(bào)道[30-32]。

2.3 菌種改良

菌種改良的方法主要分為基因重組法和非基因重組法2種,各有優(yōu)缺點(diǎn)。基因重組技術(shù)通常具有較高的精度,通常側(cè)重于特定基因的添加或刪除,它的應(yīng)用需要對菌株的遺傳背景與基因功能有清楚的認(rèn)識。相比之下,非基因重組方法通常不需要事先了解某一性狀的遺傳基礎(chǔ),但它的突變一般是隨機(jī)發(fā)生的,需要花費(fèi)大量時(shí)間進(jìn)行特定性狀突變株的篩選[33]。目前,已有成功在酒酒球菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的報(bào)道[34-35],但由于轉(zhuǎn)化率較低,這些實(shí)驗(yàn)尚未在其他實(shí)驗(yàn)室完成重現(xiàn)。加之,政府及消費(fèi)者對轉(zhuǎn)基因微生物直接應(yīng)用于食品生產(chǎn)的限制,因此,酒酒球菌生產(chǎn)菌株改良主要采用非基因重組方法。

非基因重組方法,包括誘變、傳統(tǒng)菌株篩選法和定向進(jìn)化等方法,這些方法不需要特定的遺傳知識,但需要經(jīng)過繁瑣的篩選過程來選擇最佳突變菌株。紫外誘變技術(shù)已成功應(yīng)用于葡萄酒釀造菌株篩選中,且從經(jīng)過紫外照射處理的菌株中篩選出了蘋果酸乳酸發(fā)酵優(yōu)良菌株[36]。盡管誘變操作容易實(shí)現(xiàn),但其缺點(diǎn)是突變位點(diǎn)的隨機(jī)性,目標(biāo)表型出現(xiàn)突變的概率較低。傳統(tǒng)菌株篩選法一般是從與葡萄酒生產(chǎn)相關(guān)環(huán)境中(葡萄表皮、葡萄汁、自然發(fā)酵葡萄酒等)分離和篩選酒酒球菌。許多具有應(yīng)用前景的酒酒球菌菌株都是來自于傳統(tǒng)菌株篩選法[37-38]。定向進(jìn)化可以直接利用脅迫條件下大量傳代培養(yǎng),利用微生物自發(fā)有益突變在脅迫條件下的逐漸積累,獲得所需表型的優(yōu)良突變菌株,但是,這一過程一般耗時(shí)較長。BETTERIDGE等[39]對酒酒球菌進(jìn)行了乙醇脅迫下的定向進(jìn)化研究,試驗(yàn)獲得的突變菌株A90在20%(體積分?jǐn)?shù))的酒精存在情況,其存活數(shù)量比對照菌株提高了3個(gè)數(shù)量級。JIANG等[40]以A90為出發(fā)菌株,進(jìn)行了酒精、二氧化硫和酸多重脅迫因素的定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn),經(jīng)過350代的篩選,獲得了3株在極端模擬酒條件下發(fā)酵性能顯著提升的突變菌株。

3 展望

葡萄酒是由多種物理、化學(xué)脅迫因子組成的液體環(huán)境,這些脅迫因素的存在,常常造成蘋果酸乳酸發(fā)酵啟動的延遲甚至是失敗,因此越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)向酒酒球菌脅迫應(yīng)答機(jī)制研究中,以期尋找高效方案解決蘋果酸乳酸發(fā)酵啟動穩(wěn)定性的問題。隨著測序技術(shù)及質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,研究者利用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等技術(shù),初步解析了酒酒球菌脅迫應(yīng)答機(jī)制,但目前研究主要集中在酒酒球菌乙醇脅迫應(yīng)答機(jī)制中,少有對酸、冷凍干燥、二氧化硫等脅迫因素的應(yīng)答機(jī)制系統(tǒng)性的研究,需要進(jìn)一步拓展。

本文通過總結(jié)已報(bào)道酒酒球菌酸脅迫應(yīng)答研究,繪制酒酒球菌酸脅迫應(yīng)答機(jī)制示意圖(圖1),酒酒球菌細(xì)胞暴露在酸脅迫環(huán)境中時(shí),細(xì)胞通過改變細(xì)胞膜脂肪酸組分、降低細(xì)胞膜流動性和細(xì)胞膜損傷修復(fù)等阻隔氫離子向細(xì)胞內(nèi)部流動,H+-ATP酶等氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將流向胞內(nèi)的氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞,蘋果酸、檸檬酸、氨基酸代謝等過程消耗胞內(nèi)氫離子,產(chǎn)生ATP,ATP酶借助細(xì)胞跨膜pH梯度(ΔpH)和電位差Δψ產(chǎn)生能量,受損傷的DNA和蛋白質(zhì)在錯(cuò)配修復(fù)基因和伴侶蛋白作用下保持正常的復(fù)制過程與催化活性。

圖1 酒酒球菌酸脅迫應(yīng)答機(jī)制示意圖Fig.1 The schematic diagram of acid stress response mechanism in Oenococcus oeni

雖然酒酒球菌酸脅迫應(yīng)答機(jī)制已經(jīng)取得一定的研究進(jìn)展,但仍然缺乏系統(tǒng)性,多數(shù)研究者側(cè)重于利用組學(xué)技術(shù)發(fā)掘差異表達(dá)基因,但這些基因在其酸脅迫應(yīng)答機(jī)制中的具體作用,酒酒球菌在酸脅迫條件下連續(xù)的生理、生化變化,酒酒球菌酸脅迫反應(yīng)的啟動順序等方面,仍需要研究者進(jìn)行系統(tǒng)性的研究。通過解析酒酒球菌酸脅迫應(yīng)答機(jī)制,可以促進(jìn)蘋果酸乳酸發(fā)酵啟動的穩(wěn)定性,促進(jìn)蘋果酸乳酸發(fā)酵菌劑的國產(chǎn)化與規(guī)模化,有利于我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)的健康與可持續(xù)發(fā)展。