亢樂(lè),張麗杰*,徐巖*

1(釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)

郫縣豆瓣是我國(guó)傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)發(fā)酵食品,因其鮮辣醇厚、瓣粒香脆、香氣濃郁,被譽(yù)為“川菜之魂”[1]。作為調(diào)味品,郫縣豆瓣不僅給予人們感官上的享受,也提供了維生素、礦物質(zhì)和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),從而表現(xiàn)出對(duì)人體健康的有益影響[2]。2018年,郫縣豆瓣及衍生產(chǎn)品覆蓋全國(guó)超過(guò)65%的餐飲業(yè),產(chǎn)值近200億,品牌價(jià)值提升至656.36億元[3]。在郫縣豆瓣生產(chǎn)過(guò)程中,蠶豆曲的制備是首要且關(guān)鍵工序[4]。而在蠶豆曲制備過(guò)程中,原料大分子是否充分降解為小分子物質(zhì),從而為后續(xù)高鹽發(fā)酵提供充足營(yíng)養(yǎng),決定了郫縣豆瓣的整體發(fā)酵質(zhì)量及生產(chǎn)品質(zhì)。

米曲霉是一種通常含有高效且豐富水解酶系的菌種,包括淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等,是蠶豆曲生產(chǎn)的關(guān)鍵微生物[5]。目前,郫縣豆瓣蠶豆曲發(fā)酵多采用純種米曲霉滬釀3.042,該菌株于1976年由上海釀造研究所經(jīng)紫外誘變及長(zhǎng)期馴化得到(原始菌株:米曲霉AS 3.863),生長(zhǎng)速度快、繁殖力強(qiáng)、水解酶活力高卻不平衡,距今已有近半個(gè)世紀(jì)的工業(yè)應(yīng)用歷史[6-7]。為進(jìn)一步提高制曲過(guò)程曲霉活力,幾十年來(lái),科研人員從未停止過(guò)優(yōu)質(zhì)米曲霉菌種或菌劑的研發(fā)及獲取[8-9]。TANG等[10]從傳統(tǒng)釀造郫縣豆瓣、醬油醬醅中分離篩選高產(chǎn)蛋白酶菌株,并使用黑曲霉QH-3和米曲霉QM-6共培養(yǎng)制曲有效提高蠶豆曲水解酶活力,且成曲曲香更為濃郁。劉丹等[11]采用米曲霉與紅曲霉混合制作黃豆醬大曲,還原糖含量顯著提高,風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)和感官評(píng)分均較純種黃豆醬有所提升,更多有工業(yè)應(yīng)用潛力的優(yōu)質(zhì)菌種或復(fù)合菌劑亟待開(kāi)發(fā)。

本研究從傳統(tǒng)釀造食品微生物菌種資源庫(kù)中分離篩選鑒定2株具有優(yōu)良發(fā)酵特性的曲霉菌株,經(jīng)鑒定為米曲霉LBM 30007和米曲霉LBM 30008。經(jīng)基礎(chǔ)發(fā)酵特征檢驗(yàn),本研究發(fā)現(xiàn)不同米曲霉菌株具有發(fā)酵互補(bǔ)性能。設(shè)計(jì)包括米曲霉滬釀3.042在內(nèi)的復(fù)合菌劑制曲,發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌劑能明顯提升制曲過(guò)程中的水解酶活力、氨基酸態(tài)氮濃度及鮮味氨基酸濃度。本研究設(shè)計(jì)了一種制曲用復(fù)合菌劑的構(gòu)建策略,篩選獲得并鑒定優(yōu)質(zhì)米曲霉菌株及復(fù)合菌劑,具有郫縣豆瓣工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用潛力,同時(shí)為其他高鹽高氮發(fā)酵食品工業(yè)化應(yīng)用提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

米曲霉滬釀3.042購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(編號(hào)CICC 2399);菌株LBM 30007、LBM 30008等生物學(xué)分類(lèi)被初步鑒定為曲霉的50株菌均保藏于江南大學(xué)釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室菌種庫(kù),其中,28株曲霉于2019—2021年分離純化自發(fā)酵醬樣品,22株曲霉于1980—2021年分離篩選自發(fā)酵醬油醬醪樣品。

1.1.2 材料與試劑

面粉、麩皮、蠶豆,市售;脫脂奶粉、L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺、果膠、半乳糖醛酸,生工生物工程(上海)股份有限公司;瓊脂粉、酪氨酸、干酪素、福林酚試劑、葡萄糖、可溶性淀粉、無(wú)水乙醇、硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、三氯乙酸、乳酸、乳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼砂、4-硝基苯胺、三(羥甲基)氨基甲烷、甲醛、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、磺基水楊酸、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、硫酸鈉、醋酸、醋酸鈉、碘、碘化鉀、羧甲基纖維素鈉,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Miracloth,Merck公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,按試劑瓶說(shuō)明配制。

酸性脫脂奶粉培養(yǎng)基:A液為25 g/L脫脂奶粉水溶液,B液為20 g/L瓊脂水溶液。A液與B液分別115 ℃滅菌30 min,使用時(shí)在無(wú)菌環(huán)境下按體積比2∶3 混合,并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0。

種曲培養(yǎng)基∶按照麩皮與面粉質(zhì)量比7∶3在250 mL 三角瓶中加入20 g過(guò)10目篩的干料,并加入干料量70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的水,拌勻。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平、pH計(jì),Mettler Toledo公司;高壓濕熱自動(dòng)蒸汽滅菌鍋,Tomy公司;超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;高速離心機(jī),Eppendorf公司;CytationTM3多功能酶標(biāo)儀,BioTek公司;BX51光學(xué)顯微鏡,Olympus公司;Quanta 200掃描電子顯微鏡,Fei公司;L-8900氨基酸分析儀,Hitachi公司;KjeltecTM8000凱氏定氮儀,FOSS公司;SBA-40X生物傳感分析儀,濟(jì)南研科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 優(yōu)質(zhì)米曲霉的獲得

(1)菌種培養(yǎng)與孢子懸浮液的制備

將曲霉菌種在PDA平板上點(diǎn)種,30 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。待產(chǎn)孢充分后,每個(gè)平板加入適量無(wú)菌水,用無(wú)菌涂布棒在菌絲表面輕輕刮拭,將孢子刮下。將收集到的孢子洗脫液搖勻,用Miracloth對(duì)洗脫液進(jìn)行過(guò)濾,收集濾液,即獲得孢子懸浮液,置于4 ℃保存。

(2)高產(chǎn)酸性蛋白酶曲霉菌株的篩選

將孢子懸浮液搖勻后取適量用于血球計(jì)數(shù),獲得孢子懸液母液的濃度。將母液梯度稀釋至孢子濃度為106個(gè)/mL,接種100 μL于直徑為150 mm的篩選培養(yǎng)基,每平板8株,30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d,挑選在pH 3.0的脫脂奶粉培養(yǎng)基中透明圈/菌落直徑比均大的菌株。篩選時(shí)以米曲霉滬釀3.042為對(duì)照,設(shè)置3個(gè)平行。

(3)菌落的形態(tài)學(xué)觀察

取培養(yǎng)成熟的培養(yǎng)基平板,肉眼觀察菌落形態(tài)特征,掃描電子顯微鏡觀察生物精細(xì)結(jié)構(gòu),特別是菌絲分支情況及分生孢子梗結(jié)構(gòu),參照《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[12]。

(4)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

對(duì)菌株LBM 30007、LBM 30008及米曲霉滬釀3.042 進(jìn)行全基因組測(cè)序及拼接,信息公布于NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/),項(xiàng)目登錄號(hào)為PRJNA800656;另外,從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)獲取8株曲霉屬黃綠組菌株、4株非黃綠組曲霉菌株、1株青霉及1株粗糙脈孢霉的全基因組序列[13]。構(gòu)建前述17株霉菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),建樹(shù)時(shí),OrthoFinder v2.4.1[14]查找同源基因→MAFFT[15]多序列比對(duì)→ Gblocks(http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_ server.html)去除分歧和模糊對(duì)齊的位點(diǎn),調(diào)取保守區(qū)域→SeqKit(https://bioinf.shenwei.me/seqkit/)連接→ IQ-TREE v1.6.12(ht- tp://www.iqtree.org/)確定最佳氨基酸替代模型后構(gòu)建最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)→iTOL(https://itol.embl.de/)進(jìn)化樹(shù)可視化及美化。

1.3.2 制曲工藝

種曲制作:將平板培養(yǎng)菌種的孢子用接種針接入種曲培養(yǎng)基,搖勻后30 ℃培養(yǎng)4 d,每日攪拌使曲料松散。

蠶豆曲制作:將蠶豆瓣用自來(lái)水沖洗3次除雜,95 ℃燙瓣20 s,再將蠶豆在45 ℃清水中浸泡20 min,瀝干水分。按干蠶豆瓣與小麥粉的質(zhì)量比100∶30進(jìn)行拌粉。按6.75×106個(gè)孢子/g干蠶豆瓣的比例加入種曲,混合均勻后置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(0～20 h時(shí),控制溫度30 ℃、濕度90%;20 h至結(jié)束,控制溫度28 ℃、濕度80%)。當(dāng)曲料逐漸出現(xiàn)嫩黃綠色孢子后(約72 h),即可出曲,檢測(cè)成曲的酶活力及氨基酸含量。

多菌種混合制曲時(shí),米曲霉LBM 30008分生孢子占比30%,米曲霉LBM 30007占比30%,米曲霉滬釀3.042占比40%,種曲接種量同上(6.75×106個(gè)孢子/g干蠶豆瓣)。

1.3.3 檢測(cè)方法

(1)孢子數(shù)測(cè)定

三角瓶種曲克孢子數(shù)測(cè)定按照SB/T 10315—1999 《孢子數(shù)測(cè)定法》規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。

(2)酶活力測(cè)定

粗酶液制備:準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g種曲或大曲,充分研磨,去離子水或緩沖液定容至20 mL后40 ℃水浴1 h,每隔10 min攪拌l次,用濾紙過(guò)濾,濾液即為待測(cè)酶液,用于后續(xù)酶活力測(cè)定。

淀粉酶活力測(cè)定參照褚清龍等[16]的方法,在40 ℃,1 g曲樣1 min水解1 mg淀粉的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。糖化酶、果膠酶、纖維素酶活力測(cè)定采用DNS法[17],在40 ℃、pH 4.8條件下,1 min催化水解淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖的酶量定義為1個(gè)糖化酶活力單位;pH 4.4、40 ℃水浴條件下,1 min催化果膠質(zhì)水解產(chǎn)生1 μg半乳糖醛酸的酶量定義為1個(gè)果膠酶活力單位;在40 ℃、pH 4.8條件下,1 h水解CMC產(chǎn)生相當(dāng)于1 mg葡萄糖的酶量定義為1個(gè)纖維素酶活力單位。蛋白酶活力按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定,在40 ℃下1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸,定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。氨肽酶活力測(cè)定時(shí)以L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺為底物,在40 ℃、pH 8.0條件下,1 min水解亮氨酸對(duì)硝基苯胺生成1 μg對(duì)硝基苯胺所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位[18]。

(3)理化指標(biāo)檢測(cè)

氨基酸態(tài)氮檢測(cè)參照GB 5009.235—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》方法。游離氨基酸測(cè)定具體操作參考已有研究[19],即樣品預(yù)處理方法為取4 g樣品加入16 mL超純水中,振蕩混勻后,冰浴超聲30 min;將超聲后的液體于10 000 r/min,4 ℃ 離心5 min,取1 mL上清液加入等體積的10%磺基水楊酸,4 ℃靜置4 h以沉淀蛋白質(zhì),10 000 r/min,4 ℃ 離心10 min,0.02 mol/L HCl稀釋至上機(jī)濃度,過(guò)膜后進(jìn)氨基酸分析儀。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel處理數(shù)據(jù),表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;采用Origin 2021b繪制圖表;采用TBtools繪制熱圖,并對(duì)每一列數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)酸性蛋白酶曲霉菌株的篩選

為獲得在酸性條件下具有較高蛋白降解活力的菌種,本研究在江南大學(xué)釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室菌種庫(kù)中獲得曲霉50株,并通過(guò)檢測(cè)pH 3.0條件下脫脂奶粉培養(yǎng)基中透明圈大小初篩具有較高酸性蛋白酶活力的曲霉菌株。如圖1所示,曲霉LBM 30007、LBM 30008在酸性環(huán)境水解酪蛋白能力較強(qiáng),透明圈/菌落直徑比大于米曲霉滬釀3.042(圖1),用于后續(xù)研究。

30007-曲霉LBM 30007;30008-曲霉LBM 30008;3042-米曲霉滬釀3.042圖1 高產(chǎn)酸性蛋白酶曲霉菌株篩選Fig.1 Screening of aspergillar strains with high-producing acid protease

2.2 菌株種屬鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將如上2株曲霉LBM 30007、LBM 30008與米曲霉滬釀3.042在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d,如圖2所示,3種曲霉菌種在形態(tài)學(xué)上有明顯差異。菌株LBM 30007在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)成熟時(shí),菌落質(zhì)地為絲絨狀,顏色為黃綠色,邊緣不規(guī)則(圖2-a)。菌株LBM 30008菌落為橄欖黃色,絲絨狀,具有不明顯輻射狀溝紋,邊緣整齊(圖2-b)。滬釀3.042菌落為茶綠色,絮狀,黃綠色邊緣相對(duì)整齊(圖2-c)。利用顯微鏡同時(shí)放大1 200倍,觀察發(fā)現(xiàn),3種曲霉分生孢子梗均發(fā)生于基質(zhì)或氣生菌絲,分生孢子梗莖粗糙,分生孢子頭呈輻射狀,頂囊為球型,表面可育,產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層并產(chǎn)生球型、粗糙分生孢子(圖2-d～圖2-f)。然而,在分生孢子直徑方面,菌株LBM 30007和LBM 30008大于米曲霉滬釀3.042。

依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》、與米曲霉滬釀3.042的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)進(jìn)行比對(duì),基本可以確認(rèn)LBM 30007和LBM 30008生物學(xué)分類(lèi)為曲霉屬(Aspergillus)黃綠組(Flavi)。

a-菌株LBM 30007的菌落形態(tài);b-菌株LBM 30008的菌落形態(tài);c-米曲霉滬釀3.042的菌落形態(tài);d-菌株LBM 30007的顯微形態(tài);e-菌株LBM 30008的顯微形態(tài);f-米曲霉滬釀3.042的顯微形態(tài)圖2 菌株LBM 30007、LBM 30008及米曲霉滬釀3.042的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)Fig.2 Colony and microscopic morphology of strain LBM 30007,LBM 30008, and A.oryzae HN 3.042

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

為明確菌株LBM 30007和LBM 30008的生物學(xué)分類(lèi)地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,選取9株曲霉屬環(huán)繞亞屬黃綠組菌株(A.leporisCBS 151.66、A.coremiiformisCBS 553.77、A.alliaceusCBS 536.65、A.pseudonomiaeCBS 119388、A.tamariiCBS 117 626、A.transmontanensisCBS 130015、A.flavusNRRL 3357、A.oryzaeRIB40及A.oryzaeHN 3.042)、3株曲霉屬環(huán)繞亞屬非黃綠組菌株(A.nigerATCC 1015、A.terreusNIH2624和A.steyniiIBT 23096)、1株曲霉屬巢狀亞屬菌株(A.nidulansFGSC A4)、1株青霉屬菌株(Penicilliumrubens43M1)及1株粗糙脈孢霉(NeurosporacrassaOR74A),比較17株霉菌的全基因組,基于單拷貝直系同源基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。

系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如圖3所示,進(jìn)化樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及分類(lèi)學(xué)分類(lèi)與前人研究一致[13]。菌株LBM 30007和LBM 30008為曲霉屬黃綠組,驗(yàn)證了形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)論。另外,菌株LBM 30007和LBM 30008與日本米曲霉RIB 40、中國(guó)米曲霉滬釀3.042親緣關(guān)系最為接近,可進(jìn)一步判斷其屬于米曲霉。

綜合形態(tài)學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,可以判斷菌株LBM 30007和LBM 30008均為米曲霉。

圖3 菌株LBM 30007、LBM 30008與其他15株真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain LBM 30007,LBM 30008,and 15 other fungi

2.3 米曲霉的基礎(chǔ)發(fā)酵表型特性

米曲霉的基礎(chǔ)發(fā)酵特征是判斷其是否適合作為制曲菌種的基礎(chǔ)。在本研究中,作者利用蒸煮麩皮面粉為培養(yǎng)基,分別使用米曲霉LBM 30007、LBM 30008及滬釀3.042制作種曲,觀察種曲感官特征,測(cè)定產(chǎn)孢情況、水解酶活力等制曲關(guān)鍵指標(biāo),挖掘不同米曲霉的生產(chǎn)應(yīng)用潛能。

2.3.1 米曲霉產(chǎn)孢數(shù)量評(píng)價(jià)

米曲霉產(chǎn)孢數(shù)量是曲種質(zhì)量評(píng)價(jià)中的關(guān)鍵指標(biāo)之一[20],高產(chǎn)孢曲種有利于大幅提升種曲生產(chǎn)效率,因此,一般要求曲種產(chǎn)孢量不低于6×109個(gè)/g干基。如表1所示,經(jīng)過(guò)4 d的培養(yǎng),米曲霉滬釀3.042產(chǎn)生大量分生孢子(1.50×1010個(gè)/g干基);相較而言,米曲霉LBM 30007和LBM 30008產(chǎn)孢數(shù)量較少,分別為7.25×109個(gè)/g干基及4.38×109個(gè)/g干基。從產(chǎn)孢數(shù)量來(lái)看,米曲霉滬釀3.042仍擁有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。米曲霉LBM 30007滿(mǎn)足曲種產(chǎn)孢量的要求,米曲霉LBM 30008接近曲種產(chǎn)孢量的基本要求。

表1 種曲質(zhì)量評(píng)價(jià)Table 1 Quality evaluation of seed koji

2.3.2 米曲霉酶系特征分析

酶系特征,特別是水解酶系特征,是評(píng)價(jià)曲種質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之二。經(jīng)過(guò)4 d的培養(yǎng),3株米曲霉分泌產(chǎn)生的淀粉酶、糖化酶、果膠酶、纖維素酶、亮氨酸氨肽酶、蛋白酶(酸性、中性、堿性)活力如圖4所示,米曲霉LBM 30007酶系最為均衡,其中,糖化酶活力較高,有助于淀粉質(zhì)原料降解。另外,LBM 30007產(chǎn)生的酸性、堿性及中性蛋白酶活力也極具優(yōu)勢(shì),結(jié)合孢子產(chǎn)生性能,本研究認(rèn)為米曲霉LBM 30007是一種有潛力的制曲用菌。相反地,米曲霉LBM 30008具有較高的淀粉酶和果膠酶活力,其他水解酶活力整體較低。然而,該菌種的孢子萌發(fā)時(shí)間極短(未發(fā)表數(shù)據(jù)),有希望在制曲過(guò)程中抑制雜菌污染。綜合判斷,2株米曲霉LBM 30007及LBM 30008在孢子形成、孢子萌發(fā)速率及水解酶活力方面各有特點(diǎn),有希望在郫縣豆瓣蠶豆醅發(fā)酵方面發(fā)揮作用。

圖4 種曲酶活力Fig.4 Enzymatic activities of seed koji

2.4 單菌與混菌制曲比對(duì)

為進(jìn)一步探究米曲霉LBM 30007和LBM 30008在郫縣豆瓣蠶豆曲制作過(guò)程中的制曲性能,改善米曲霉滬釀3.042單菌制曲酶系不均衡可能導(dǎo)致的原料降解不充分問(wèn)題,本研究分別使用米曲霉滬釀3.042、LBM 30007、LBM 30008純菌種制曲、組合上述3株米曲霉進(jìn)行復(fù)合菌劑制曲,檢測(cè)成曲酶活力及與蛋白質(zhì)利用相關(guān)的理化指標(biāo)。

2.4.1 制曲過(guò)程曲料感官變化

本研究模擬郫縣豆瓣蠶豆曲原料預(yù)處理過(guò)程及制曲過(guò)程,分別利用米曲霉滬釀3.042、LBM 30007、LBM 30008三株米曲霉進(jìn)行純種制曲及復(fù)合制曲,并跟蹤監(jiān)測(cè)單菌株及復(fù)合菌劑制作郫縣豆瓣蠶豆曲過(guò)程中曲料的感官變化。如圖5所示,制曲第1天時(shí),曲料白色菌絲叢生,無(wú)孢子,微有蠶豆香,質(zhì)地柔軟,富有彈性,稍有結(jié)塊,需將曲料打散;第2天時(shí),菌絲豐滿(mǎn),幾乎布滿(mǎn)嫩綠色孢子,有曲香味,質(zhì)地較硬且蓬松;第3天時(shí),孢子豐滿(mǎn),呈黃綠色,曲香濃郁,無(wú)酸味、氨味等不良異味,質(zhì)地較硬且蓬松。然而,與復(fù)合菌種制曲相比,單一菌株制曲顯示菌種生長(zhǎng)較慢、曲香稍欠缺。因此,本研究推測(cè)復(fù)合制曲有提高原料利用率,縮短制曲周期,改善成曲風(fēng)味的潛力。

圖5 制曲過(guò)程中曲料的外觀變化Fig.5 Appearance changes during the process of koji-making

2.4.2 成曲酶活力與氨基態(tài)氮含量

蛋白酶將原料中的蛋白質(zhì)分解為胨、多肽、低分子肽和氨基酸,是非揮發(fā)性滋味物質(zhì)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體。另外,亮氨酸氨肽酶從多肽N端水解氨基酸,有助于苦味的去除、鮮味物質(zhì)的積累。在郫縣豆瓣蠶豆曲制備過(guò)程中,單菌株及復(fù)合菌株制曲產(chǎn)蛋白水解酶情況如圖6-a、圖6-b所示,顯示不同菌株制曲酶活力存在較大差異。米曲霉LBM 30007在中性、酸性蛋白酶及亮氨酸氨肽酶活力分別為滬釀3.042的1.9倍、1.2倍和1.8倍,有利于蛋白質(zhì)原料的充分降解。另外,復(fù)合菌種制備的曲料中,酸性、中性蛋白酶及亮氨酸氨肽酶活力均較單菌株制曲有所提升,分別達(dá)到153.54、703.22、392.51 U/g。其中,酸性蛋白酶活力較滬釀3.042制曲提高了23.25%。如上結(jié)果表明,復(fù)合制曲中,菌株之間的競(jìng)爭(zhēng)協(xié)同作用正向影響了蛋白水解酶的產(chǎn)生,能夠有效提高蠶豆曲中蛋白酶活力及蛋白酶系均衡度。

此外,復(fù)合菌種制曲的優(yōu)勢(shì)也反映在蠶豆成曲的氨基酸態(tài)氮含量上(圖6-c)。氨基酸態(tài)氮是判定發(fā)酵產(chǎn)品發(fā)酵程度的特性指標(biāo)。如圖6-c所示,采用復(fù)合米曲霉菌株制曲時(shí),成熟的蠶豆曲中氨基酸態(tài)氮含量高于單菌制曲,較滬釀3.042制曲提高了0.14 g/100g。

a-蛋白水解酶;b-亮氨酸氨肽酶;c-氨基酸態(tài)氮圖6 成曲酶活力及氨基酸態(tài)氮含量Fig.6 Enzymatic activities and amino acid nitrogen content of koji

2.4.3 成曲游離氨基酸測(cè)定及分析

菌株及復(fù)合菌株制備的郫縣豆瓣蠶豆曲的游離氨基酸結(jié)果如表2所示。不同菌株制曲的游離氨基酸總量差異不大,分布在18.36～21.16 g/L,但游離氨基酸組成差異較大。從氨基酸風(fēng)味及其占全部氨基酸比重來(lái)看,米曲霉LBM 30008制曲鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)比重最大,為21.12%,滬釀3.042 鮮味氨基酸占比最小(18.36%);米曲霉LBM 30007制曲甜味氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、賴(lài)氨酸)比重最大,為36.57%,混菌制曲最小(35.39%);米曲霉滬釀3.042制曲苦味氨基酸(甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸)比重最大,為45.11%,LBM 30008最小(42.88%)。綜上,米曲霉LBM 30008制曲后,游離氨基酸,特別是鮮味及甜味氨基酸比例更優(yōu)。從氨基酸比例及絕對(duì)含量來(lái)看,復(fù)合菌劑制曲產(chǎn)生了最高濃度的游離氨基酸,且鮮味、甜味、苦味氨基酸含量均高于單菌種制曲。另外,復(fù)合菌劑制曲較滬釀3.042制曲產(chǎn)生了更高比例的鮮味氨基酸(11.33%),甜味及苦味氨基酸含量輕微下降,分別下降了3.11%和2.31%。由此推測(cè),復(fù)合菌株制備的郫縣豆瓣鮮味可能更加濃郁。

表2 成曲游離氨基酸含量 單位:g/L

3 討論與結(jié)論

本研究從江南大學(xué)釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室初篩獲得2株在酸性條件下具有較高蛋白水解酶活性的菌株,分別為曲霉LBM 30007及LBM 30008。經(jīng)表型(包括顯微表型)及系統(tǒng)發(fā)育分析,鑒定如上2株菌為米曲霉。對(duì)米曲霉滬釀3.042、LBM 30007及LBM 30008進(jìn)行基礎(chǔ)發(fā)酵表型特性分析,發(fā)現(xiàn)與滬釀3.042相比,米曲霉LBM 30007在蛋白及淀粉水解酶活力方面具有優(yōu)勢(shì),LBM 30008在孢子萌發(fā)速率方面有優(yōu)勢(shì),因此,將3種米曲霉進(jìn)行組合制曲,可能會(huì)提高郫縣豆瓣蠶豆醅蛋白降解效率。將3株米曲霉進(jìn)行復(fù)合制曲,用于制備郫縣豆瓣蠶豆醅,結(jié)果顯示,復(fù)合制曲的酸性和中性蛋白酶活力、亮氨酸氨肽酶活力、氨基酸態(tài)氮含量及鮮味氨基酸含量均有所提升,彌補(bǔ)了LBM 30007、LBM 30008繁殖能力較差以及滬釀3.042酶系不均衡的缺陷,有助于制備品質(zhì)更為優(yōu)良、風(fēng)味更加濃郁的郫縣豆瓣成曲。本研究鑒定獲得的優(yōu)質(zhì)米曲霉菌株及復(fù)合菌劑,對(duì)郫縣豆瓣在內(nèi)的高鹽高氮發(fā)酵食品具有潛在應(yīng)用價(jià)值。