黃錦楨 王宇新 曾 華 童光東,△ 黃芙蓉 賴劍萍 陳團(tuán)團(tuán)

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院 (廣東 深圳， 518033) 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院 3.深圳市中醫(yī)院肝病科

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)與遺傳易感性和胰島素抵抗密切相關(guān)[1,2]。在中國(guó)大陸，18歲以上人群NAFLD患病率為20.09%，發(fā)病率為63.0/1 000人/年，全世界25%的人口被認(rèn)為患有NAFLD[3-5]。NAFLD在中醫(yī)屬于“脅痛”“痞滿”等范疇，基本病機(jī)以肝失疏泄，脾氣虧虛為本，病位主要在肝脾腎[6]。根據(jù)五行理論，肝屬木，脾屬土，當(dāng)肝臟受邪，往往可見(jiàn)與脾胃相關(guān)的癥狀[7,8]?！督饏T要略》曰：“見(jiàn)肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”。因此，臨床在治療NAFLD時(shí)往往需要顧及脾胃。 “茯苓-白術(shù)”藥對(duì)(FB)始見(jiàn)于《傷寒雜病論》，是治療脾胃氣虛常用藥對(duì)[9]。根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]，胃苓湯和逍遙散分別作為“濕濁內(nèi)停型”和“肝郁脾虛型”的推薦用方，這兩方中都含有茯苓、白術(shù)。此外，用藥規(guī)律分析研究亦挖掘到FB是治療NAFLD的主要藥物[10-12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明茯苓具有保肝、抗衰老、抗炎等作用[13]，白術(shù)具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抑制脂肪形成等作用[14]。但目前的研究多針對(duì)單味藥，對(duì)該藥對(duì)的研究較少。本研究將借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討FB治療NAFLD的作用機(jī)制，為下一步研究提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 FB活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選 通過(guò)TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索茯苓、白術(shù)的活性成分，以口服利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18進(jìn)行篩選，將獲得的成分在TCMSP上匹配對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)[15]。少數(shù)未能匹配到靶點(diǎn)的成分，將利用PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)平臺(tái)及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)；最后借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org)標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息。

1.2 NAFLD相關(guān)靶點(diǎn)篩選 在GeneCards(http://www.genecards.org/)和DisGeNET(http：//www.disgenet.org/2019版v6.0)數(shù)據(jù)中以“non-alcoholic fatty liver disease”或“NAFLD”為關(guān)鍵詞挖掘疾病靶點(diǎn)，將得到的靶點(diǎn)合并、去重得到NAFLD的潛在靶點(diǎn)。

1.3 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對(duì)藥物與疾病的靶點(diǎn)繪制韋恩圖，將交集靶點(diǎn)上傳至STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org)，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，選取minimum required interaction score>0.700，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，其余為默認(rèn)設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO和 KEGG分析 在DAVID6.7數(shù)據(jù)庫(kù)(http://david.ncifcrf.gov/)中上傳交集靶點(diǎn),選定物種為“Homo sapiens”,進(jìn)行GO(生物過(guò)程BP、分子功能MF、和細(xì)胞組成CC)和KEGG富集分析,以P<0.05初步篩選。利用Sangerbox平臺(tái)(http://www.sangerbox.com/Tool)對(duì)P值前10的GO及前20的通路結(jié)果可視化。

1.5 藥對(duì)成分-異常靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 挖掘KEGG前20條通路上各自富集的靶點(diǎn)，并根據(jù)1.1的結(jié)果匹配對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分。借助CytoScape3.7.2構(gòu)建 “藥對(duì)成分-異常靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖”，利用軟件功能分析成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度、介度及緊密度等，根據(jù)上述參數(shù)篩選核心靶點(diǎn)及核心活性成分。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 對(duì)1.5獲得的核心靶點(diǎn)及成分進(jìn)行分子對(duì)接。借助RSCB PDB(http://www.rcsb.org/)及ZINC(http://zinc.docking.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲取靶點(diǎn)蛋白3D及成分2D結(jié)構(gòu)。應(yīng)用Autodock Tolls軟件進(jìn)行除水、加極性氫等處理， Autodock Vina實(shí)現(xiàn)分子對(duì)接，以結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol作為有效結(jié)合的篩選依據(jù)；最后利用Pymol軟件對(duì)結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 FB活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 初步篩選后得到化學(xué)成分茯苓14種、白術(shù)7種；剔除少許未匹配到靶點(diǎn)的活性成分，最終得到重要活性成分茯苓15種、白術(shù)5種，見(jiàn)表1。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)補(bǔ)充，共得到成分作用靶點(diǎn)：茯苓198個(gè)、白術(shù)68個(gè)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后得到FB靶點(diǎn)206個(gè)。

表1 茯苓-白術(shù)藥對(duì)活性成分基本信息

2.2 NAFLD靶點(diǎn)的獲取 通過(guò)Genecards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，分別得到疾病靶點(diǎn)1 532個(gè)、1 058個(gè)，匯總并刪除重復(fù)值，最終得到靶點(diǎn)2 088個(gè)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 藥物與疾病交集靶點(diǎn)為88個(gè)，見(jiàn)圖1。交集靶點(diǎn)PPI見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共有83個(gè)節(jié)點(diǎn)，228條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值5.49。

圖1 茯苓-白術(shù)藥對(duì)與NAFLD靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO和KEGG分析 結(jié)果顯示GO中涉及生物過(guò)程的有152條，如類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、RNA聚合酶II對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等。涉及分子功能的有53條，如類固醇激素受體活性類固醇結(jié)合等。涉及細(xì)胞組成的有18條，如膜筏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等，見(jiàn)圖3。

圖3 BP、CC、MF三合一柱狀圖

KEGG得到信號(hào)通路62條，顯著性較高的前20條通路見(jiàn)圖4。結(jié)合文獻(xiàn)檢索，篩選出可能與NAFLD有關(guān)的通道，并補(bǔ)充相關(guān)性較高但P值排名靠后的通道。結(jié)果顯示：相關(guān)信號(hào)通路涉及胰島素信號(hào)通路(hsa04910)、PPAR信號(hào)通道(hsa03320)、胰島素抵抗(hsa04931)、花生四烯酸代謝(hsa00590)、T細(xì)胞受體信號(hào)通道(hsa04660)、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路(hsa04920)、TNF信號(hào)通路(hsa04668)、NOD樣受體信號(hào)通道(hsa04621)、HIF-1信號(hào)通道(hsa04066)。

圖4 KEGG前20條通路氣泡圖

2.5 藥對(duì)成分-NAFLD異常靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖5。結(jié)果表明齒孔酸、多孔菌酸C、茯苓酸C、去氫齒孔酸的連接度、介度和緊密度為前四，故預(yù)測(cè)這4個(gè)成分為核心活性成分，見(jiàn)表2。同理，靶點(diǎn)中前4位的為TNF、MAPK3、PIK3CA、NR1H3，預(yù)測(cè)這4個(gè)為核心靶點(diǎn)，見(jiàn)表3。

圖5 藥對(duì)成分-NAFLD異常靶點(diǎn)-生物通路網(wǎng)絡(luò)圖

表2 主要化合物成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)參數(shù)

表3 主要靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)參數(shù)

2.6 分子對(duì)接結(jié)果 結(jié)果顯示靶點(diǎn)與成分的結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，說(shuō)明具有較好的親和力，見(jiàn)表4。關(guān)鍵靶點(diǎn)與其結(jié)合活性最好的化合物可視化結(jié)果見(jiàn)圖6。

表4 分子對(duì)接結(jié)果 kcal/mol

圖6 最優(yōu)對(duì)接結(jié)果可視化圖

3 討論

目前西醫(yī)治療NAFLD的方法是改變生活方式、健康飲食和規(guī)律運(yùn)動(dòng)，同時(shí)以調(diào)節(jié)血脂作為輔助治療，然而效果并不理想，而中醫(yī)藥在防治NAFLD方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[16]。治未病是中醫(yī)整體觀的一部分，如張景岳以“肝邪之見(jiàn),本由脾胃之虛,使脾胃不虛,則肝木雖強(qiáng),必?zé)o乘脾之患”言肝脾關(guān)系。如葉天士曰：“夫木郁土，古人制肝補(bǔ)脾升陽(yáng)散邪，皆理偏就和為治。” 因此，發(fā)揮中醫(yī)學(xué)整體觀的特色，從健脾法來(lái)指導(dǎo)中醫(yī)藥治療NAFLD患者具有重要意義。

本研究初步篩選出FB治療NAFLD的核心成分為齒孔酸、多孔菌酸C、茯苓酸C及去氫齒孔酸。研究表明齒孔酸能夠抑制Fas的表達(dá)水平，從而降低脂肪的積累；齒孔酸對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)的糖尿病小鼠的胰島素抵抗有保護(hù)作用[17]。多孔菌酸能抑制小鼠巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生，從而可能發(fā)揮抗炎作用[18]。去氫齒孔酸可能通過(guò)增強(qiáng)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ia(CPT-1a)的表達(dá)水平以及通過(guò)抑制肝臟和脂肪組織中成脂脂肪酸合成酶(FAS)的表達(dá)水平，從而導(dǎo)致肝臟中儲(chǔ)存脂肪的減少和甘油三酯含量的降低[19]。研究表明茯苓酸能通過(guò)抑制磷酸酶A2(PLA2) 、白三烯B4 分泌,降低彈性蛋白酶和COX-2的活性實(shí)現(xiàn)抗炎作用[20]。

靶點(diǎn)方面，F(xiàn)B治療NAFLD的主要核心靶點(diǎn)為TNF、MAPK3、PIK3CA、NR1H3，這些靶點(diǎn)以直接或者間接方式涉及NAFLD的發(fā)病機(jī)制。有研究表明TNF的亞型TNF-α是一種重要的促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)NF-κB通路的激活[21，22]；TNF也能激活NLRP3炎癥體，這些都會(huì)增強(qiáng)促炎效應(yīng)而導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。自噬是一種細(xì)胞吞噬并降解受損細(xì)胞質(zhì)成分的細(xì)胞過(guò)程，MAPK3可通過(guò)刺激ATG7依賴性自噬，從而在肝脂質(zhì)代謝中發(fā)揮有益作用[23]。研究表明NR1H3可以通過(guò)促進(jìn)膽固醇外排和抑制炎性基因，對(duì)細(xì)胞膽固醇加載過(guò)程中產(chǎn)生的氧甾醇產(chǎn)生反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎作用[24]。

此外，藥對(duì)治療NAFLD涉及多條復(fù)雜的信號(hào)通路。其中，PPAR信號(hào)通路的PPARa亞型與肝臟組織的脂肪酸代謝密切相關(guān)，其配體激活的PPARa可以通過(guò)干擾AP-1和NFjB信號(hào)通路抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6基因表達(dá)[25]；另外有研究表明PPARa激活可改善NASH動(dòng)物模型的脂肪變性、炎癥和纖維化[26]。T細(xì)胞受體信號(hào)通道能激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化，而后者在控制自身耐受和炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[27]。HIF-1信號(hào)通道可通過(guò)抑制中鏈和長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶從而抑制脂肪酸的分解代謝[28]。另外，HIF1α水平升高可能會(huì)增強(qiáng)脂肪細(xì)胞中的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)葡萄糖向脂肪酸和甘油三酸酯的轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致肥胖[29]。故推測(cè)茯苓-白術(shù)藥對(duì)可能通過(guò)抑制HIF-1信號(hào)通路從而降低脂肪的產(chǎn)生。在NAFLD發(fā)病機(jī)制中，炎癥是連接上游胰島素抵抗/脂肪變性和下游細(xì)胞損傷的中心事件，而NOD樣受體信號(hào)通道中包含多種炎性小體，如NLRP-1、NLRP-3、NLRP-4[30]。飽和的脂肪酸可誘導(dǎo)NLRP3炎癥體的激活，從而導(dǎo)致炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放[31]。故推測(cè)茯苓-白術(shù)藥對(duì)可能抑制了NOD樣受體信號(hào)通道而發(fā)揮抗炎作用。